M U U I | R E C E T O X SCI Vliv znečištění na organismy Klára Hilscherová Centrum RECETOX Prírodovedecká fakulta Masarykova universita, Brno hilscľierova@recetox. muni. cz Environmentálni osud a účinky polutantu Toxikologie/EkotOXikologie - studium škodlivých účinků chemických látek na živé organismy: Environmentálni toxikologie na PřF MU od mechanismů k porozumění účinkům v lidské populaci a v prostředí N ^ , N(CH2CH2CI)2 / Np-0 ,NH Studie chemických látek & vzorků z prostředí Chemické látky -> Životní prostředí -> Lidské zdraví Směsi & terénní & epidemiologické studie Eko-Toxikologie in vivo Akutní a chronické biotesty Modely vývojové a reprodukční toxicity Biomarkery subletálních účinků Toxikologie in vitro Mechanismy Lidské/savčí//rybí buňky, reportérové buněčné linie, pokročilé buněčné systémy Propojení env. chemie & toxikologie & epidemiologie Znečištění - zdravotní a ekologická rizika ? ./jí Polutanty Hodnocení eko - toxicity Škodlivé účinky? Jaké poškození? Na jakých dávkách/koncentracích? Hodnocení rizik Stanovení bezpečných koncentrací Environmentálni toxikologie Vzduch Kosmetické prípravky FFFFFFFF o0o Farmaka Akutní účinky Chronická onemocnění > Autoimunitní onemocnění > Poruchy plodnosti > Neurodegenerativní a vývojové poruchy > Chronické nemoci dýchacího traktu > Rakovina Toxické sinice Upper Saranac River, USA Bedetti Lake, Argentina Neuse River, USA Baltské moře, Evropa Nové Mlýny, Česko Žluté moře, Čína Lake Mokoan, Austrálie Jihoafrická republika Masový rozvoj sinic - globální problém CYANOTOXINY nárůst koncentrace C02 v atmosféře, nárůst UV radiace sinice (cyanobaktéri eutrofizace vodních ekosystémů masový rozvoj sinic (vodní květy) CYANOTOXINY ! LIDSKÉ AKTIVITY! spalování zemědělství, odpadní vody SINICE (CYANOBAKTERlE) masový rozvoj sinic = závažný problém: > negativní vliv na chemismus vody (kyslík, pH..), produkce pachů, pachutí > narušení kyslíkového režimu (ranní anoxické zóny) - bakteriální rozklad biomasy sinic -náhlé vyčerpání kyslíku z vody >produkce CYANOTOXINŮ - látky toxické či jinak biologicky aktivní • komplikace při využívání nádrží (vodárenství, rekreace, chov ryb) • nebezpečí pro ostatní živé organismy - vliv na akvatické bakterie, zooplankton, ryby a obojživelníky, na chování zvířat, na vodní rostliny - menší prostupnost světla pro fotosyntézu Vliv na člověka - z pitné vody, z rekreační expozice - alergie - vyrážky, zánět spojivek, bronchitída - střevní a žaludeční potíže, bolesti hlavy, jaterní problémy Endokrinní disrupce (ED) v prostředí a v lidské populaci narušení hormonální rovnováhy organismů -negativní následky pro celkovou homeostáza reprodukční, vývojové a behaviorální funkce ^jBjxnm^jjk - 2DJ2 ' AkeBcrgrnaMefr^dJJ^ritlel.SusariJoMing, Thomas Zwller Endokrinní disruptory (EDCs) látky nebo směsi, které mají schopnost způsobit endokrinní disrupci u zasaženého organismu, jeho potomků nebo (sub)populací přímo nebo nepřímo ovlivňují hormonální systém K čemu je endokrinní systém? Endokrinní Funkce Udržování vnitřní rovnováhy Podpora růstu buněk Koordinace vývoje Koordinace reprodukce Zprostředkování odpovědi na vnější impulsy ES je spolu s CNS hlavní řídící systém organismu Endokrinní disruptory (EDCs) > Prírodní i syntetické látky > Široké spektrum látek, persistentní a „pseudo"- persistentní > Identifikováno cca 