Epigenetika 10 Genomický imprinting a epigenetické poruchy Obsah • GENOMICKÝ IMPRINTING • ÚLOHA EPIGENETIKY V LIDSKÝCH CHOROBÁCH • METODY Genomický imprinting Genomický imprinting - definice • Pouze ovlivněny některé skupiny genů, které mají maternální nebo paternální expresi • Mnoho genů je umístěno v celých skupinách (ovlivněny specifickými insulátory a lncRNAs) • Nastaveny během vývoje zárodečné linie a diferenciace gamet (úloha DNA methylace, histonových PTMs, lncRNAs, insulátory a vyšší struktura chromatinu) • Nepostradatelné při vývoji a reprodukci (ačkoli pouze samice u savců mohou nést plod, geny nezbytné pro jeho vývoj jsou exprimovány výhradně z paternálních chromozomů=reciproký imprinting, nedochází k partenogenezi) • Reciproký imprinting zajišťuje přiměřený vývin plodu : • paternálně exprimované geny (Peg) podporují pre- i postnatální růst • maternálně exprimované geny (Meg) jsou růstovými supresory Barlow et al. 2014 Non - ekvivalence parentalních genomů a důkaz imprintingu u savců Azim Surani (1984) • Odstranění maternálního nebo paternálního jádra v oplodněném vajíčku a jeho vložení do enokluovaného sekundárního vajíčka vede k androgenezi nebo gynogenezi (obě jsou letální v ranném stádiu) Barlow et al. 2014 Blewit, University of Melbourne Sensitivní období během vývoje savců Odstranění epigenetické informace na imprintovaných lokusech E8.5 – E11.5 Maternální imprinting nastaven postnatálně Paternální imprinting nastaven prenatálně Evoluce genomického imprintingu Hore et al. 2007 • Obecně přijímaná hypotéza původu genomického imprintingu se vztahuje k parentálnímu konfliktu =„výsledek sobeckého zájmu obou rodičů“ • Další teorie nabízí přírozený výběr a koadaptivní evoluci imprintovaných genů pro zlepšení vývoje budoucího jedince, alokaci živin a poporodní péči Struktura imprintovaných oblastí v genomu • IG – soubor imprintovaných genů zahrnující protein kódující mRNA • IG-NC – nekódující RNA (alespoň jedna nebo více) • NI – neimprintované geny • ICE – kontrolní element imprintingu Barlow et al. 2014 Regulace imprintovaných oblastí • Imprintované geny se vyskytují ve shlucích s uniparentální expresí, mající několik genů pro mRNA (IG) a alespoň jednu nekódující RNA (IG-NC) • Imprintovaná genová exprese je regulována in cis, kontrolována imprintovaným kontrolním mechanismem (ICE) • ICE nese epigenetické značky právě po jednom z rodičů Cis mechanismus – model Igf2 Endoderm Barlow et al. 2014 „Insulin growth factor 2“ – iniciace růstu a dělení buněk různých tkání (esenciální v růstu plodu) • Paternálně exprimovaná alela IGF2 nese methylační signál na ICE elementu, který tak neumožňuje vazbu CTCF proteinu a umožňuje, aby enhancer (E) aktivoval expresi Ins2 a Igf2 genůsoučasně, methylace ICE oblasti je rozšířena pro lncRNA (h19-NC) promotor, tvorba lncRNA neprobíhá • Maternální alela nemá methylační signál na ICE oblasti, CTCF protein (obsahující motiv zinkové prstu) se váže na ICE a tvoří insulátor, který brání enhancerům aktivovat expresi genů Ins2 a Igf2 a spouští expresi lncRNA Cis mechanismus – model Igf2r Placenta Barlow et al. 2014 „Insulin growth factor 2 receptor“ – kontrola IGF signální dráhy (odpovědný za transport IGF2 do lyzozymů) • Maternalní ICE element obsahuje methylační signál, umlčující promotor lncRNA (Airn NC), umožňující expresi genů Slc22a3, Slc22a2 a Igf2r • Paternální chromozom nemá methylační signál na ICE elementu, dochází proto k expresi lncRNA, která brání přístupu RNA Pol2 k maternálně exprimovaným alelám a umlčuje Igf2r • Na obou clusterech Igf2 a Igf2r DNA methylace umlčuje expresi