Ctirad Hofr
LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul
Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce
C7230
FGP – Funkční genomika a proteomika
NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul
Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita
Fluorescenční rezonanční
přenos energie – FRET
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR2
Přenos energie
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR3
Přehled přednášky
1. Původ rezonančního přenosu energie
2. Charakteristické veličiny FRET
3. Aplikace FRET při studiu biomolekul
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR4
1. Přenos excitační energie
• Přenos elektronové energie se uskutečňuje mechanismy zářivými nebo nezářivými.
• K zářivému (triviálnímu) přenosu energie dochází, když excitovaná molekula donoru emituje
záření, které je následně reabsorbováno molekulou akceptoru.
Dochází k výměně fotonu.
• K excitaci nezářivým přenosem energie (fluorescenční rezonanční přenos energie,
FRET) dochází, když ve směsi molekul dochází k absorpci pouze molekulami donoru, avšak
konečným výsledkem jsou excitované molekuly akceptoru, které budící záření neabsorbují.
Při tomto přenosu energie nedochází k emisi světla donorem.
Nedochází k výměně fotonu!
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR5
K čemu lze použít rezonanční přenos energie?
• Konformační změny
• Vazba ligandu a receptoru
• Štěpení proteinu/DNA
• Fúze membrán
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR6
Rezonanční přenos energie
• Analogie s přenosem energie mezi ladičkami.
• V případě molekul dochází k přenosu energie díky dipól-dipólovým interakcím.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR7
Dipólové momenty přechodu
• Dipólový moment přechodu je kvantově mechanická záležitost.
Není skutečným dipólovým momentem. Je dán okamžitým stavem elektronového obalu
molekuly. Velikost dipólového momentu přechodu udává schopnost daného stavu molekuly
absorbovat nebo emitovat světlo. Směr dipólového momentu přechodu udává směr,
ve kterém je světlo molekulou nejlépe absorbováno nebo emitováno.
• Molekuly přednostně absorbují záření, jehož elektrická složka kmitá ve stejné rovině jako je
absorpční dipólový moment přechodu elektronu do vyšší energetické hladiny.
• Molekuly přednostně emitují záření ve stejné rovině jako je emisní dipólový moment
přechodu elektronu do nižší energetické hladiny.
Absorpce
Emise
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR8
Interakce dipólových momentů přechodu
Donoru a Akceptoru
Donor Akceptor
Absorpce donoru
Emise donoru
Absorpce akceptoru
Emise akceptoru
Abs
l(nm)
Fluorescence
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR9
FRET - nezářivý přenos energie
• V přítomnosti vhodného akceptoru může
donor přenést energii excitovaného stavu
přímo na akceptor bez vyzáření fotonu.
• Takto excitovaný akceptor až teprve pak
vyzáří energii, kterou původně absorboval
donor.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR10
Fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET)
• Rezonanční přenos energie lze charakterizovat rychlostní konstantou (kDA), která vyjadřuje
pravděpodobnost přenosu.
• Určující složkou je dipól-dipólový přenos energie, pro nějž byl odvozen Försterův vzorec
(v případě slabé vazby, kdy vzájemné interakce donoru a akceptoru neovlivní optická
spektra) v této formě:
tD – doba dohasínání fluorescence donoru,
R0 – vzdálenost ve které je pravděpodobnost přenosu energie poloviční tj. rovna pravděpodobnosti vnitřní deaktivace
vzbuzeného stavu molekuly,
r – vzdálenost mezi donorem a akceptorem.
• Rezonanční přenos energie je silně závislý na vzdálenosti donoru a akceptoru.
6
01








=
r
R
k
D
DA
t
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR11
Interakce dipól-indukovaný dipól
• Polární molekula s dipólovým momentem
m1 může indukovat dipólový moment
v polarizovatelné molekule.
• Indukovaný dipól interaguje
s permanentním dipólem první molekuly a
dochází k vzájemnému přitahování.
• Indukovaný dipól (modré šipky) následuje
změny v orientaci permanentního dipólu
(žluté šipky). 6
0
2
2
1
r
V

m
−=
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR12
Účinnost přenosu E
• Je dána poměrným množstvím fotonů, které jsou absorbovány donorem a následně vyzářeny
akceptorem.
• Měří se určením relativní intenzity fluorescence donoru za nepřítomnosti (FD) a za
přítomnosti akceptoru (FDA).
