Téma 02_Kultivační a biochemické metody v bateriologii
Bacterial Colony: Army Ranks by suncollapse


Mikrobiologické sklo
-speciální sklo, které se liší od chemického nejen tvarem nádob, ale i jakostí
-odolnost vůči vysokým teplotám (horkovzdušná sterilizace)
-odolnost vůči působení chemických látek (v médiích, produkty kultivace mikroorganismů)
-nesmí docházet k vylouhování chemických složek, které by ovlivnily růst organismů
-silnostěnné sklo, hrdla nádob jsou rovná, tupá
-stále častěji plasty
-
Kultivační nádoby
-biologické zkumavky: silnostěnné s rovnými okraji, užívají se pro kultivace ve všech typech půd,
udržování kultur, biochemické testy. Uzavírány kovovými zátkami nebo zátkami z buničité vaty, dnes
už často plastové
-baňky: Erlenmayerovy, případně varné, zátkování podobné jako zkumavky, vhodné jak pro aerobní
kultivace, tak pro přípravu živných půd
-Durhamova plynovka: ke stanovení plynu při kultivaci v tekutých půdách
-Rouxovy, Frenbachovy, Vinogradského nádoby: pro nahromadění většího množství kultury za aerobních
podmínek
-promývací (provzdušňovací) lahve: submerzní kultivace mikroorganismů (třepání, provzdušňování)
-pipety: skleněné/plastové na konci uzavřené vatovou zátkou, pro pipetování kultur automatické
pipety nebo nástavce pro skleněné
Pracovní pomůcky v mikrobiologii (bakteriologii)

-mikroskopická skla: uchováváme v 96% etOH, odmašťujeme kys. chromsírovou, před použitím
sterilizace ožíhnutím.
-Petriho misky (často i plastové): různá velikost v bakteriologii nejčastěji průměr 100 mm, někdy
vitřní prostor členěn přepážkami pro několik kultivačních médií vedle sebe. Misky vhodné pro
krátkodobou kultivaci – vysychání.
-
Použité nádobí: nádoby i s kulturou nejdříve autoklávujeme (30 min, přetlak 0,1 MPa), obsah za
horka vylijeme a umýváme obvyklým způsobem. Použité skleněné pipety odkládáme do nádoby s 2%
ajatinem, odmastit chromsírovou směsí
-
Preparační a očkovací pomůcky: pro očkování a přípravu preparátů používáme bakteriologické kličky
nebo jehly z chromniklového nebo platinového drátu, příp. jednorázové, ocelové preparační jehly,
tyčinky, Pasteurovy pipety, lancety, pinzety a skalpely. Práce v očkovacích boxech nebo flow-boxech
Kultivační zařízení: Pro kultivaci stacionárních kultur jsou využívány termostaty, příp.
termostatované boxy, aerobní kultivace v tekutých půdách na třepacích zařízeních. K nezbytnému
vybavení patří mikroskop.
Sterilizace skla a pomůcek: Horkovzdušné sterilizátory. Suché teplo má nižší ster. účinky než teplo
vlhké, proto užívat vysokých teplot (160-180°C)/2 h. Ster. nádoby předem zabezpečit před
kontaminací vatovými uzávěry, misky balit do Al folií, skleněné pipety do kovových pouzder.

Očkovací pomůcky, pinzety, mikroskopická skla sterilizujeme ožeháváním v plameni kahanu těsně před
použitím, zchlazujeme na nezaočkované půdě, ve sterilní vodě nebo okraji kultury. Ihned po
zaočkování opět ožehneme, abychom organismy z kultury nerozptylovali do prostředí
Vzduch a pracovní plochy očkovacích boxů sterilizujeme germicidními lampami, tj. UV zářením. Během
práce sterilizujeme prac. plochy chemicky – ajatin, persteril, chronan...

Rouxova kultivační nádoba
Erlenmayerova baňka
Image result for vinogradského nádoba
Provzdušňovací lahev
Petriho misky
Durhamova plynovka

Základy identifikace bakterií
-stanovení příslušnosti studovaného kmene k určité taxonomické skupině.
-základní taxonomickou jednotkou je druh, přehled popsaných druhů a jejich vlastností, klíče a
tabulky k určování jednotlivých rodů udává Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, mezinárodní
publikace vycházející ve stále dopňovaných a rozšiřovaných vydáních
-identifikace je možná tehdy, pracujeme-li s čistou kulturou (ověření Gramovým barvením nebo
křížovým roztěrem).
-při identifikaci sledujeme několik skupin vlastností:
1.Morfologické vlastnosti: makroskopické i mikroskopické, tvar a zbarvení kolonií, charakter růstu,
různá identifikační barvení (Gramovo, acidorezistentní), tvorba spor, přítomnost pouzdra, bičíků
atd.
2.Fyziologické vlastnosti: vztah ke kyslíku, teplotní rozmezí pro růst, rezistence k teplotě,
tolerance k NaCl, citlivost ke žlučovým solím, na antibiotika, typ metabolismu (fermentativní,
aerobně nebo anaerobně respirační)
3.Biochemické vlastnosti: využívání zdrojů uhlíku, redukce nitrátů, tvorba indolu, acetonu atd.
4.Doplňující testy: elektronová mikroskopie, stanovení obsahu G+C v DNA, sérotypizace,
fagotypizace, chemická analýza buněčné stěny, PCR, ribotypizace, důkaz produkce toxinů, důkaz
patogenity atd.

-Výběr vhodných testů závisí na charakteristických znacích sledované skupiny. Zařazení sledovaného
kmene do určité skupiny, na základě morfologických a fyziologických vlastostí, je vždy prvním
krokem.
-Na jeho základě navrhujeme další testy – série biochemických testů a testy doplňující
(sérotypizace, důkaz produkce toxinů nebo patogenity u materiálu izolovaného z infekčních procesů,
mol-biol metody při popisu nového druhu, chemická analýza BS atd.).
-Získané údaje jsou zpracovávány podle klíčů a tabulek, často za pomocí počítačových algoritmů.
Protože identifikace je značně náročná, podaří se jen málo typických vzorků zařadit až do druhu
přímo v provozních laboratořích.
-specializované testy často v národních referenčních laboratořích (NRL)

MORFOLOGICKÉ VLASTNOSTI
orientační
FYZIOLOGICKÉ VLASTNOSTI
zařazení do rodu a druhu
BIOCHEMICKÉ VLASTNOSTI
zařazení do rodu a druhu
DOPLŇUJÍCÍ TESTY
subtypizace
využívání zdrojů uhlíku, redukce nitrátů, tvorba indolu, acetonu atd.
mikroskopické (tvar buněk, pohyblivost, bičíky)
makroskopické (tvar a vlastnosti kolonií)
teplota, tolerance solí, antibiotik, typ metabolismu (fermentativní, aerobně nebo anaerobně
respirační)
EM, PCR, RFLP, ribotypizace, serotypizace, fagotypizace, bakteriociny
Identifikace bakterií

Izolace bakterií (a kvasinek)
-vzorky často obsahují mnoho druhů organismů
-pro diagnostické účely je třeba rozdělit jednotlivé mikroorganismy vyskytující se v přirozeném
prostředí (vzorku) a sledovat (určovat) samostatně jednotlivé druhy
-to je nutné pro určení, že určitý mikroorganismus zodpovídá za probíhající onemocnění
člověka/zvířete, nebo pro určení jeho významu v biotopu nebo za jeho zodpovědnost za probíhající
biochemickou reakci atd.
-Kultury: mikroorganismy pěstované v lab. podmínkách na živných půdách
-Čisté kultury: kultury jednoho druhu
-Smíšené kultury: společenstva (v přirozeném prostředí)
-Technické kultury: smíšené kultury pro pokusné nebo provozní účely (biol. čištění odpadních vod
atd.)