lncRNA a má pozitivní vliv na expresi mRNA! Obsah • GENOMICKÝ IMPRINTING • ÚLOHA EPIGENETIKY V LIDSKÝCH CHOROBÁCH • METODY Hlavní epigenetické mechanismy odpovědné za chromatin-asociované vývojové poruchy • Narušení DNA methylace nebo chromatinu na imprintovaných lokusech • Ztráta chromatin-regulujících faktorů vede ke změně struktury chromatinu a deregulaci exprese=zdroj variability a chybný poměrů výsledných proteinů nebo mRNA Monoalelická exprese Změna DNA a/nebo chromatinu=změna exprese MeCP2 – vazba na meCpG, represor i aktivátor Genomový imprinting a uniparentální disomie bialelický gen maternálně exprimovaný paternálně exprimovaný Biparentální kombinace Maternální UDP Paternální UDP Barlow et al. 2014 Každá alela je exprimována pouze jednou! 2x vyšší exprese pouze jedné alely Prader-Willi a Angelman syndrom • Oba syndromy mohou být způsobeny delecí části lokusu, změnou chromatinu nebo kombinací genetických a epigenetických faktorů Zoghbi et al. 2016 Prader-Willi a Angelman syndrom Monoalelická paternální exprese=AS Monoalelická maternální exprese=PWS Zoghbi et al. 2016 UBE3A – gen kódující ubikvitin ligázu, porucha imprintingu vede pouze k expresi v některých oblastech v mozku ATP10A – ATPáza translokujcí fosfatitylserin a fosfatidyllethanolamin SNURF-SNRPN – gen kódující proteiny zahrnuté do sestřihu pre-mRNA SNORD – malé jaderné RNA, sloužící k modifikaci a regulaci jiných nekódujících RNA (ncRNA) MKRN3 – reguluje hladinu hormonů spojených s vývoj pohl. orgánů MAGEL – součást ubikvitin-legačního kompexu NDN gene – funkce v postmitotickém růstu neuronu Základní rozdělení chorob • Porucha monoalelické exprese – genomický imprinting • Prader-Willi syndrom • Angelmanův syndrom • Změna stavu chromatinu • In cis • Syndrom fragilního X chromozomu • FSHD • In trans • Kabukiho syndrom • DNA methylace • Ztráta regulace onkogen aktivujících genů • Methylace tumorsupresivních genů Přehled chorob související s genomickým imprintingem Přehled chorob související se změnou chromatinu in trans Vals et al. 2014 Přehled chorob související se změnou chromatinu in cis Syndrom fragilního X (Martin-Bell syndrom) • Normální X má 6-60 tripletů CGG (45-55 šedá oblasti, potenciálně nestabilní) v 5'UTR genu FMR1 (CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)9 • FMR1 gen je důležitý při vývoji mozkové tkáně, plná porucha se projeví tedy zejména mentální retardací, autismem a změnou v obličejové části (velké uši, protáhlý obličej) • Kauzální mutace je zmnožení počtu a methylace FMR1 • Muži-přenašeči nesou premutaci v počtu 60 a 200 kopií, plná mutace se projeví pouze v synech žen-přenašeček, plná mutace nastává pouze při přenosu ženou Zoghbi et al. 2016 Abnormální alela, mírný nebo žádný projev Možná pozdější neurodegenerativní onemocnění, u žen možné i ovariální dysfunkce Plná mutace, Martin-Bell syndrom Facioscapulohumeralní svalová distrofie (FSHD) • Změna počtu repetic D4Z4 vede k zpřístupnění lokusu pro chromatin-remodelující faktory, změna na aktivní chromatin a expresi genů s myopathickým potenciálem • Obvykle se projevuje kolem 20.roku života, ochabnutí svalů v oblasti ramen a obličeje se může projevit i v dětství, někdy bez těžkého projevu • Choroba se může projevit i u pacientů bez zkrácení chromozomu 4 Zoghbi et al. 2016 Úloha epigenetické regulace v nádorovém bujení • DNA methylace • Histonové modifikace • „Writers“ • „Readers“ • Histonové varianty • Histon-remodelující komplexy • SWI/SNF • ISWI • CHD • INO80 • RNA-interference Chromatinové změny při nádorovém bujení • Změna chromatinu zahrnuje hypomethylaci (na úrovni