1 PŘENOS KYSLÍKU V BIOTECHNOLOGII Při aerobních procesech katalyzovaných buňkami nebo enzymy je nutné zabezpečit dostatečný přívod kyslíku do fermentačního média bioreaktoru. U některých organismů i krátkodobá limitace metabolismu kyslíkem může způsobit nevratné změny v respiračním systému. Každopádně dochází ke snížení rychlosti tvorby produktů (a růstu biomasy v kulturách organismů). Limitace kyslíkem má proto negativní nejen biochemické, ale i ekonomické dopady. Samotný proces aerace zvyšuje ekonomickou náročnost bioprocesu z důvodu zvýšené spotřeby energie, zejména ve větším měřítku. Výsledkem proto musí být průnik takových podmínek dodávky a biochemické spotřeby kyslíku, aby se aplikovala co nejnižší intenzita aerace, ale přitom se vyloučila biochemická limitace kyslíkem. Ukazatel účinnosti systému vzdušnění a míchání (viz kLa níže) je jedním z nejdůležitějších parametrů bioreaktoru v laboratorním i provozním měřítku a jeho určení je náplní této úlohy. Úvod Limitace metabolismu kyslíkem Důvody limitace respirace a růstu buněk kyslíkem vyplývají z následujících vztahů. Při aplikaci kinetiky Michaelise a Mentenové platí: Q = Qm c/(Km + c) (1) Q celková (objemová) rychlost spotřeby kyslíku (rychlost respirace, Qm je maximální hodnota) Km Michaelisova konstanta pro kyslík (v případě celých buněk jde o zdánlivou hodnotu) c koncentrace kyslíku v kapalném médiu. V uzavřeném systému (bez dodávky kyslíku) lze určit Q z poklesu koncentrace kyslíku v čase (t): Q = - dc/dt (2) Souvislost kyslíkem nelimitované rychlosti respirace (Q) a rychlosti růstu (dX/dt) lze zjednodušeně vyjádřit: Q = (1/YX/O)(dX/dt) (3) YX/O výtěžek biomasy na kyslík (jaké množství biomasy vyroste na dodaný kyslík) X koncentrace biomasy t čas Uvedené vztahy demonstrují úzký vztah mezi koncentrací kyslíku a respirační (příp. růstovou) aktivitou organismů. 2 Objemový koeficient přestupu kyslíku (kLa) Pro rychlost přestupu kyslíku z plynné do kapalné fáze lze odvodit následující vztah: dc/dt = kLa(cs-c) (4) c aktuální koncentrace kyslíku v kapalině cs nasycená (rovnovážná) koncentrace kyslíku v kapalině kLa objemový koeficient přestupu kyslíku z plynu do kapaliny kLa představuje součin koeficientu přestupu kyslíku z fázového rozhraní do kapalné fáze (kL) a specifického povrchu mezifázového rozhraní (a). Je konstantní pouze pro konstantní fyzikální podmínky aerace. Hodnota kLa je nejen ukazatelem účinnosti aeračního systému bioreaktoru, ale i důležitým parametrem pro přenos podmínek aerace do většího měřítka. Jeho hodnota je proto důležitý ukazatel podmínek aerace v laboratorním i průmyslovém měřítku. Je-li v aerovaném systému kultura respirujících organismů (příp. suspenze enzymů spotřebovávajících kyslík), rovnice (4) přejde na tvar: dc/dt = kLa(cs - c) - Q (5) což znamená, že rychlost změny koncentrace kyslíku se rovná rychlosti dodávky kyslíku snížené o rychlost spotřeby kyslíku. Určení kLa Z více možností zde uvedeme dva často používané způsoby, jež budou předmětem experimentální práce. 1. Vytěsňovací metoda Jde o postup určení kLa bez přítomnosti organismů nebo enzymů, takže se projeví pouze konstrukční vlastnosti bioreaktoru. V kapalině bez respirujících organismů se vytěsní kyslík inertním plynem a poté se za definovaných podmínek aerace registruje sycení média kyslíkem. Po integraci rovnice (4) (v hranicích 0 - t, c0 - c) platí: ln(cs - c) = ln(cs - c0) - kLa.t (6) Hodnoty cs za dané teploty a tlaku jsou pro vodu známé. Po vynesení rovnice (6) získáme lineární regresí kLa jako směrnici. Za přítomnosti organismů lze určit kLa vytěsňovací metodou po úplné inhibici respirace organismu (Q = 0 v rovnici (5)). 