Očkování mikroorganismů
-přenesení z uchovávacího média nebo ze vzorku do čerstvého živného prostředí
-striktně aseptická práce
-očkování z tuhých médií/vzorků bakteriologickou kličkou (na bakteriologické plotny, na šikmý agar,
do tekutého média)
-
-
-
-
-
-
-
-
-očkování z tekutých médií kličkou (do očka) nebo skleněnými nebo automatickými pipetami (do
tekutého média, na tuhé médium)
-na tuhé médium: napipetovaný objem roztřeme po povrchu agaru hokejkou, nebo se inokulum pepetuje k
vytemperovanému médiu ve zkumavkách (řídký agar), ten se vylévá na povrch pevného agaru.

Křížový roztěr
-postupné vyřeďování původního vzorku tak, aby na konci vyrůstaly na tuhém médiu jednotlivé kolonie
bakterií.
-kolonie: potomstvo jedné původní buňky, klon.
-celý postup je nutno provádět přísně sterilně, misku otevíráme co nejméně a kličku před odložením
znovu žíháme v plameni.
-klička se žíhá až do oranžova, před odběrem nutno vychladit, aby nedošlo k usmrcení organismů.
-hodnocení: barva, tvar, profil a okraje kolonií, čistota kultury

Velikost – průměr v mm, velmi malé kolnie jsou tečkovité
Povrch – hladký, někdy žilkovaný, hrubý, zvrásněný, matný, lesklý
Barva – závislost na pigmentu, dále opaleskní, zakalený, průsvitný...
Textura nebo konzistence – suchý, vlhký, mukoidní, viskózní, máslový
Bakteriální kolonie – mofologické studie
Image result for očkování mikroorganismů

Morfologické studie bakteriálních kolonií
Flavobacterium columnare strain B245 rhizoid colony (Rz), irregular rough starving colonies (R)
Colonies of Bacillus mycoides environmental strains. Colonies are... | Download Scientific Diagram
Bacillus mycoides filamentous colony

Velikost – průměr v mm, velmi malé kolnie jsou tečkovité
Povrch – hladký, někdy žilkovaný, hrubý, zvrásněný, matný, lesklý
Barva – závislost na pigmentu, dále opaleskní, zakalený, průsvitný...
Textura nebo konzistence – suchý, vlhký, mukoidní, viskózní, máslový

Mycobacterium smegmatis – kolonie s panožkovitými okraji



Kolonie mikroorganismů
bakterie
kvasinky
plísně a jiné houby

S. aureus
E. coli
S. marcescens
red pigment prodigiosin
B. subtilis
filamentous
B. antracis
filamentous
M. tuberculosis
irregular
Pseudomonas aeruginosa colonies on trypticase soy agar
P. aeruginosa
irregular

Mikroskopická identifikace mikroorganismů
-některé morfologické znaky mikroorganismů je třeba posuzovat v mikroskopickém preparátu
-nativní preparát: posouzení skutečného tvaru živé buňky, pohybu bakterií  atd. Vývoj a růst
mikroorganismů pozorujeme  v tzv. vlhké komůrce, kde jsou buňky umístěny ve visuté kapce
-vitálně barvený preparát: pro diferencované vybarvení některých buněčných struktur nebo k
rozlišení živých a mrtvých buněk
-negativně barvené preparáty: mezistupeň mezi vitálními a fixovanými preparáty – pozorování
nezbarvených buněk na kontrastním pozadí
-fixované a barvené preparáty: lepší rozlišení jednotlivých typů bezbarvých bakteriálních buněk,
jejichž tvar a struktura jsou bez předchozího barvení v optickém mikroskopu málo zřetelné
-

Morfologie bakteriálních buněk
velilkost: 0.3 – 10 um

Koky – Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Micrococcus sp.
Bacily – E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, rody Bacillus, Lactobacillus,
Legionella
Vibiro – V. cholerae, Helicobacter pyroli (vředy trávicícho systému)
Spirochety – Leptospira interrogans
Spirily - Borrelia

Koky
G+: Micrococcus, Staphylococcus, Streptocuccus, Enterococcus, Lactococcus
G-: Neisseria a Azotobacter

Kokobacily
Chlamydia trachomatis, Haemophilus influenzae, Gardnerella vaginalis a Coxiella burnetii.
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (G-, původce zubního plaku)
Bordetella pertussis (G-, původce černého kašle)
Yersinia pestis (mor), Brucella (brucelóza), Haemophilus ducreyi (G-, původce pohlavně přenášené
nemoci měkký vřed).

Tyčky (bacily)
Kmen Firmicutes (rody Bacillus, Clostridium), dále Escherichia coli

Zakřivené, rohlíčkovité tyčky (rod Vibrio), hrubé spirály (Spirilla)
Spirochety
Borellia, Leptospira, Treponema

http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg
http://4.bp.blogspot.com/-zG-IaQwzJ5E/T0KiV_VktTI/AAAAAAAAATE/d_yWfA5g50E/s1600/gram+stain2.jpg
Barvení podle Grama
Differences between Gram Positive and Gram Negative Bacteria
Lugol
Karbolfuchsin

Lugolův roztok: vodný roztok elementárního jodu a jodidu draselného
Grampozitivní bakterie mají stěnu tvořenou peptidoglykanem a polysacharidy, kterými prochází
kyselina teichoová. Při barvení se krystalová violeť dostává do buněk a tvoří s
Luglovým roztokem modrou komplexní barvu. Alkohol není schopný prostoupit buněčnou stěnou a
rozpustit komplex. Dobarvení safraninem dodá bakteriím tmavě fialovou barvu.
G+ koky: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus;
G+ bacily: Corynebacterium, Clostridium, Listeria, Bacillus.
Gramnegativní bakterie mají stěnu tvořenou tenkou vrstvou peptidoglykanu a vrstvou
lipopolysacharidu. Při stejném postupu dochází ve třetím kroku k vyplavení komplexu alkoholem a
k odbarvení. Safranin dobarví bakterie červeně.
G– koky: Neisseria;
G– kokobacily: Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Legionella, Brucella, atd.
G– bacily: Klebsiella, E.
coli, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Vibrio, Pseudomonas, Proteus, Helicobacter
pylori, Yersinia, Campylobacter, Salmonella, Bacillus fragilis, atd.

Grampozitivní bakterie mají stěnu tvořenou peptidoglykanem a polysacharidy, kterými prochází
kyselina teichoová. Při barvení se krystalová violeť dostává do buněk a tvoří s
Luglovým roztokem modrou komplexní barvu. Alkohol není schopný prostoupit buněčnou stěnou a
rozpustit komplex. Dobarvení safraninem dodá bakteriím tmavě fialovou barvu.
G+ koky: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus;
G+ bacily: Corynebacterium, Clostridium, Listeria, Bacillus.
Gramnegativní bakterie mají stěnu tvořenou tenkou vrstvou peptidoglykanu a vrstvou
lipopolysacharidu. Při stejném postupu dochází ve třetím kroku k vyplavení komplexu alkoholem a
k odbarvení. Safranin dobarví bakterie červeně.
G– koky: Neisseria;
G– kokobacily: Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Legionella, Brucella, atd.
G– bacily: Klebsiella, E.
coli, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Vibrio, Pseudomonas, Proteus, Helicobacter
pylori, Yersinia, Campylobacter, Salmonella, Bacillus fragilis, atd.
Lugolův roztok: vodný roztok elementárního jodu a jodidu draselného

Ziehl–Neelsen stain (acid fast staining)
The Ziehl–Neelsen stain, also known as the acid-fast stain, was first described by two German
doctors: the bacteriologist Franz Ziehl (1859–1926) and the pathologist Friedrich Neelsen
(1854–1898).
It is a special bacteriological stain used to identify acid-fast organisms, mainly Mycobacteria.
Mycobacterium tuberculosis is the most important of this group because it is responsible for
tuberculosis .
Acid fast organisms like Mycobacterium contain large amounts of lipid substances within their cell
walls called mycolic acids. These acids resist staining by ordinary methods such as a Gram stain.
It can also be used to stain a few other bacteria, such as Nocardia. The reagents used are
Ziehl–Neelsen carbol fuchsin, acid alcohol, and methylene blue. Acid-fast bacilli will be bright
red after staining.
Initially, Carbol Fuchsin stains every cell. When they are destained with acid-alcohol, only
non-acid-fast bacteria get destained since they do not have a thick, waxy lipid layer like
acid-fast bacteria. When counter stain is applied, non-acid-fast bacteria pick it up and become
blue when viewed under the microscope. Acid-fast bacteria retain Carbol Fuchsin so they appear red.