1000 potenciálních EDC (The Endocrine Disruption Exchange) Průmyslové chemikálie a vedlejší produkty (PCBs, PCDD/Fs, PAHs) Pesticidy (herbicidy, insecticidy, atraziny, DDT a jeho metabolity ...) ■ ■ Změkčovače plastů (alkylfenoly, bisfenol A, ftaláty) Rostlinné metabolity, fytoestrogeny, mykoestrogeny Farmaceutika, syntetické steroidy (antikoncepce,...) Látky z detergentů, čistících prostředků, kosmetických přípravků (cyklosiloxany, parabeny, triclosan) Ochranné barvy (organocíny) Endokrinní systém - systém žláz s vnitřní sekrecí Hormonální regulace biologických procesů = společná charakteristika živočišného kmene - projevy ED u obratlovců i bezobratlých íišinka - epifyzy O" 6^ Hypothalamus - podhrbolí Hypofýza - podvěsek mozkový Tyroidea - ítitná žlá;a - ítľtnke ■ Thymus - brzlík - Pakreas - slinivka břišní Nadledviny giandulse suprarenales Testes - varlata Ovária - vaječníky - estradiol, testosteron - glukokortikoidy, mineralokortikoidy, thyroidy - gonadotropin, růstový hormon - melatonin, calcitonin, insulin ... PTTH Prothoracic gland Ecdysone Brain Corpora cardiaca Corpora allata Juvenile Hormone II Larva Pupa Adult - neuropeptidy - ekdysteroidy, juvenilm hormony - pohlavní steroidy (androgen, estradiol, progesteron) ;" "= ľ "■= Hart Y-nrgan Sensory poreX-organ -janglionicX-organ Sinus gland Cerebral gad;]ion (brain} Cňcumoasofriageal MHHiectJves Pastcammissural organs :í =-:crsg=a :"3;- = -Pefici-'JiaJ organ -Testis -Vas defetis Androgenic gland Last tiioractc gartgfcn Rfst abomJnai ga ngSoii epifyza ■ Hypofýza hypothalamus Endokrinní žlázy ryb - schema srdce Chromafinní tkáň ledviny ledvin (renin, angiotensin) Urofýza interrenální tkáň ledvin gonády ultimobranchiální Pankreatické tělíska ostrůvky Štítná žláza Gastro-intestinálni trakt Stanniusova tělíska Důležitá fakta o účincích ED • Účinky se projeví po expozici i velmi malými dávkami látek • Účinky jsou velmi ovlivňovány načasováním expozice - stupněm vývoje, na kterém byl jedinec exponován Účinky odlišné během doby života organismu (fetus vs. embryo vs. dospělec) Účinky se pravděpodobněji projeví v mláďatech, než v dospělcích Účinky často opožděné - ke kompletním projevům nemusí dojít až do dospělosti CqunterThihk \± IT K kutu"? Následky ve volně žijících živočiších Změněný poměr pohlaví, intersex Snížená plodnost, kvalita a kvantita spermatu Malformace pohlavních orgánů Snížená líhnivost Snížené přežívání mláďat Narušení funkce imunitního systému Abnormální funkce a vzhled štítné žlázy Změny chování Vymizení populací SEX CHANGE TROUT IN PIU. S^OCK! . y\\\ \'-'v By MICHELLE DANIEL (idiny biologist 'liiisi chemical b Trans-sexual trout swallow the pill from sewage outfall direct link. between fish posed to a sewage outfall ; malt fish becmning to prodi 1 nt- ..... The male trout produce c sins normally found only ->ntiiro females. These prate i„-s t ivV;„"(- ^',1S 'n sonic of , Scientists biím ,;,„ wi - Ä'ľ '*>^''-ni;!', ;' .. by ťetcť Prune, of Tr«cr> Org, Fish. Invest!. PASS S^ä^Ä""11'»•'»» íínssrŕgr FI,1"r « «lUüiTthft Kation«^íifíííí'í? ' eř.:.e. ■ -l tüctt "l>r«lucM»« V™ AAA *• U. n-mt Ire« LI. (taSäíSííL1™* ;"úl' call for ■ „7." Vliv na populace => dopady v ekosystémech Projevy u volně žijících živočichů - příklady Malformace - změny v pohlavních orgánech —> poruchy reprodukce: Hemi- a minipenis