• Rychle klesá se 6 mocninou vzdálenosti!
D
DA
F
F
E −=1
)(
)(
1
rk
rk
E
DAD
DA
+
= −
t 66
0
6
0
rR
R
E
+
=
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR13
Popis hybridizace molekul DNA za použití FRET
0
0.5
1
1.5
500 550 600 650
Emise l [nm]
normal.intenzita
fluorescence
• Při hybridizaci DNA se dostávají
Donor a Akceptor do těsné
blízkosti.
• Změna spektra ukazuje na FRET a
je důkazem hybridizace DNA.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR14
R0 Försterova vzdálenost
• R0 je vzdálenost donoru a akceptoru, při které je účinnost přenosu E 50%.
• Velikost R0 je obvykle 2 – 6 nm, což je srovnatelné s velikostí biologických molekul.
• Závislost účinnosti přenosu E na vzdálenosti r je nejvýraznější (nejrychleji se mění)
v případě, že vzdálenost donoru a akceptoru je blízká R0.
• R0 udává, do jaké střední vzdálenosti může daný pár donor-akceptor komunikovat –
je to charakteristika páru fluoroforů.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR15
Závislost účinnosti přenosu na r
r = 0.1 x R0
r = 0.5 x R0
r = 2.0 x R0
r = 4.0 x R0
66
0
6
0
rR
R
E
+
=
Rozsah vhodný pro měření: 0.5 - 2 R0.
• E = 0.999999
• E = 0.984615
• E = 0.015384
• E = 0.000244
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR16
Na čem závisí R0?
• Na orientaci dipólových momentů přechodu pro emisi donoru a absorbci akceptoru (pro faktor
k2 se používá průměrná hodnota 2/3).
• Na optických vlastnostech prostředí (index lomu vody nH20= 1.33).
• Na kvantovém výtěžku donoru QD.
• Na míře překryvu J (l) emisního spektra donoru a absorpčního spektra akceptoru.
( )
o6/142
0 A)(v)(211.0 lk JQnR D
−
=
Abs
l(nm)
Fluorescence
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR17
Závislost orientačního faktoru k2 na orientaci
dipólových momentů přechodu
• Pro náhodné uspořádání dipólových
momentů přechodu se běžně používá
hodnota k2 = 2/3.
• V případě, že jsou dipólové momenty
přechodu kolmé k2= 0.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR18
Závislost R0 na spektrálním překryvu
• Přenos je větší při větším překryvu spekter a tím je také delší R0.
• Závislost je velmi pozvolná, není lineární, ale závisí na šesté odmocnině plochy překryvu.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR19
Měření vzdálenosti pomocí FRET
• Melitin je nejdůležitější součást včelího jedu (poškozuje buněčné struktury, rozkládá bílé a
červené krvinky, způsobuje odumírání buňky) při léčbě se využívá jeho protizánětlivých účinků.
• Melitin je složen z 26 AK Tryptofan v poloze 19 byl donorem, Dansyl na N konci byl
akceptorem.
• Po samostatné spektrální charakterizaci melitinu s Trp jako donoru a Dansyl jako akceptoru
byla určena hodnota R0 = 2.36 nm.
• Z míry zhášení je možno určit vzdálenost Trp a Dansylu.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR20
Určení vzdálenosti Trp od N konce melitinu za
použití FRET
• Na základě úbytku intenzity fluorescence za přítomnosti akceptoru je možno určit účinnost
přenosu a odtud vzdálenost donoru (Trp) od akceptoru (na N konci).
• r = 2.44 nm.
D
DA
F
F
E −=1
66
0
6
0
rR
R
E
+
=
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR21
Výhody FRET
• Účinnost přenosu energie nezávisí na prostředí mezi donorem a akceptorem.
• Měření poměru intenzit umožňuje použití FRET analýz nezávisle na koncentraci.
• Pro většinu aplikací není nutno znát R0.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR22
FRET umožňuje rozlišit mezi více variantami
uspořádání flexibilních proteinů
• apoA-I protein reguluje metabolismus cholesterolu.
• apo A-I se váže do lipidové membrány.
• byla navržena dvě možná uspořádání proteinů
v membráně.
• kvůli flexibilitě lipidů není možno použít strukturní
metody.