Ziehlovo–Neelsenovo barvení je metoda v bakteriologii, jež se používá k průkazu
tzv. acidorezistentní bakterií, konkrétně mykobakterií a nokardií a některých aktinomycet. Metodu
objevili a popsali německý bakteriolog Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen. Jedná se o jednu z
nejpoužívanějších metod diagnostiky tuberkulózy.
Metoda je založena na principu, že acidorezistentní bakterie mají schopnost přijímat zahřátá
barviva (karbolfuchsin), která se udrží ve stěně i po následném odbarvení kyselým alkoholem.
Preparát fixovaný nad plamenem se přelije koncentrovaným karbolfuchsinem.
Zahřívá se, dokud není vidět stoupat pára (jinak by barvení karbolfuchsinem nebylo účinné).
Opláchne se vodou.
Preparát se odbarví kyselým alkoholem (1% HCl v 70% etanolu), dokud neodtéká z preparátu čirý
alkohol.
Opláchne se vodou a dobarví se buď metylenovou modří nebo malachitovou zelení.
acidorezistentní bakterie mají stěnu jako G+, ale mají v ní voskové látky

http://www.medical-labs.net/wp-content/uploads/2014/03/This-stains-acid-alcohol-fast-bacteria-e.g.-
mycobacteria..jpg
Acid fast stained mycobacteria
https://o.quizlet.com/i/q3nSymrVtMwjAz2y4xPUSw.jpg

Kvantitativní hodnocení mikrobiálních kultur
-stanovení počtu mikrobiálních buněk nebo celkové biomasy
-stanovení v daném objemu, přepočet na 1 mL původního vzorku
-pro sledování růstu, množení, hodnocení podílu jednotlivých skupin mikroorganismů na celkovém
zastoupení mikroorganismů
-
-Metody přímé – mikroskopické: počítání buněk v mikroskopickém preparátu
-Metody nepřímé – kultivační: celkový počet životaschopných buněk počítáním kolonií na agarových
plotnách (zde i nefelometrické metody)
-
-Přímé: výhoda rychlost, určíme živé i mrtvé buňky
-Nepřímé: nákladnější, časově náročnější, poskytují však obraz o skutečném fyziologickém stavu
kultury

Přímé stanovení počtu buněk mikroskopickým počítáním
-suspenze o vhodné hustotě
-preparáty bez úpravy nebo upravované – fixované, barvené
-nezbarvené buňky např. pod fázovým kontrastem
-počítací komůrky: Thomova, Bürkerova, Vošahlíkova
-komůrky složeny ze silného podložního skla s vylitou sítí čtverečků a krycího skla, které se
pokládá na boční lišty, čímž vzniká mezi sklíčky prostor o přesně definované hloubce
-není-li komůrka, lze počítat v zorném poli a přepočítat na plochu krycího skla, pracujeme se
známým objemem suspenze
-Bürkerova komůrka: plošky o obsahu 1/25 a 1/400 mm2, hloubka prostoru mezi sklíčky 0,1 mm (tedy
objemy 1/125 nebo 1/4000 mm3)
-

Na fixovaných a barvených preparátech
-pro uchování jako dokladový materiál
-podložní skla, na spodní straně rydlem nebo fixou označenu přesně definovanou plochu
-na plochu nanést známý objem suspenze, rozetřít, usušit, fixovat a barvit
-barvení: např. safraninem, erythrosinem, karbolfuchsinem
-počítat buňky min. v 10 zorných polích
-
Na membránových filtrech
-použití tam, kde lze oddělit mikroby od ostatní biomasy a kde je třeba zakoncentrovat jejich buňky
z větších objemů (v praxi hlavně rozbory vody)
-filtrace na sterilních filtrech, barvení karbolerythrosinem, vymytí přebytečného barviva
-vysušený filtr přenést do kaptky imerzního olejena podložním skle, další kapku nanést na membránu
a preparát uzavřít krycím sklem
-počítat imerzním objektivem a buď okulárem s vloženou měřicí síťkou nebo v zorných polích

Nepřímé stanovení počtu buněk – kultivační stanovení počtu životaschopných buněk
-kultivace a počítání kolonií vyrostlých na agarových plotnách
-empirický předpoklad: z 1 životaschopné buňky vyrůstá 1 kolonie
-životaschopnost: schopnost buňky vytvářet na agarovém médiu viditelné makroskopické kolonie
-zaočkování inokula do agarového media: 1) očkování inokula na plotnu a rozetření hokejkou, nebo 2)
zalití inokula (1 mL) vytemperovaným agarem a důkladně rozmíchat. Druhá metoda i pro stanovení
anaerobů (kultivace pod parafinem).
-suspenzi před očkováním ředit, aby vyrostly na tuhém médiu jednotlivé kolonie, které se
nepřekrývají okraji, obvykle desítkové ředění

Nefelometrické stanovení počtu buněk
-metoda založena na zjištění aktuální hustoty buněk nefelometrem
-rozptyl světla v zakalené kapalině závisí na jeho vlnové délce, optických vlastnostech kapaliny i
vlastnostech rozptýlených částic
-metodu lze použít v kombinaci s mikroskopickou nebo kultivační metodou stanovení počtu buněk a
pouze v určitém koncentračním rozmezí suspendovaných částic (při příliš vysokých koncentracích
buněk je světlo absorbovaáno okolní kapalinou, takže hodnoty neodpovídají skutečnosti)
-sestrojí se kalibrační křivka – závislost optické denzity (OD) na počtu buněk při vhodné vlnové
délce (např. 620 nm).
-k tomu se použije řada ředění vzorku v použitím rozpouštědle, médiu nebo roztoku.
-u každého ředění změříme optickou denzitu a stanovíme počet buněk mikroskopicky nebo kultivačně

Nefelometrie (také tyndallometrie) je fyzikálně chemická analytická metoda pro měření koncentrace
koloidních disperzí. Při stálé koncentraci je možné měřit i velikost koloidních částic. Je založena
na měření intenzity rozptylu světla a absorpce světla.[1]

Při této metodě se využívá speciálních optických vlastností koloidních disperzí. Světlo
procházející v určitém směru do koloidů způsobuje kolmo na tento směr opalescenci, která je
způsobena rozptylem světla na koloidních částicích. Tento úkaz se nazývá Tyndallův jev.

Při průchodu světelných paprsků kapalinou, která obsahuje jemně rozptýlené nerozpuštěné částice
(suspenze, koloidní disperze), dochází k rozptylu světla do všech směrů a intenzita procházejícího
světla se zmenšuje v závislosti na koncentraci suspendovaných částic.

Do vzorku vniká primární světlo a měří se intenzita sekundárního světla, které se odráží od částic
v určitém úhlu ke směru, kterým do vzorku primární světlo vniklo. Koncentraci suspendovaných částic
lze zjišťovat dvojím způsobem:

-měřením světelného toku, který je částicemi odrážen kolmo nebo pod určitým úhlem na směr
dopadajícího paprsku. Tento způsob měření se označuje jako nefelometrie.
-měřením světelného toku po průchodu prostředím ve směru dopadajícího světelného toku ze zdroje.
Tento způsob měření se označuje jako  turbidimetrie.

Měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích se zabývá nefelometrie.
Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry (tzv. Tyndalovo světlo) a měří se pod úhlem, který
je odlišný od směru dopadajícího záření. Konvenční nefelometry používají jako světelných zdrojů
žárovku s halogenovou atmosférou nebo xenonovou výbojku. Optika těchto přístrojů obsahuje navíc
interferenční filtr, neboť světelný zdroj poskytuje polychromatické světlo. Detektor je nastaven
pod úhlem 70 až 90°, protože stupeň směrovosti světla z konvenčního zdroje je nízký. Laserový
nefelometr používá jako světelného zdroje helium-neonového laseru. Tento zdroj monochromatického
světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti. Laserový paprsek prochází přes kyvetu
s měřeným roztokem a rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úhlem 5 až 35°
(fotonkou nebo fotonásobičem).
K teorii nefelometrie

Mikroorganismy jsou v laboratořích uchovávány na sterilních živných půdách. Složení musí vyhovovat
všem požadavkům daného organismu na výživu, pH, osmotické poměry a další fyzikálně chemické
podmínky. Připravovaná živná média musí být izotonická a musí obsahovat zdroj C a N (v konc. a
formě dostupné pro daný organismus), růstové faktory a vodu.
Optimální živné prostředí by v průběhu kultivace nemělo měnit svoje fyzikální a chemické
vlastnosti, to je však možno splnit pouze při kontinuální kultivaci. Během stacionární kultivace se
složení výrazně mění – vyčerpávání živin a hromadění metabolitů.
Živná média

Příprava živných půd:
-voda: vodovodní (pro půdy z přírodního materiálu), destilovaná (syntetická média), ve spec.
případech (stanovení vitaminů, aminokyselin atd.) redestilovaná nebo deionizovaná voda
-ztužené půdy: agar 1,5 – 3%
-agar je přírodní polysacharid (lineární polymer galaktózy) s vysokou gelující schopností, vyrábí
se z mořských řas Floridae a Gelidium.
-většina médií je dodávána kompletně v práškové podobě, nutno rozpustit, upravit pH a sterilizovat
-úprava pH: 1N NaOH nebo 1N HCl, bakterie: pH 7 – 7,3, kvasinky a houby pH 4,5 – 6,0. Sterilizací
klesne pH o 0,1 až 0,3.
-sterilizace médií: autoklávování při přetlaku 0,1 – 0,15 MPa, což odpovídá teplotě 121 – 128 °C.
Doba závisí na objemu a viskozitě půdy (20 min pro zkumavky a malé objemy, 30 – 60 min pro objem 3
l).
-!!!! roztoky cukrů sterilizujeme filtrací a přidáváme do sterilního média
-frakciovaná sterilizace: media zahříváme v proudící páře (20 – 30 min na teplotu 99 – 100 °C,
postup opakujeme ve 3 po sobě následujících dnech. Pro média poškuzující se tlakovou sterilizací
(mléko, želatinová media)

Rozlévání půd a jejich uchovávání
Tekuté a ztekucené půdy plníme do sterilních baněk nebo zkumavek s vatovou nebo kovovou zátkou.
Nepotřísnit okraje nádob ani zátky!!! Kontaminace!!!
Půdy sterilizujeme ihned po rozplnění
Z pevného média ve zkumavkách připravujeme šikmé agary tak, že vysterilizovanou půdu necháme
utuhnout v šikmé poloze
Bakteriologické plotny lijeme do sterilních Petriho misek asepticky až po sterilizaci půd.
Rozlévání provádíme v předem vydezinfikovaných boxech, misky plníme do výšky 3 -4 mm, pro
kvantitativní analýzy pipetujeme 15 – 20 mL media na misku (100 mm). Necháme tuhnout ve vodorovné
poloze, po utuhnutí obvykle inkubujeme 2 – 3 dny v obrácené poloze, při teplotě, jež bude použita
pro kultivaci. Tím dojde k vhodnému předsušení půdy, nutnému k povrchovému očkování. Během inkubace
se projeví i připadná kontaminace.
Uchovávat v temném, bezprašném, suchém a pokud možno chladném prostředí. Pro dlouhodobnější
uchovávání lépe chladnička.

Podle složení:
1.Syntetická prostředí: jejich složení je předem definováno. Většinou jde o organické roztoky,
zdrojem C obvykle glukosa, zdrojem N (NH4)2SO4 nebo NH4Cl. Dodávají se některé aminokyseliny,
vitaminy, růstové faktory.
2.Přirozená živná prostředí: tvořena složkami získávanými po kyselé nebo enzymatické hydrolýze
kaseinu, fermentativní hydrolýze masa (masový výtažek), autolýzou nebo hydrolýzou pekařského droždí
(extrakt z kvasinek), působením žaludečních šťáv na rostlinné a živočišné bílkoviny (pepton).
Z hlediska růstu mikroorganismů (a též pro diagnostiku):
1.Půdy univerzální: složením vyhovují požadavkům na výživu širokého spektra organismů (např.
masopeptonový bujón, sladinový agar atd. ).
2.Půdy selektivní: složení zvýhodňuje růst jednoho druhu nebo skupiny organismů. Růst ostatní
mikroflóry je brzděn (Ashbyho agar, Staphylococcus medium)
3.Půdy selektivně diagnostické: na nich roste jen velmi malá skupina organismů, která se projeví
charakteristickou biochemickou reakcí (Endova půda)
4.
Ashbyho agar – bezdusíkaté médium, rostou na něm jen organizmy schopné fixace vzdušného dusíku
Ashby’s Mannitol Agar is used for the cultivation of the Azotobacter species that can use mannitol
and atomospheric nitrogen as a source of carbon and nitrogen, respectively. Besides having the
ability to fix atomospheric nitrogen, Azotobacter can also synthesize biologically active
substances which improve seed germination and plant growth.

Selective media allow the growth of certain type of organisms, while  inhibiting the growth of
other organisms. Selective inhibition of some types of microorganisms can be studied by adding
certain dyes, antibiotics, salts or specific inhibitors that will affect the metabolism or
enzymatic systems of the organisms. For example, media containing potassium tellurite, sodium azide
or thallium acetate at different  concentrations of 0.1 - 0.5 g/l will inhibit the growth of all
Gram-negative bacteria. Media supplemented with the antibiotic penicillin concentration 5-50
units/ml or crystal violet 2 mg/l inhibit the growth of Gram-positive bacteria. Tellurite agar, is
used to select for Gram-positive organisms, and nutrient agar supplemented with the antibiotic
penicillin can be used to select for the growth of Gram negative organisms.
Differential media are widely used for differentiating closely related organisms or groups of
organisms. Because of the presence of certain dyes or chemicals in the media, the organisms will
produce certain characteristic changes or growth patterns that are used for identification or
differentiation of microorganism.
Enriched media are media that have been supplemented with highly nutritious materials such as
blood, serum or yeast extract for the purpose of cultivating fastidious organisms.

Selektivní součást některých půd jsou např. barviva, antibiotika, soli, jejichž toxicita se využívá
pro eliminaci některých skupin:
Barviva
-krystalová violeť v Gassnerově půdě
-metylenová modř v Levinově půdě
-bazický fuchsin v Endově půdě (všechny tři eliminace G+)
-bengálská červeň, krystalová violeť (eliminace mikromycet)
-
Penicilin (suprese G+), soli (suprese G-)
Telurid draselný
Azid sodný
Acetát thallia
Diferenciace založena na:
-fermentaci sacharidů
-utilizaci peptonu
-permeabilizaci membrány u G-
-produkce H2S
-hemolýza
-
Obohacení půd pro růst náročných organismů
- erytrocyty, hemin, NAD...