aligátorů - Jezero Apopka na Floridě Demasculinizace - výrazně zmenšené sekundární pohlavní znaky (1/3 až 1/2) proti normálním zdravým samcům - mláďata buď samice s normálními vaječníky nebo samci s intersexem (žádní normální samci) a byla u nich zvýšená mortalita - snížená líhnivost v populaci - způsobeno únikem DDT IMPOSEX u předožábrých plžů - tvorba penisu a chámovodu u samic - nepřímý xeno-androgenní efekt organocínů - lokální vymizení populací měkkýšů Maskulinizace samic ryb - pod výpustěmi z papíren - v tocích pod farmami živočišné výroby Feminizace samců ryb (ovotestes) v povrchových vodách znečištěných odpadními vodami v severní Americe a v Evropě 'Vmbeginning to worry about Bob' Ekosystémová studie - Kanada 2000-2005 Estrogen (17a-ethynylestradiol) aplikován do jezera - cílová konc. 5 ng/L (v povrchových vodách v Evropě 0-23ng/L) - poločas života 12 dní - aplikován 3x týdně po 21 týdnů (jaro-podzim) 1. rok - nejvýznamnější účinky u ryb s kratší dobou života, které se třou jen 1x za sezonu (střevle) - zvýšení hladin samiččích proteinů 9000x u samců, zpoždění vývoje pohlavních orgánů 2.,3. rok - výskyt intersexu - vajíčka v samčích gonádách, pokles reprodukce, téměř žádná nová generace střevlí - kolaps populace - podobné účinky u tloušťů 3. rok - pokles populací a méně mladých i u dravých ryb - pstruha jezerního - především díky nedostatku potravy => OVLIVNĚNÍ CELÉHO EKOSYSTÉMU Po ukončení aplikace - za 2 roky - znovubudování populací střevlí a tloušťů, zvýšení populačních hustot pstruha Organocíny 1! Stabilizátory plastů Biocidy: Fungicidy Insekticidy Baktericidy Nátěry proti zarůstání a nánosům na trupech lodí (Anti-fouling paints) TBT = tributylcín Pomalá biodegradace Akumulace ve vodě a sedimentu Bioakumulace TBT používán na lodě od 60. let První efekty na měkkýších - 70. léta Zákaz používání na nátěry lodí v EU - 2003 Cholesterol (27 carbons) P450 aromatase HCr ----- HCfr Pregnenolone (2.1 cartons) Dehydroepiuidrosterone "EHEA" (19 cartons) Androstenedione (19 carbons) Cortisol (21 carbons) 1 Progesterone - Glucocorticoid - I £ 1 carbons Corticosterone (21 carbons) - Glucocorticoid - 21 carbons) S^irwralcorticoid - IMPOSEX u předožábrých plžů Důsledek: lokální vymizení populací měkkýšů Vlivy v lidské populaci? poruchy reprodukce, pohlavního vývoje abnormality či onemocnění pohlavních orgánů změny poměru pohlaví poruchy imunity narušení vývoje nervové soustavy snížené kognitivní schopnosti metabolické poruchy obezita hormonálně podmíněné nádory poruchy funkce štítné žlázy Cancers of the breast, prostate, and thyroid gland Learning disabilities Fertility issues Birth defects RICK SMITH / BRUCE LOURIE I Důvody a indikace účinků v lidské populaci SLOW DEATH BY RUBBER DUCK o Nárůst výskytu endokrinních onemocnění a poruch souvisejících s endokrinním systémem u lidí o Pozorované účinky mohou být vysvětleny endokrinním mechanismem působení o Identifikace schopnosti chemických látek narušovat endokrinní (hormonální) regulaci v laboratorních studiích o Endokrinní účinky pozorované u volně žijících živočichů o Zvýšený počet chemických látek s vlastnostmi narušujícími endokrinní funkci, nové mechanismy působení; zvýšená zátěž na celém světě o Nedostatečné testování účinků HOW THE TOXIC CHEM ISTRY OF EVERYDAY LIFE AFFECTS OUR HEALTH ~f*ni*M»ralli ■ mpnrt.Mii-an iru!»,«' ■■•jt'lr jiuiftr m .iprxii n( HO Syntetický nesteroidní estrogen užívaný jako perorální kontraceptivum prevence spontánních potratů (40.