celého genomu) a hypermethylace (hlavně CpG ostrovů) specifických genů, vazba histone-modifikujících enzymů navozujících in/aktivovaný stav • Změna chromatinu je vidět po barvení hematoxylinurakovinné buňky mají větší jádra a více granulovaná Baylin et al. 2016 • RB – retinoblastoma • MLH1 – kolorektální karcinom • BRCA1 – rakovina prsu Úloha DNA methylace v nádorovém bujení • Hypomethylace onkogenaktivujících genů (genom) • Hypermethylace tumorsupresivních genů (CpG ostrovy) • Mutageneze • C-T tranzice • Vyšší vazba meCpG pro karcinogeny • meCpG UV mutageneze Baylin et al. 2016 Úloha DNA methylace v nádorovém bujení a progrese kolorektálního karcinomu Baylin et al. 2016 regulate cell growth, function, differentiation, and cell deatha tumour suppressor gene that controls beta-catenin turnover in the Wnt pathway = deletions are associated with colorectal malignancies • DNA damage repair regulate cell growth and cell division Hypermethylace ICR oblastí – ztráta imprintingu • Narušení DNA methylace ICR oblastí (hypo- nebo hypermethylace) vede k narušení exprese genů regulujících růst, typické u pre-neoplastických tkání • Typický příklad je Igf2 overexprese Hypomethylace repetic a promotorových oblastí • Historicky jedna z prvních abnormalit rakovinných buněk • Vyskytuje se u všech typů nádorů • Následek hypomethylace závisí na • Repetici • Ilegitimní rekombinace • Aktivace transpozice • Aktivace kryptických promotorůfu • Disrupce sousedících genů (Axinfu a Avy) • CpG chudých promotorech (=onkogen aktivující geny) • Méně běžné, než repetice • R-RAS (nádor žaludku) • miR21 (cílí tumor supresivní gen PTEN) Normální karyotyp Abnormální karyotyp Normální b. Rakovinná b. Klinická implikace abnormální epigenetické kontroly Zoghbi et al. 2016 • Diagnóza – epigenetické poruchy jako biomarkery • Prognóza – specifické poruchy regulace genů asociované s určitým nádorem • Terapie – specificky cílené inhibitory epigenetické regulace • Aktivně proliferující buňky akumulují více látek nebo lokálně dodávané Příklady látek působící na epigenetickou regulaci genové exprese • Kožní T-buněčný lymfom • Myelodysplastický syndrom (předcházejí akutní myeloidní leukémii) Epigenetické změny navozené „umělým“ zásahem • Působení prostředí • Změny prostředí v průběhu sensitivní periody • Överkalix • Holandský hladomor = „thrifty phenotype“ • Holocaust • Dieta, maternální péče aj. • Vědecky- nebo klinicky-navozené změny • ART, klonování, somatické reprogramování Vliv prostředí na epigenetickou dědičnost – holandský hladomor (studie na lidech) • Hladomor během německé blokády 1944 – 1945, zesílený zimou a nedostatkem ostatních potravin • Zásoby jídla se propadly nejdříve na 2200-1800g chleba/týden, později 1400-1000-400g+1kg brambor (cca. 600 – 1000 kalorií/den) na osobu • Hladomor byl ukončen osvobozením v květnu 1945 Vliv prostředí na epigenetickou dědičnost – holandský hladomor (studie na lidech) • „Manna“ záchranné operace („Švédský chléb“ a „Royal Airforece Manna“) • Studie souboru jedinců, kteří byli vystaveni hladomoru během kojení nebo během početí • Hladovění před početím-po početí vedlo ke zvýšení mentálních a metabolických poruch+poruchy zpracování glukozy (vyšší frekvence diabetu v potomstvu, obezita a kardiovaskulární choroby) • Žádné/nízké riziko u dětí, které nebyli vystaveny hladovění během početí nebo pokud se hladovění objevilo později během kojení Holandský hladomor – epigenetické faktory • Zvýšený výskyt poruch byl asociován se změnami DNA methylace malého počtu genů • IGF2 • GNAS • MEG ICRs (imprintované geny) • Geny metabolických drah • Současná data však ukazují nízkou transgenerační dědičnost! • „Vývojový původ zdraví a nemoci dospělých jedinců“ = Barkerova hypotéza (vysvětluje významné a permanentní změny dospělých jedinců způsobené vlivy in utero a po početí) – Holandský hladomor – podvýživa způsobuje nízkou porodní váhu, která koreluje s obezitou, diabetem II. Typu • „Thrifty phenotype“ – hypotéza programovaného ukládání energie u jedince, pokud není dostatek před a po početí (mající zřejmě epigenetický základ) Vliv parentálního traumatu během prekoncepčního období na dědičnost epigenetických změn • Přeživší Holokaustu a jejich děti mají rozdílné úrovně methylace genových oblastí • Predispozice k psychickým poruchám, nižší stresové odolnosti (sexuální deviace, psychická odolnost, obtěžování) • Porovnání změn methylace genu FKBP5, který je důležitý v odpovědi organismu na glukokortikoidy – biologický signál na stres Struktura genu FKBP5 • Regulace buněčného transportu a skládání proteinů, 11 exonů • Intron 7 – vazebná místa pro glukokortikoid Porovnání intronu 7 genu FKBP5 u přeživších obětí a jejich dětí Holokaustu, a skupinou lidí podobného věku Korelace úrovně stresu a epigenetickou mezigenerační dědičností • Ačkoli nebyl doposud pozorován definitivní efekt stresu u pravnoučat, studie prokázala jasný efekt stresového faktoru na vývoj nových jedinců 3.vazebné místo intronu 7 genu FKBP5 a korelace dětského traumatu Methylace 3.vazebného místa intronu 7 genu FKBP5 a rozdíl přeživších Holokaustu s kontrolní skupinou • Pokud žena přežila Holokaust – byly ovlivněny její oocyty i ona samotná (F0 a F1 generace) • V případě těhotenství došlo k ovlivnění i F2 generace (stále přímý efekt stresu) • F3=transgenerační přenos založený na epigenetickém mechanismu Transgenerační epigenetická dědičnost • Mezigenerační dědičnost epigenetických změn zárodečnou dráhou bez vlivu prostředí působící na fenotypovou variabilitu • Není jednotný konsensus na stabilitu a existenci transgeneračního přenosu epigenetické variability Definice transgenerační epigenetické dědičnosti • Vystavení zárodečné dráhy působení vnějších vlivů ovlivňuje u samic až tři generace (epigenetická dědičnost; u samců pouze dvě), za transgenerační epigenetický fenotyp je považována až „denovo“ zárodečná dráha F3 generace (u samců F2) Nilsson et al. 2014 Savčí příklady transgenerační epigenetické dědičnosti skrz gamety • Nejříve pozorávano pro transgeny, nejčastěji pro ty, které byly derivovány jako „cizorodá DNA“ a bakteriální sekvence • Dědičnost přes gamety, kdy není fenotyp ovlivněn během embryogeneze nebo po narození • Kdy je ovlivněn fenotyp? • Děložní efekt? • Pěstounská péče? =nejlépe studované u myši nebo krysy Savčí příklady transgenerační dědičnosti • Člověk • Overkalix • Holandský hladomor • Myš-metastabilní alely • „Agouti viable yellow“ (Avy) • „Axin fused“ (Axinfu) • Mechanismus dědičnosti není zcela objasněn • Neúplné odstranění epigenetických značek • Dědičnost mRNA (?) Alelická dědičnost Avy Paternální transmise – resetování mezi generacemi Maternální transmise – epigenetický paměť a fenotyp matky Oddělené experimenty vyloučily možnost děložní efektu během oogeneze, na základě zygotického transferu Paternální a maternální transmise trangenerační dědičnost Axinfu • Paternální dědičnost Axinfu alely ukazuje, že matka má během vývoje žádný nebo malý efekt • Střední fenotyp – výsledek variegace • Stejně jako Avy alela je považována za metastabilní Avy alela je resetována během ranné embryogeneze, ne během vývoje nové zárodečné linie, a resetována opět během implantace Děkuji za pozornost!