Proč se mění barva pH indikátorů?
fenolová červeň
pH pod 7: zbarven žlutě (absorbce v modré části spektra – 425 nm)
pH nad 7: zbarven červeno-fialově (absorbce v žluté a žlutozelené oblasti – 615 nm)




Mannitol salt agar (MSA)
•Mannitol salt agar is both a selective and differential media used for the isolation of pathogenic
Staphylococci from mixed cultures.
•On MSA, only pathogenic Staphylococcus aureus produces small colonies surrounded by yellow zones.
The reason for this color change  is that S. aureus have the ability to ferment the mannitol,
producing an acid, which, in turn, changes the indicator color  from red to yellow. The growth of
other types of bacteria is usually  inhibited. This growth differentiates S.aureus from
S.epidermidis, which  forms  colonies with  red  zones or both zones.
S. aureus
S. epidermidis

Obsahuje vysokou koncentraci (asi 7,5–10%) soli (NaCl), takže je selektivní pro většinu
gramnegativních a některých grampozitivních bakterií
( Staphylococcus , Enterococcus a Micrococcaceae ), protože tato hladina soli inhibuje většinu
ostatních bakterií. . Je to také diferenciální médium pro manitol-fermentující stafylokoky,
obsahující sacharid mannitol a indikátor fenolovou červeň , indikátor pH pro detekci kyseliny
produkované manitol-fermentujícími stafylokoky. Staphylococcus aureus produkuje žluté kolonie se
žlutými zónami, zatímco jiné koaguláza-negativní stafylokoky produkují malé růžové nebo červené
kolonie bez změny barvy média. Pokud organismus dokáže fermentovat mannitol, vytvoří se kyselý
vedlejší produkt, který způsobí zežloutnutí fenolové červeně v agaru. Používá se pro selektivní
izolaci předpokládaných patogenních (pp) druhů Staphylococcus .

MSA
Obsahuje vysokou koncentraci (asi 7,5–10%) soli (NaCl), takže inhibuje většinu gramnegativních a
některých grampozitivních bakterií.
Indikátor je fenolová červeň.
Přežívají hlavně rody Staphylococcus a Micrococcaceae (G+, kataláza+).
Je diferenciální půdou pro stafylokoky.
S. aureus fermentuje manitol – produkce kyseliny – změna indikátoru na žlutý (žluté kolonie nebo
médium kolem nich)
S. epidermidis – nefermentuje manitol, kolonie zůstávají červené.
Mikrokoky tvoří také červené kolonie (spolu se stafylokoky tvoří přirozenou mikrofloru kůže a
sliznic, avšak jen zřídka působí infekce).
Ostatní bakterie jsou inhibovány

MacConkey´s agar (MAC)
•MacConkey’s Agar is both a selective and  differential media; it is selective for Gram negative
bacteria and can differentiate those bacteria that have the ability to ferment lactose
•Neutral red pH indicator - Stains microbes fermenting lactose (hot pink in acid pH, rose in
neutral pH, brown in alkaline pH)
•By utilizing the available lactose in the medium, Lac+ (lactose fermenting)  bacteria such as
Escherichia coli, Enterobacter and Klebsiella will produce acid in the medium, which lowers the pH
of the agar below 6.8 and results in the appearance of red or pink colonies. Non-lactose fermenting
bacteria such as, Proteus species, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa and Shigella cannot utilize
lactose in the medium, and will use peptone instead. This results in the formation of ammonia,
which raises the pH of the agar, and leads to the formation of white or colorless colonies in the
plate.

Fermentace laktozy
Červený indikátor pH – kyselé, neutrální (růžová), alkalické (hnědá)
Lac+ (E.coli, Enterobacter, Klebisella) produkce kyselin z laktosy – červené, růžové kolonie
Lac- (Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Shigella) utilizace peptonu namísto laktosy – tvorba
amoniaku – zvýšení pH – hnědé kolonie

MAC
Založena na fermentaci laktozy
Selektivní médium pro G- enterické bakterie a diferenciační pro Lac+
Kromě laktosy obsahuje také pepton
Dále obsahuje krystalovou violeť (potlačuje G+)
Neutrální červeň: indikátor pH – kyselé, neutrální (růžová), alkalické (hnědá)
Lac+ (laktosa-fermentující: E.coli, Enterobacter, Klebisella) produkce kyselin z laktosy – červené,
růžové kolonie
Lac- (lackosa-nefermentující: Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Shigella) utilizace peptonu namísto
laktosy – tvorba amoniaku – zvýšení pH – hnědé kolonie

Eosin methylene blue agar (EMB), Endo agar
•Eosin methylene blue agar (EMB) is both a selective and  differential medium used for the
detection and isolation of Gram-negative intestinal pathogens.
•Acid production from lactose fermentation causes precipitation of the dyes on the surface of the
colony resulting in different colors.
•Large amounts of acid  - green metallic sheen
•Small amounts of acid  - pink
•No fermentation - colorless
•Enterobacter aerogenes produces large colonies which are pink-to-buff around dark centers.
Escherichia coli produce small, dark colonies with a green metallic sheen. Pseudomonas, Proteus,
Salmonella and Shigella sp produces colorless colonies because it does not ferment lactose.
•
E. coli
Enterobacter aerogenes
Proteus vulgaris

Toto médium bylo vytvořeno Holt-Harrisem a Teagueem v roce 1916. Obsahuje pepton, laktózu,
sacharózu, fosfát draselný, agar, eosin, methylenovou modř a vodu. Je velmi podobná agaru
MacConkey, zejména při použití EMB agaru modifikovaného Levinem, který neobsahuje sacharózu.
Ve skutečnosti každá laboratoř rozhodne, zda pracuje s jedním nebo druhým, protože plní stejnou
funkci, i když jsou biochemicky odlišné.

EMB
Podobné předchozímu
Obsahuje pepton, laktózu, eosin a methylenovou modř
Selektivní pro G- enterické bakterie, diferenciační pro Lac+
G+ nerostou
Produkce kyseliny z laktosy způsobuje preicipaci barviv na povrchu kolonií, což vede ke změnám
barvy.
E.coli -  rychlá metabolizace laktosy, velké množství kyseliny, zelené/tmavé kololnie s kov. leskem
Enterobacter – pomalejší fermentace, méně kyseliny , růžové kolonie s tmavými středy
Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Shigella bezbarvé kolonie, protože jsou Lac- (protože utilizují
pepton, vzniká amoniak (alkalizace), bezbarvé kolonie (v půdě není indikátor alkalického pH)
Je velmi podobná agaru MacConkey.
Každá laboratoř rozhodne, zda pracuje s jedním nebo druhým, protože plní stejnou funkci, i když
jsou biochemicky odlišné.
Podobná je Gassnerova půda
s obsahem metachrome yellow – suprese G+
lac+ ... modré kolonie (kyselost, změna barvy indikátoru)
lac- ... žluté kolonie nebo žluté pozadí

Phenylethyl alcohol agar (PEA)
•Phenylethyl Alcohol (PEA) Agar with or without 5% sheep blood is a selective medium for the
isolation of gram-positive organisms, particularly gram-positive cocci, from specimens of mixed
gram-positive and gram-negative flora.
•Phenylethyl alcohol – Inhibits the growth of Gram negatives since it selectively and reversibly
inhibits DNA synthesis, thus selecting for Gram positives.
•
PEA alters the membrane permeability, of Gram-negative bacteria allowing influx of otherwise
blocked molecules. This results in leakage of large amounts of cellular potassium that ultimately
results in disruption or inhibition of DNA synthesis of Gram-negative bacteria.