-70. léta 20.století) OH DES - nejznámější chemická látka ovlivňující fungování ženského reprodukčního systému Zákaz používání DES pro chov drůbeže z důvodu účinků na mužské pracovníky farem Nakonec zákaz použití pro těhotné ženy DES je prokázaný endokrinní disruptor; nejvážnější postižení vyvolává u dcer matek užívajících DES během těhotenství („DES dcery") - 40x větší pravděpodobnost rozvoje vzácného typu rakoviny děložního čípku a pochvy - vyšší pravděpodobnost rozvoje rakoviny prsu u dcer i matek - větší riziko sterility, potratů, mimoděložních těhotenství, předčasných porodů „DES synové"- anomálie ve vývoji pohlavního ústrojí (varlata, nadvarlata) důsledky expozice DES pozorovatelné ještě v další generaci (DES-vnoučata) IUIUNI RECETOX Trendy v oblasti lidského reprodukčního zdraví snížená kvalita spermatu (snížené počty, pohyblivost, změna morfologie spermií) zvýšená četnost abnormalit mužského reprodukčního traktu změna poměru pohlaví (méně chlapečků) předčasný vvvoi prsů 150 c I 100 8 50 <1> D. l/l v —i—]—i—i—i—i-1—i—i—i—l—i—l—n—I—l—|—1—i—l—i—|—l—i i i | 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 Year (a)Pokles kvantity spermatu, založený na 61 studiích Copyright©2007 Peaison Educfllíar, Inc., publishing benjamin Curnmincj^ Testicular cancer Breasl cancer I 8 o s d 6 o 4> °- 4 Vliv znečištění ovzduší na poměr pohlaví news (o)nature.com The Best in sci&nce journalism 3 > Vysoké hladiny ftalátu v krvi u dívek s předčasným vývojem prsů z Puerto Rico > Souvislost expozice ftaláty s gynekologickými problémy > Zvýšení počtu experimentálních důkazů o ovlivňování endokrinní signalizace chemickými látkami: Začátek puberty Plodnost Menopausa ❖ ❖ ❖ Published online: 21 October 2005; | doi:10.l038/news051017-16 Pollution makes for more girls The stress of dirty air skews sex ratios in Sao Paulo. Erika Check Toxic fumes favour the fairer sex, a group of researchers in Brazil has found. Jorge Hallak and his team at the University of Sao Paulo turned up the surprising result by studying babies born in their city. They divided the metropolis of 17 million people into areas of low, medium and high air pollution, using test results from air-quality monitoring stations. They then studied birth registries of children born from 2001 to 2003. Babies born in highl more likely to be gii © Aiamy The team found that 48.3% of babies were female in the least polluted areas, but 49.3% were female in the dirtiest parts of town. After measuring the ratio of boys to girls born in all the areas, they calculated that 1,180 more babies would have been boys in the polluted areas if they I sex ratios as the cleaner areas. The team reported their findings on 17 October at the Polutanty v prostředí Komplexní směs látek Tisíce komerčně produkovaných látek Další tisíce výrobních a degradačních meziproduktů Dioxins Polychlorinated Biphenyls (PCB) Různé expoziční cesty Dermal Exposure (ex. cosmetics) Flame Retardants Storage of endocrine disruptors Phenols Embryonic Exposure (ex. transfer from mother) Mixtures? Unknown micro pollutants and transformation Inhalation Exposure (ex. plasticisers) Oral Exposure (ex. foods) Transfer