3 2. Rovnovážná metoda Tato metoda má za cíl určení kLa v bioreaktoru za reálných podmínek kultivace nebo produkce, čili za přítomnosti organismů nebo enzymů spotřebovávajících kyslík. Po zjištění rychlosti spotřeby kyslíku v uzavřené nádobě podle vztahu (2) se po otevření nádoby a tím obnovení vzdušné aerace určí kLa z podmínky ustáleného stavu, kdy dc/dt = 0. Ustálí se koncentrace kyslíku c' jako výsledek rovnováhy mezi rychlostmi dodávky a spotřeby kyslíku. Z rovnice (5) za ustáleného stavu plyne: kLa = Q/(cs - c') (7) c' je ustálená koncentrace kyslíku. Výpočet je tedy jednoduchý, navození ustáleného stavu však může trvat delší dobu. Q lze změřit v krátkém čase v uzavřeném systému, hodnotu cs lze aproximovat známými hodnotami pro destilovanou vodu. Pro charakterizaci aerační účinnosti samotného bioreaktoru a její srovnání s dalšími bioreaktory, jakož i pro optimalizaci míchání a vzdušnění, je výhodné určení kLa vytěsňovací metodou. Pro určení kLa v reálných kultivačních nebo produkčních podmínkách může být vhodnější rovnovážná metoda. Pro vyjádření minimální intenzity aerace zabezpečující kyslíkem nelimitovaný reálný (bio)proces v ustáleném stavu lze rovnici (7) použít pro charakterizaci minimální hodnoty kritického koeficientu kLa: (kLa)crit = Q/(cs - ccrit) (8) kde ccrit představuje dolní kritickou koncentraci kyslíku za ustáleného stavu, při které ještě nedochází k limitaci kyslíkem. Koncentrace kyslíku v bioreaktoru by se proto měla dlouhodobě udržovat v užším intervalu nad ccrit, kdy bude optimalizovaná biochemická i ekonomická náročnost procesu. Cíl práce Stanovení objemového koeficientu přestupu kyslíku jako indikátoru účinnosti aerace. Vybavení Jako model bioreaktoru, pouze pro účely této úlohy, poslouží jeho zjednodušená zmenšená forma. Detekce rozpuštěného kyslíku a reakční nádobka: amperometrický detektor, termostat, magneticky míchaná termostatovaná měřicí nádobka (simulace bioreaktoru) s kyslíkovou elektrodou, použitelná v otevřeném i uzavřeném systému, zdroj dusíku (pro vytěsňovací metodu), kvasinky Saccharomyces cerevisiae (jako univerzální příklad aplikace organismů). Dále ukázka laboratorních bioreaktorů a souvislosti se simulací podmínek v úloze. 4 Pracovní postup Kalibrace kyslíkové elektrody Nulová hodnota koncentrace kyslíku se nastaví pomocí roztoku siřičitanu sodného, nasycená (rovnovážná) koncentrace kyslíku pomocí destilované vody za definované (pracovní) teploty. V měřicí nádobce s kyslíkovou elektrodou se provzdušňuje destilovaná voda, po ustálení záznamu koncentrace kyslíku se nastaví její tabelovaná hodnota (cs) pro danou teplotu a atmosférický tlak. Určení kLa vytěsňovací metodou Destilovaná voda bez jakýkoli organismů nebo enzymů se v bioreaktoru zbaví kyslíku probubláváním dusíkem. Jakmile se koncentrace kyslíku blíží k nule, přeruší se přívod dusíku a za daných podmínek aerace (konstantní teplota, objem a otáčky míchadla) se voda sytí vzdušným kyslíkem. Registrací hodnot koncentrace rozpuštěného kyslíku získáme záznam odpovídající rovnici (4). Při známé hodnotě cs se určí z rovnice (6) kLa lineární regresí. Určení kLa rovnovážnou metodou Reálné podmínky bioprocesu s aerobní biomasou. 0,2 g pekařského droždí se rozsuspenduje v 50 ml vytemperované destilované vody a suspenze se přenese do vytemperované měřící nádobky. V uzavřené nádobce změříme rychlost spotřeby kyslíku (Q) jako směrnici lineárního časového poklesu koncentrace kyslíku podle rovnice (2). Poté nádobku otevřeme a ve stejném objemu kultury jako byl objem vody u vytěsňovací metody vyčkáme ustáleného stavu a odečteme c'. Hodnotu kLa určíme z rovnice (7). Alternativním úkolem je využití hodnoty kLa z vytěsňovací metody a určení teoretické hodnoty ustálené koncentrace kyslíku c' ze vztahu (7). Závěr Vypracování protokolu demonstrujícího lineární regresi a určení kLa vytěsňovací metodou a vyhodnocení dat z rovnovážné metody.