Hektoen Enteric Agar (HE)
•Hektoen Enteric (HE) Agar is a moderately selective medium used in qualitative procedures for the
isolation and cultivation of gram-negative enteric microorganisms, especially Shigella and
Salmonella from a variety of clinical and nonclinical specimens
•Coliforms capable of overcoming the moderately inhibitory qualities of the media will develop into
orange or salmon-pink colonies in the presence of the bromthymol blue indicator. Shigella species
develop into green-colored colonies with darker blue-green centers.  Salmonella species appear as
blue-green colonies with or without black centers.  Producers of H2S will form black-centered
colonies in the presence of the ferric ammonium citrate indicator.
Shigela flexneri
Salmonella typhimurium

HE
Je mírně selektivní médium pro izolaci a kultivaci G- enterálních bakterií hlavně pro Shigella a
Salmonella
Obsahuje laktosu (nebo jiný cukr, který neutilizují shigely nebo salmonely), pepton (ten naopak
utilizují shigely nebo salmonely), síran železito-amonný, bromthymolovou modř, kyselý fuchsin
Koliformní bakterie odolávající mírně inhibujícím vlastnostem média budou mít oranžové až růžové
kolonie v přítomnosti bromtymolové modři (indikátor utilizace laktose). To proto, že utilizují
sacharidy a vytvářejí kyselé prostředí
Shigella má zelené kolonie
Salmonella má modro-zelené kolonie s tmavým středu.
Obojí neokyselují (naopak alkalizují médium, spotřebovávají pepton)
Bakterie produkující sirovodík mají kolonie s tmavým středem v přítomnosti síranu (citrátu)
železito-amonného – precipitát barviv přítomnosti H2S

Blood agar
•Blood agar is both differential and enriched medium. The blood that is incorporated into this
medium is an enrichment ingredient for the cultivation of fastidious organisms such as the
Streptococcus species.
•A number of streptococcal species produce substances that destroy red blood cells; that is, they
cause lysis of the red cell wall with subsequent release of hemoglobin. Such substances are
referred to as hemolysins. The activity of streptococcal hemolysins also known as streptolysins can
be readily observed when the organisms are growing on a blood agar plate.
Streptococcus pyogenes – beta hemolysis
Streptococcus pneumoniae – alpha hemolysis
Streptococcus salivarius –  gamma hemolysis

Alfa
Pokud je přítomna alfa hemolýza (α-hemolýza), je agar pod kolonií tmavý a nazelenalý. Streptococcus
pneumoniae a skupina orálních streptokoků ( Streptococcus viridans nebo viridans streptokoky)
vykazují alfa hemolýzu. Toto se někdy nazývá zelená hemolýza kvůli změně barvy na agaru. Dalšími
synonymními pojmy jsou neúplná hemolýza a částečná hemolýza . Alfa hemolýza je způsobena
peroxidem vodíku produkovaným bakterií, který oxiduje hemoglobin a produkuje zelený oxidovaný
derivát methemoglobin  3+ místo 2+.
Beta
Beta hemolýza (β-hemolýza), někdy nazývaná úplná hemolýza , je úplná lýza červených krvinek v
médiích kolem a pod koloniemi: oblast se jeví zesvětlená (žlutá) a průhledná. Streptolysin,
exotoxin, je enzym produkovaný bakteriemi, který způsobuje úplnou lýzu červených krvinek. Existují
dva typy streptolysinu
Gama
Pokud organismus neindukuje hemolýzu, agar pod kolonií a kolem něj se nezmění a organismus se
nazývá nehemolytický nebo se říká, že vykazuje gama hemolýzu (γ-hemolýza). Enterococcus
faecalis (dříve nazývaný „skupina D Strep“), Staphylococcus saprophyticus a Staphylococcus
epidermidis vykazují gama hemolýzu.

Typy hemolýzy:
Alfa
Pokud je přítomna alfa hemolýza (α-hemolýza), je agar pod kolonií tmavý a nazelenalý. Streptococcus
pneumoniae a skupina orálních streptokoků (Streptococcus viridans atd.) vykazují alfa hemolýzu.
Toto se někdy nazývá zelená hemolýza kvůli změně barvy na agaru. Dalšími synonymními pojmy jsou
neúplná hemolýza a částečná hemolýza. Alfa hemolýza je způsobena peroxidem vodíku produkovaným
bakterií, který oxiduje hemoglobin a produkuje zelený oxidovaný derivát methemoglobin  3+ místo 2+.
Beta
Beta hemolýza (β-hemolýza), někdy nazývaná úplná hemolýza, je úplná lýza červených krvinek v
médiích kolem a pod koloniemi: oblast se jeví zesvětlená (žlutá) a průhledná. Streptolysin,
exotoxin, je enzym produkovaný bakteriemi, který způsobuje úplnou lýzu červených krvinek. Existují
dva typy streptolysinu
Gama
Pokud organismus neindukuje hemolýzu, agar pod kolonií a kolem něj se nezmění a organismus se
nazývá nehemolytický nebo se říká, že vykazuje gama hemolýzu (γ-hemolýza). Enterococcus faecalis
(dříve nazývaný „skupina D Strep“), Staphylococcus saprophyticus a Staphylococcus epidermidis
vykazují gama hemolýzu.

Chocolate agar
•Fastidious organisms such as Haemophilus and Neisseria require specially enriched culture media
and microaerophilic incubation conditions. “Chocolate” agar is commonly used for primary isolation
of Haemophilus from clinical specimens. This medium contains hemoglobin derived from bovine red
blood cells as well as other enrichment growth factors. Chocolate agar may be made selective for
Haemophilus species by the addition of bacitracin.
•Two special growth factors, called X and V, are required by some Haemophilus species. The X factor
is hemin, a heat-stable derivative of hemoglobin. The red blood cells in chocolate agar have been
heated until they are lysed, producing the characteristic brown color of this medium.

Čokoládový agar je modifikace krevního agaru, vyrábí se přidáním krve do horkého agaru. Tepelnou
lýzou se z krvinek uvolní některé růstové faktory jako hemin a NAD, proto je CHOC vhodný pro
kultivačně náročné bakterie, jako jsou například rody Haemophilus či Neisseria. Narozdíl od KA na
něm neprobíhá hemolýza.

Čokoládový agar
Čokoládový agar je modifikace krevního agaru, vyrábí se přidáním krve do horkého agaru. Tepelnou
lýzou se z krvinek uvolní některé růstové faktory jako hemin a NAD, proto je CHOC vhodný pro
kultivačně náročné bakterie, jako jsou například rody Haemophilus či Neisseria.
Může být selektivní pro druhy rodu Haemophillus přídavkem bacitracinu.
Narozdíl od KA na něm neprobíhá hemolýza.

Kultivace anaerobních bakterií
G- tyčky: Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, Porphyromonas
G- koky: Veilonella
G+ sporulující tyčky: Clostridium
G+ nesporulující tyčky: Actinomyces, Propionibacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus
G+ koky: Peptostreptococcus, Peptococcus
Striktní anaeroby: růst na pevných půdách do 0,5% kyslíku
„Umírněné“ anaeroby: do 2 až 8% kyslíku
Anaerobní kultivace: 10% CO2, 80% N2, 10% H2
Použití anaerobního boxu nebo anaerostatu
Kultivace 48 h a více
Obohacený krevní agar (VL agar, Wilkins Chalgren agar, Schaedler anaerobní bujon), Anaerobní
hemokultury

Anaerobní box
Anaerostat


Biochemické identifikační testy
-Jako identifikační biochemické znaky slouží ty vlastnosti, které jsou snadno zjistitelné a poměrně
stálé, tzn. že výskyt mutantů, které ztratily tuto vlastnost, je poměrně vzácný. Přesto se však
tyto mutanty vyskytují a jejich procento stoupá v souvislosti se vzrůstajícím znečištěním ŽP.
-Proto se dnes přechází od identifikačních klíčů, které uváděly pouze pozitivní či negativní
reakce, k tabulkám, v nichž je uvedeno procento kmenů daného druhu, u nichž je test pozitivní,
eventuálně zde výsledek kolísá i u buněk určitého kmene.
-Pro průkaz biochemické aktivity bakterií byla vyvinuta celá řada různých biochemických
identifikačních testů, kterými detekujeme přítomnost produktů či metabolitů vznikajících utilizací
sacharidů, bílkovin či dalších látek nebo přímo vybrané enzymy, specifické pro daný druh bakterií.
-Diagnostika pozitivní biochemické reakce je založena na změně barvy testovacího média, ke které
dochází změnou příslušného indikátoru.
-V dnešní době se nejčastěji využívají standardní komerční testy, a to ve formě diagnostických
proužků (stripů) pro jednotlivé reakce (např. OXItest, VPtest, ONPtest) nebo diagnostických souprav
určených pro diagnostiku zvolené skupiny bakterií (ENTEROtest, EN-COCCUStest, STAPHYtest, atd.).
-