of endocrine disruptors to offspring by feeding ❖ ❖ ❖ ❖ ❖ Aktuální Priority Probíhá intenzivní diskuse o revizi evropské legislativy směrem k EDCs Posílení znalostí ohledně expozice a účinků EDCs Zlepšení testování ED vlastností látek, nové mechanismy, nové testy Hodnocení ED potenciálu směsí Identifikace prioritních EDCs Redukce expozice a tudíž náchylnosti k chorobám Metody pro kritické hodnocení prokazatelnosti účinků v populaci Dráhy škodlivého účinku Dráha škodlivého účinku makromolekulami chemická látka -> buněčná odpověď tkáňový účinek účinek na orqán odpověď orqanismu -> populační odpověď interakce Z/ Z/ molekulární iniciační událost -> klíčová událost 1 -> klíčová událost 2 klíčová událost 3 -> škodlivý účinek interakce aktivace genu, vlastnosti s receptory, produkce změněná fyziologie, chemické -> interakce s DNA, -> proteinu, -> narušená homeostáza, látky vazba na proteiny, změna narušení vývoje / funkcí oxidace signálování letalita, narušení vývoje, narušení reprodukce -1- in silico, in chemico, in vitro, ex vivo zmena poměru pohlaví, méně potomstva ~1- in vivo J Dráha škodlivého účinku makromolekulami chemická látka -> buněčná odpověď -> tkáňový účinek -> účinek na orgán odpověď organismu populační odpověď interakce i molekulární iniciační -> událost m u r v r m mrv r m mrv r klicova klicova klicova událost 1 událost 2 událost 3 škodlivý účinek interakce aktivace genu, vlastnosti s receptory, produkce změněná fyziologie, chemické -> interakce s DNA, -> proteinu, -> narušená homeostáza, látky vazba na proteiny, změna narušení vývoje / funkcí oxidace signálování letalita, změna narušení vývoje, poměru narušení y pohlaví, reprodukce vyhynutí I in silico, in chemico, in vitro, ex vivo ~1 in vivo Vazba na ER f Vitelogenin Játra změna hladin proteinů Gonády tkáňové změny ova-testis | plodnost změny pohlaví změny chování ^ reprodukce zmena poměru pohlaví | potomstva Přístupy na RECETOX Vývoj a aplikace biodetekčních a analytických metod pro studium zatížení a účinků EDCs Analýza vybraných ED látek - v prostředí, v krvi, v moči (GC-MS, HPLC-MS-MS) Syntéza hormonů (1) Transport hormonů (2) Inhibice Stimulace Interakce s receptory (3, 4) „Cross-talk" s jinou signálni dráhou (5) Metabolizace hormónu (6) In vitro a in vivo biodetekční systémy - In vitro buněčné modely pro studium narušení endokrinní regulace - relevantní lidské buněčné modely - In vivo modely narušení hormonální rovnováhy a reprodukce - zejména s ohledem na raný (neuro)vývoj Analýza biomarkerů ED - široké spektrum thyroidních a steroidních hormonů (HPLC-MS-MS, bioanalyzátor) ^ o 6 o 5 1M m £3* « IJ n TV ■.i *^ f i* Endokrinní disrupce Biodetekční přístupy Syntéza hormonů Transport hormonů Inhibice Interakce s receptory Metabolizace hormonů Stimulace Cholesterol CYP11A ^ Pregnenolon 3ß-HSD ^ Progesteron CYP21 ^ 11-Deoxykortikosteron CYP11B1 ^ Korti koste ron CYP11B2 ♦ Aldosteron Zona glomerulosa CYP17 17a-OH-Pregnenolon M, 3ß-HSD CYP17 ^ —► 17a-0H- Progesteron ♦ CYP21 11-Deoxykortizol ^CYP11B1 Kortizol Zona fasciculata CYP17 DHEA ^3ß-HSD CYP17 And rosten-dion 17ß-HSD Testosteron CYP19 17ß-Estradiol Zona reticularis lidská kůra nadledvin - účinky na různých úrovních produkce hormonů modulace genů aktivity enzymů produkované hormony Interakce s jadernými receptory Anti/estroqenita Estrogenní