• jeden z řetězců apoA-I proteinů byl naznačen
fluoresceinem (Donor)
a druhý tetrametylrodaminem (Akceptor).
• Nejdříve bylo změřeno emisní spektrum samotného
donoru na jednom řetězci ApoA-I.
• Po přidání druhého řetězce s akceptorem byl sledován
úbytek intenzity fluorescence donoru.
• Docházelo k výraznému rezonančnímu přenosu energie.
• To dokázalo relativně malou vzdálenost mezi donorem a
akceptorem.
• Bylo potvrzeno pásové uspořádáni ApoA-I.
• http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la402727a
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR23
Sledování denaturačních změn
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR24
FRET mezi CFP a YFP
https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR25
Zhášení FRET fotovybělováním
https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR27
Skládání proteinů in vivo
• ApoE4 je spojen s Alzheimerovou nemocí a
váže se na nervové buňky.
• ApoE3 má podobnou sekvenci AK,
ale na nervové buňky se neváže.
• Bylo navrženo, že vazebná schopnost
k nervovým buňkám souvisí s různým
uspořádáním domén ApoE proteinů.
• Pro ověření byly v nervových buňkách
transfekovány ApoE konstrukty.
• FRET analýza ukázala, že ApoE4
v konformaci se spojenými doménami se
váže na nervové buňky, zatímco ApoE3
nemá své domény ve vzájemné blízkosti a na
nervové buňky se neváže.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR28
FRET senzory
• Detekce estrogenu
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR29
Sledování fosforilace proteinů
• Sledování zpracování inzulínu
Fluorescence
• Receptorem inzulínu je tyrozinkináza, která
fosforyluje tyrozin v rozpoznávané sekvenci,
která je následně vázána SH2 doménou
dalšího proteinu.
• Tato vazba způsobuje přiblížení CFP a YFP a
indukuje FRET.
• Proteinový konstrukt byl exprimován
v buňkách.
• Po vystavení buněk 100 nM inzulínu došlo k
postupnému zvýšení přenosu energie.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR30
Sledování morfologických změn buněk
• V zelené oblasti FRET se zpracovává nejvíce GTP a v tomto směru se také buňka pohybuje.
Změna v intenzitě fluorescence (vpravo) se neprojevuje ve FRET obrazu (vlevo)
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR31
Kombinace FRET a časově rozlišené mikroskopie
• FRET-FLIM „mikroskopie“ byla použita k charakterizaci tvorby intranukleárních dimerů
transkripčního faktoru C/EBPα v živých buňkách hypofýzy GHFT1-5.
H. Wallrabe and A. Periasamy, Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy,
Current Opinion in Biotechnology, Volume 16, Issue 1, Analytical biotechnology, 2005, Pages
19-27.
D
DA
E
t
t
−= 1
Kratší čas dohasínání donoru
při FRET.
Normální – delší čas
dohasínání při fotovybělení
akceptoru FRET.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR32
Štěpení ribozymem
• Po vazbě ribozymu na substrát dochází
k přiblížení části A a B, což se projeví
zvýšením FRET.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR33
Detekce přítomnosti c-fos mRNA
• c-fos mRNA je transkripčním faktorem, který
ovlivňuje buněčný cyklus a diferenciaci.
• FRET sondy byly použity pro zjištění
přítomnosti c-fos mRNA v buněčné kultuře.
• Byla prokázána přítomnost c-fos mRNA u
aktivovaných buněk (vlevo).
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR34
Membránová fůze
• Jednotlivé membrány obsahují donor nebo
akceptor.
• V případě splynutí membrán pozorujeme
FRET.
Využití FRETu pro vizualizaci fúze lipidových dvojvrstev s vezikuly:
Intermediáty zachycené pomocí vysokorychlostní mikrofluorescenční spektroskopie.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR35
Aplikace FRETu v mikroskopii
Lei, G and MacDonald, R.C., Biophys J. 2003
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR36
Praktické poznámky při měření FRET
•FD,
•FDA,
•účinnost E,
•Angström.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR37
Literatura
• Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business
Media, New York, 2006.
• Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH
http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm
• Grafika z knihy Principles o Fluorescence pro účely této přednášky laskavě poskytnul Prof. J.
R. Lakowitz
• Animace FRET v plném rozlišení laskavě poskytnul
Dr. Joseph T. E. Roland
Poděkování
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR38
Vlastní fluorescence proteinů