Manuál k předmětu Obecná ekotoxikologie – cvičení (E5081) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí - RECETOX Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita Brno, Česká Republika 2023 1. Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Zkouška akutní toxicity Zpracováno podle ČSN ISO 6341 Vyučující: marie.smutna@recetox.muni.cz Metoda stanovení akutní toxicity chemických látek, průmyslových odpadních vod a povrchových nebo podzemních vod pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Princip Zkouška je založena na určení koncentrace látky, která za 24 (48) hodin imobilizuje 50 % jedinců Daphnia magna vystavených podmínkám testu. Přístroje a chemikálie - automatická pipeta + špičky - plastová kapátka - testovací destička (30 jamek, objem jamky 10 mL) - kádinky - odměrný válec - chemikálie na přípravu média - chlorid draselný KCl, hydrogenuhličitan sodný NaHCO[3, ]chlorid vápenatý CaCl[2], síran hořečnatý MgSO[4 ] - pozitivní kontrola - dichroman draselný K[2]Cr[2]O[7 ] Podmínky testu - teplota: 20 ± 2 ºC - délka expozice 24hod (48 hod.) - fotoperioda 16h světla/8 h tmy Příprava experimentu a pracovní postup Příprava média Nejprve je třeba připravit dostatečné množství média pro všechny kroky postupu experimentu. Zásobní roztoky: 8,88g CaCl[2 ]se rozpustí v 1L destilované vody 4,93g MgSO[4 ]se rozpustí v 1L destilované vody 2,59g NaHCO[3 ]se rozpustí v 1L destilované vody 0,23g KCl se rozpustí v 1L destilované vody - na 1L média se dávkuje 25 mL z každého zásobního roztoku, do odměrné baňky 1L se nalije část destilované vody, přidají se zásobní roztoky a doplní se destilovaná voda - aerací se roztok nasytí kyslíkem (koncentrace kyslíku by neměla klesnout pod 7 mg/L) a zkontroluje se pH (7,8±0,2) Příprava organismů na test Do experimentu se nasazují jednodenní juvenilové, proto je potřeba 1 den před založením experimentu vyčlenit do speciální nádoby – kádinky (0.5L) s médiem několik gravidních samic. Toto přenesení samic do oddělené nádoby je impulsem k rození mláďat. Příprava koncentrační řady testované látky Ředicí řadu testované látky (5 konc. bodů) připravíme v dostatečném objemu ve skleněných kádinkách. Látku postupně ředíme v médiu a přidáváme-li látku (vzorek) v jiném rozpouštědle než ve vodě, tak je nutné dbát na to, aby ve všech testových variantách byla stejná koncentrace rozpouštědla, maximálně však 0.5% v/v. Z kádinek potom napipetujeme po 10 mL do každé testové jamky v plastové testovací desce dle doporučeného schématu. Na každou koncentraci připadá 5 opakování, přičemž první jamka v řadě slouží jako jamka na oplach. Jako pozitivní kontrola se používá standardní toxikant dichroman draselný Nasazení organismů do testu Do jamky na oplach přeneseme kapátkem 20 jedinců z nádoby s juvenily a poté přenášíme po 5 jedincích do jednotlivých testových jamek. Tímto zabráníme nežádoucímu naředění testované látky při manipulaci s kapátkem. Expozice a vyhodnocení imobilizace Desku s dafniemi necháme exponovat v kultivační laboratoři při teplotě 20 ± 2 ºC a světelném režimu 16h světlo/8h tma. Na konci zkušební doby 24h (48h) se spočítají mobilní jedinci v každé nádobě. Jedinci, kteří nebudou schopni se rozplavat za 15 s po mírném zamíchání roztoku, se považují za imobilizované, i kdyby dosud pohybovali tykadly. Výsledky včetně jakýchkoli anomálií v chování dafnií si zaznamenáme. Vyhodnocení výsledků a výpočty Výsledky zaznamenáme do Excelu a jednoduchým výpočtem určíme % imobilizace v jednotlivých opakováních, odhadneme EC20, EC50, NOEC a LOEC. Platnost zkoušky Zkouška se považuje za platnou, pokud jsou splněny následující podmínky: · Mortalita/Imobilizace v kontrole na konci zkoušky je ≤ 10% · 24h- EC[50 ]pro dichroman draselný je v rozsahu 0.6-2.1 mg/L Akutní dafniový test – protokol Datum založení: Vzorek/testovaná látka: Testované koncentrace: Výsledky: 24h 48h 2. Test klíčivosti semen a inhibice růstu kořene hořčice bílé (Sinapis alba - Brassicaceae) Zkouška akutní toxicity Zpracováno podle OECD Guidline No.208: Terrestrial plants, growth test Vyučující: jiri.novak@recetox.muni.cz