Oxidačně-fermentační test
Princip: tvorba kyselin za aerobních podmínek růstu (indikátor bromothymolová modř)
Využití: Micrococcus (kyselina pouze aerobně) od Staphylococcus (kyselina anaerobně), Pseudomonas
(aerobně) od enterobakterií (anaerobně)
Hugh and Leifson’s medium:
Peptone 2.0gm/L,  Sodium chloride 5.0gm/L,  Dipotassium phosphate 0.30gm/L,  Glucose (Dextrose)
10.0gm/L,  Bromothymol blue 0.030gm/L, Agar 3.0gm/L,  Final pH ( at 25°C) 7.1±0.2

Oxidačně fermentační test
Pricip: tvorba kyselin za aerobních/anaerobních podmínek
Fermentace: anaerobní glykolýza, vznikají org. kyseliny, CO2, etanol atd.
Oxidativní utilizace (aer. respirace): rozklad glukosy až na CO2 a H2O.
Indikátor: bromothymolová modř (okyselením se mění na žlutou)
Využití: Micrococcus (kyselina pouze aerobně) od Staphylococcus (kyselina anaerobně), Pseudomonas
(aerobně) od enterobakterií (anaerobně)
Používají se dvě zkumavky: jedna převrstvená minerálním olejem nebo parafinem (anaerobní
prostředí), druhá otevřená (aerobní prostředí).
Utilizace tryptonu: - alkalická reakce: tmavě modrá/zelená barva
Utilizace glukosy: - produkce kyseliny: žlutá
Oxidativní utilizace (negativní fermentace) povede ke vzniku kyseliny (žlutá barva) pouze
v otevřené zkumavce. Aerobní nefermentující druhy, např. Pseudomonas.
Fermentativní i oxidativní utilizace povede k produkci kyseliny (žlutá) v obou – otevřené i zavřené
zkumavce. Fakultativně anaerobní mikroorganismy, např. E. coli.
Fermentativní utilizace pouze v zavřené zkumavce: pravá fermentace (obligátní anaerobové)
Asacharolytické organismy (negativní oxidace i fermentace): žádná kyselá reakce

Fermentace cukrů
Tvorba kyseliny a/nebo plynu během fermentativního růstu na cukru (fenolová červeň, Durhamova
zkumavka)
Rozlišení enerobakterií
Carbohydrate Fermentation Broth
trypticase, Sodium chloride, and Phenol red
Fermenační médium složeno ze zdroje uhlíku (glucose, sucrose, or cellulose) a pH indikátoru
(fenolová červeň).
Při fermentaci vznikají organické kyseliny (Lactic acid, formic acid, or acetic acid) -  změna pH
na 6.8 a barvy indikátoru na žlutou.
Produkce plynu, jímání do Durhamovy zkumavky.
Bakterie utilizující pepton produkují alkalické produkty – není změna barvy.




Beta-galakosidáza
Hydrolýza o-nitrofenyl-beta-galaktosidu za tvorby nitrofenolu (žlutý)
Citrobacter (+) od Salmonella  (-), identifikace některých druhů Shigella a Pseudomonas
Medium: Sodium phosphate buffer, 1 M, pH 7.0
O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG), 0.75 M
Physiologic saline
Toulene
O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) is structurally similar to lactose (i.e. ONPG is an
analog of lactose), except that orthonitrophenyl has been substituted for glucose.
Lactose fermenter (ONPG Positive): E.coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp produce β-galactosidase
Non lactose fermenter (ONPG Negative): Salmonella spp; Shigella spp; Proteus spp; Providencia spp
and Morganella spp do not produce β-galactosidase so can not ferment lactose.
Podobné EMB půdě (Endo agaru)

Test na beta-galaktozidázu

Hydrolýza o-nitrofenyl-beta-galaktozidu za tvorby žlutého nitrofenolu
Tato látka je podobná lakose (analog lakosy).
Odštěpení ortonitrofenylové skupiny beta-galaktosidásou
Test pro odlišení laktosa-fermentujících (lac+) a laktosa-nefermentujících (lac-) organismů
Podobné EMB půdě, Endo agaru.

Methylčerveňový test
Tvorba většího množství kyseliny z glukosy, pH klesá pod 4.3 (indikátor je methylčerveň)
Escherichia (+) od Enterobacter a Klebsiella (-)
MRVP broth (pH 6.9)
Ingredients per liter of deionized water:
buffered peptone= 7.0 gm
glucose= 5.0 gm
dipotassium phosphate= 5.0 gm
Some bacteria have the ability to utilize glucose and convert it to a stable acid like lactic acid,
acetic acid or formic acid as the end product.
These bacteria initially metabolise glucose to pyruvic acid, which is further metabolized through
the ‘mixed acid pathway to produce the stable acid. The type of acid produced differs from species
to species and depends on the specific enzymatic pathways present in the bacteria. The acid so
produced decreases the pH to 4.5 or below, which is indicated by a change in the colour of methyl
red from yellow to red.

Test využívající methylovou červeň
Tento test detekuje produkci velkého množství kyseliny při fermentaci glukosy, pH tu klesá až
k 4.5, což mění barvu indikátoru (methylové červeně) ze žluté na červenou.
Tento test je analogií předchozího, opět podobné EMB půdě (Endo agaru)

Result Interpretation of Voges–Proskauer (VP) Test
Voges-Proskaureův test
Tvorba acetoinu fermentací cukru
Klebsiella a Enterobacter (+) od Escherichia (-)
The Voges-Proskauer (VP) test is used to determine if an organism produces acetylmethyl
carbinol from glucose fermentation. If present, acetylmethyl carbinol is converted to diacetyl in
the presence of ∝- naphthol, strong alkali (40% KOH), and atmospheric oxygen.
The ∝-naphthol was not part of the original procedure but was found to act as a color
intensifier by Barritt and must be added first. The diacetyl and quanidine-containing compounds found
in the peptones of the broth then condense to form a pinkish red polymer.
2 pyruvate = acetoin + 2CO2
acetoin + NADH + H+ = 2,3-butanediol + NAD+
VP broth (pH 6.9)
Ingredients per liter of deionized water:
buffered peptone= 7.0 gm
glucose= 5.0 gm
dipotassium phosphate= 5.0 gm

Voges-Proskaureův test
Tvorba acetoinu (ne acetonu!!!) fermentací cukru
je to komplementární test k předchozímu (vychází naopak).

Prokazuje produkci acetylmethyl carbinolu (acetoinu) při fermentaci glukosy. Jestliže k němu
dochází, acetoin je konvertován na diacetylovou formu v přítomnosti alfa-naftolu (přídavek do
média). Tento spolu s dalšími látkami v peptonu (součást média) pak kondenzuje v růžovo červený
polymer.

Positivní reakce: růžovo-červené barivio na povrchu/hladině
Viridans group streptococci (kromě Streptococcus vestibularis), Listeria, Enterobacter, Klebsiella,
Serratia marcescens, Hafnia alvei, Vibrio eltor, Vibrio alginolyticus, etc.

Negativní reakce: nevytvoří se růžovo-červené barvivo
Streptococcus mitis, Citrobacter sp., Shigella, Yersinia, Edwardsiella, Salmonella, Vibrio
furnissii, Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus, and Vibrio parahaemolyticus etc.

Využití citrátu (Simmonsův test)
Využití citrátu jako jediného zdroje uhlíku, výsledkem je alkalizace média (bromthymolová modř)
Klebsiella – Enterobacter (+) od Escherichia (-)
-
+

Tvorba sirovodíku
Tvorba sirovodíku rozkladem aminokyselin obsahujících síru nebo redukci thiosíranu, detekce tvorbou
černého sulfidu železnatého
Identifikace Salmonella, Proteus
SIM Agar
Pancreatic digest of casein 20.0g,  Peptic digest of animal tissue 6.1g, Agar 3.5g,
Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.2g, Na2S2O3·5H2O 0.2g, pH 7.3 ± 0.2 at 25°C
Organisms which produce the enzyme thiosulfate reductase can reduce sulfur to hydrogen sulfide gas.
This happens when the strain either degrades the amino acid cysteine during protein degradation, or
when anaerobic respiration shuttles the electrons to sulfur instead of to oxygen.  In the SIM
tubes, the medium contains casein and animal proteins as amino acid sources, sodium thiosulfate as
a source of sulfur and ferrous ammonium sulfate as the H2S indicator. Cysteine is a sulfur
containing amino acid present in the SIM medium.
The enzymes cysteine desulfurase and thiosulfate reductase catalyze hydrolysis reactions that
produce H2S. This gas combines with the ferrous ammonium sulfate forming an insoluble, black
ferrous sulfide precipitate. The black color thus acts as an indicator for the presence of hydrogen
sulfide.
In the laboratory, a fresh culture of the organism is inoculated with a single stab using straight
needle through the center of the medium. Following incubation, the tube is observed for H2S
production (blackening of the medium).