receptor (ER) • vývoj pohlaví, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje proliferaci, diferenciaci, vývoj a homeostázu Anti/androqenita Androgenní receptor (AR) • vývoj pohlaví, samčích pohlavních charakteristik, řízení reprodukce, ovlivňuje růst, spermatogenezi Anti/thyroidní aktivita (TR) Thyroidní receptor (TR) • klíčový pro vývoj ptáků a savců, metamorfózu ryb a obojživelníků, vývoj lidského mozku, plic a dalších orgánů Estrogen nebo xenoestrogen CYTOSOL ERE V Vazba na DNA mENA Luciferáza +- „ Estrogenní účinek" 4- Exprese genů pod kontrolou ER Anti/retinoidní aktivita Receptor kyseliny retinové (RAR) • reguluje růst, morfogenezi, apoptozu a diferenciaci, ovlivňuje nervový a imunitní systém, vidění a embryonální vývoj Vzdušné polutanty • Rada zdroju (doprava, topení,...) • Vzdušné polutanty v plynné a/nebo pevné fázi • Tradičně spojovány s plicními a srdečními chorobami • Nově - vliv na reprodukci, endokrinní systém: - negativní korelace mezi poměrem pohlaví u novorozenců v Sao Paulu a hladinou pevných částic ve vzduchu stejný efekt u hlodavců Figure 2 Particle deposition in respiratory system pokles kvality spermatu u mužů vybírajících mýtné na dálnicích, u dopravních policistů Studované regiony (odběr v letních měsících) - 1 týden (7 x 24 h) - Neratovice (A; 6 lokalit): chemický průmysl - Uherskohradišťsko (B; 8 lokalit): doprava, střední aglomerace, chemický průmysl - Košetice (REF; referenční lokalita): zemědělská oblast bez významnějších zdrojů kontaminace Sledované parametry extraktů z částicové i plynné frakce vzduchu - PAH, PCB, pesticidy - toxicita dioxinového typu, anti/estrogenita, anti/androgenita UNII RECETOX Vzdušné polutanty O) E 1000 100 10 1 0,1 IUl JlJl lum j JUIjJ REF: 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 n 6 7 8 CD O CD 1 0,1 0,01 0,001 1000 100 10 E 1 !> 0,1 0,01 0,001 J jUHIrll F=IEF: 1 2 3 4 rílJUlJl 5 6 1 nil 2 3 4 5 6 7 8 o C particle phase I-1 ■—1 [-/Oil LI IV— p. riJ ľ! n d gas phase nrri iflľľ nnrrrrun Chemické analýzy Sledované polutanty více v plynné fázi Polycyklické aromatické uhlovodíky Polychlorované bifenyly Organochlorové pesticidy Vzdušné polutanty Biotesty ED potenciál v plynné i pevné fázi Toxicita dioxinového typu (Ah R) Antiestrogenita Antiandrogenita Shrnutí a závěry EDC látky přítomny v různých složkách prostředí i v organismech Mají různou chemickou strukturu a působí na velmi nízkých koncentracích -obtížně chemicky stanovitelné Mohou mít závažné důsledky pro volně žijící organismy, neboť přímo narušují reprodukci a tím i „evoluční kondici" Charakterizace znečištění komplexních vzorků z prostředí: Biologický a chemický přístup se doplňují - vhodné kombinovat • Chemická analýza - zastoupení vybraných skupin polutantů • Biotesty - informace o toxickém působení látek a jejich směsí > Aplikovatelné pro různé typy matric (environmentálních směsí) > Biotesty často poukáží na přítomnost dalších bioaktivních látek > Účinkem řízená analýza - identifikace prioritních EDC l/l U l\l I I RECETOX Poděkování • kolegům z centra RECETOX, doktorandům a diplomantům • spolupracovníkům z dalších institucí v ČR i v zahraničí Děkuji za pozornost! http :/www. recetox. m u n i. cz E-mail: hilscherova@recetox.muni.cz MICHIGAN STATE UNIVERSITY HELMHOLTZ ZENTRUM FUR UMWELTFORSCHUNG UFZ s^luti^ns MUNI RECETOX