Úvod: Ve skleněných Petriho miskách jsou semena hořčice seté umístěna na filtrační papír a exponována 5 mL standardního média s různým ředěním testované látky. Jako negativní kontrola slouží varianta se semeny exponovanými jen čistým médiem. Po ukončení experimentu se stanoví počet vyklíčených semen v kontrolách a v jednotlivých ředěních a u vyklíčených jedinců se vyhodnotí celková délka kořene. Získané výsledky lze využít pro výpočet hodnot IC50 (koncentrace zabraňující vyklíčení u 50 % semen, resp. koncentrace inhibující z 50 % růst kořene). Metodika testu klíčení je standardizována do podoby Guidline OECD (No. 208) a metodického pokynu MŽP ČR pro hodnocení toxicity odpadů a vodných výluhů (Test inhibice růstu kořene Sinapis alba, Vyhl. MŽP ČR 338/1997). Ve standardní podobě se provádí 4 dny (96 hodin). Pro účely cvičení může byla doba expozice modifikována na 72hodin. Materiál a chemikálie - semena hořčice bílé Sinapis alba (ideálně s atestem testu klíčivosti) – 30 min dopředu ponořené v destilované vodě - skleněné Petriho misky o průměru 10 cm, pipety 5 a 10 mL, automatické mikropipety, filtrační papír, vialky pro přípravu ředění testované látky, pinzeta, laboratorní plastiková folie, špičky k pipetám - zásobní roztok standardního kultivačního média Tab. 1: Zásobní roztoky solí pro testy na semenech hořčice bílé Zásobní roztok Chemikálie Koncentrace v zásobním roztoku [g·l^-1] Roztok 1 CaCl[2]·2H[2]O 117,6 Roztok 2 MgSO[4]·7H[2]O 49,3 Roztok 3 NaHCO[3] 25,9 Roztok 4 KCl 2,3 Příprava média: napipetovat 5 ml každého roztoku a doplnit do 1 l destilovanou vodou. Případně upravit pH na 7,6-8. Postup 1 - příprava EXPOZICE: 1) Petriho misky popište jménem, datem, koncentrací testované látky. Do takto připravených Petriho misek připravte a vložte kruhové výseče z filtračního papíru. Test bude proveden v duplikátech - celkem připravte 8 Petriho misek (2x kontrola + 2x 3 ředění vzorku A). 2) Příprava ředění vzorku - připravte následující koncentrace dodaného testovaného vzorku (vzorek A): 0.11% v/v, 0.33% v/v, 1% v/v (do 12 mL standardního média napipetujete potřebný objem testovaného vzorku - změnu celkového objemu zanedbejte) - ředění proveďte v dodaném standardním médiu (roztok solí a základních živin nutných pro klíčení rostlin). 3) Připravené expoziční roztoky dávkujte do Petriho misek - vždy 5 mL / misku - u kontrol použijte 5 mL standardního média bez vzorku - použijte jednu pipetu a postupujte od nejnižší po nejvyšší koncentraci 4) Do každé misky vložte 5 semen hořčice bílé (rozmístěte dostatečně od sebe) 5) Petriho misky překryjte potravinovou folií (zajistí cirkulaci vzduchu a omezí vypařování) a umístěte do temna do inkubační místnosti (pokojová teplota) Postup 2 - vyhodnocení: 1) Po ukončení expozice spočítejte počty nevyklíčených semen na jednotlivých miskách a zapište do tabulky 2) U vyklíčených semen vyhodnoťte délku kořene (s přesností na milimetry) a zapište do tabulky Obsah protokolu: 1) Tabulky s naměřenými hodnotami 2) Tabulky s vypočítanými inhibicemi (pentaplikát, průměr, směrodatná odchylka) 3) Grafy popisující závislost dávka-odpověď (koncentrace látky v logaritmované podobě) 4) Proložení lineární regrese modelu grafy a výpočet hodnot IC[50 ]pro klíčivost a inhibici růstu kořene (Excel) 5) Závěr – shrnutí a zhodnocení výsledků, odpověď na otázky níže PROTOKOL - Cvičení z Obecné ekotoxikologie TEST EKOTOXICITY KLÍČENÍ ROSTLIN: Jména operátorů: Datum založení expozice: Datum hodnocení toxicity: -> délka expozice (počet dní): Testovaný vzorek (koncentrace % v/v) Rostlina číslo Kontrola 0,25% 0,5% 1% Pozn. Celkem semen 10 10 10 10 Počet nevyklíčených Délky kořenů - Miska A 1 2 3 4 5 Délky kořenů - Miska B 1 2 3 4 5 Průměr délky kořenů % kontroly 100 Směrodatná odchylka % inhibice 0 Směrodatná odchylka IC[50] - klíčení (% v/v) IC[50] - růst kořene (% v/v) Otázky do protokolu: 1) Který z hodnocených parametrů je citlivějším ukazatelem toxicity? 2) Jak věrohodné jsou vypočítané hodnoty IC[50]? 3) Jaké množství testované látky způsobí inhibici růstu kořene o 99 %? Je tento výsledek věrohodný?