Tvorba sirovodíku

Některé mikroorganismy mají schopnost redukovat síru obsahující látky na H2S. Mnohé metody
používané k detekci sirovodíku produkovaného mikroorganismy se liší ve zdrojích síry a solí kovů
používaných pro indiakci sirovodíku – vždy tedy používáme sloučeniny železa a síry pro detekci
sirovodíku.
Sirovodík je produkován bakteriemi redukcí aminokyselin obsahujících síru – cisteinu, methioninu
nebo redukcí anorganických látek obsahujících síru jako thiosulfáty, sulfáty, sulfidy během
degradace proteinů nebo při anaerobní respiraci a přenosu e- na síru místo na kyslík.
V tomto testu sirovodík (plyn) reaguje se sloučeninami železa a tvoří tmavý precipitát sulfidu
železitého. Tmavá barva je indikátorem sirovodíku.
Používá se pro detekci sirovodík produkujícíích bakterií: Salmonella, Proteus
Obdoba HE agaru

Indolový test
Přeměna tryptofanu na indol (detekce Kovaczovým činidlem)
Escherichia (+) od Enterobacter, Salmonella (-), Preteus vulgaris (+) od P. mirabilis (-)
Tryptophan is an amino acid that can undergo deamination and hydrolysis by bacteria that express
tryptophanase enzyme. Indole is generated by reductive deamination from tryptophan via the
intermediate molecule indolepyruvic acid. Tryptophanase catalyzes the deamination reaction, during
which the amine (-NH2) group of the tryptophan molecule is removed. Final products of the reaction
are indole, pyruvic acid, ammonium (NH4+) and energy. Pyridoxal phosphate is required as a
coenzyme.
When indole is combined with Kovac’s Reagent (which contains hydrochloric acid and
p-dimethylaminobenzaldehyde in amyl alcohol) the solution turns from yellow to cherry red. Because
amyl alcohol is not water soluble, the red coloration will form in an oily layer at the top of the
broth.

Indolový test
Přeměna tryptofanu na indol (detekce Kovaczovým činidlem)
Kovaczovo činidlo: obsahuje HCl a p-dimethylaminobenzaldehyd v amylalkoholu
Escherichia (+) od Enterobacter, Salmonella (-), Preteus vulgaris (+) od P. mirabilis (-)
Tryptofan je aminokyselina, která je deaminována a hydrolyzována bakteriemi exprimujícími
tryptofanázu. Indol je tvořen reduktivní deaminací (odštěpením -NH2) z tryptofanu přes meziprodukt
indolpyruvát. Produktem reakce je indol, pyruvát a amoniový kation. Jako konezym je využíván
pyridoxal fosfát.
Když vzniká indol v prostředí Kovaczova činidla, roztok mění barvu ze žluté na třešňově červenou.
Protože amylalkohol  v Kovaczově činidle není rozpustný ve vodě, změna barvy probíhá v olejové
vrstvě na hladině média.

Phenylalanine deaminase test also known as phenylpyruvic acid (PPA) test is used to test the
ability of an organism to produce enzyme deaminase.  This enzyme removes the amine group from the
amino acid phenylalanine and produces phenylpyruvic acid (PPA) and ammonia i.e. oxidative
deamination of phenylalanine. Phenylpyruvic acid reacts with ferric iron (10% ferric chloride is
added in the medium) producing a visible green color.
Fenylalanindeaminasa
Deaminace za tvorby fenylpyruvátu, který reaguje s Fe3+
Charakterizace rodu Proteus

Test na fenylalanindeaminázu
Deaminace fenylalaninu za tvorby fenylpyruvátu, která reaguje s Fe3+
Charakterizace rodu Proteus
Je to test na produkci enzymů deamináz.
Odnětí NH2 skupiny z fenylalaninu za vzniku fenylpyruvátu a amonného kationtu, jedná se tedy o
oxidativní deaminaci fenylalaninu.
Pyruvát následně reaguje s Fe3+ ionty – přídavek 10% FeCl3 do média), přičemž se tvoří zelené
barvivo.
Pozitivně reaguje Proteus sp., Morganella sp., Providenica sp.

Oxidasový test
Oxidace alternativních akceptorů elektronů cytochromem c (přítomnost c oxidasy)
Pseudomonas (+) od Enterobacteriaceae (-)
The oxidase test is designed for specifically detecting the presence of the terminal enzyme system
in aerobic respiration called cytochrome C oxidase or cytochrome a3. Cytochrome C oxidase is the
terminal or last H2 electron acceptor in aerobic respiratory mechanism which is composed of a
number of enzymes which alternatively oxidize and reduce each other by donating or accepting
electrons derived from H2.

Coagulase test is used to differentiate Staphylococcus aureus (positive) which produce the enzyme
coagulase, from S. epidermis and S. saprophyticus (negative) which do not produce coagulase.
i.e Coagulase Negative Staphylococcus (CONS).
Principle of Coagulase Test
Coagulase is an enzyme-like protein and causes plasma to clot by converting fibrinogen to
fibrin. Staphylococcus aureus produces two forms of coagulase: bound and free.
Koagulasa
Strážení krevní plasmy
S. aureus (+) od S. epidermidis (-)

Test na koagulázu
Strážení krevní plasmy
S. aureus (+) od S. epidermidis (-)
Slouží k rozlišení S. aureus (pozitivní, produkující koagulázu) od S. epdiermidis a saprophyticus
(negativní, neprodukující). Hovoříme pak o koaguláza pozitivních a negativních stafylokocích.
Koaguláza způsobuje srážení plasmy konverzí fibriongenu na fibrin.

Produkce katalasy
Rozklad peroxidu vodíku katalasou
Bacillus (+) od Clostridium (-), Streptococcus (-) od Micrococcus a Staphylococcus (+)
Result Interpretation of Catalase Test and Examples
The enzyme catalase mediates the breakdown of hydrogen peroxide into oxygen and water. The presence
of the enzyme in a bacterial isolate is evident when a small inoculum is introduced into hydrogen
peroxide, and the rapid elaboration of oxygen bubbles occurs. The lack of catalase is evident by a
lack of or weak bubble production. The culture should not be more than 24 hours old.
Bacteria thereby protect themselves from the lethal effect of Hydrogen peroxide which is
accumulated as an end product of aerobic carbohydrate metabolism.

Rozklad peroxidu vodíku katalasou
Bacillus (+) od Clostridium (-), Streptococcus (-) od Micrococcus a Staphylococcus (+)
Kataláza rozkládá peroxid vodíku na kyslík a vodu. Rozklad je potřebný, protože peroxid vzniká jako
toxický produkt při aerobním metablismu cukrů.
Test probíhá tak, že přeneseme malé množství bakt. izolátu (kultury) do roztoku peroxidu vodíku,
přičemž se začnou uvolňovat bubliny kyslíku. Nepřítomnost katalázy: pouze mírná nebo žádná produkce
bublin.

Zkapalňování želatiny
Zkapalnění želatiny proteasami
Identifikace Serratia, Pseudomonas, Flavobacterium, Clostridium
Hydrolýza škrobu
Detekce rozkladu pomocí jodu
Identifikace Bacillus
Ureasa
Štěpení močoviny na amoniak a CO2 (alkalizace)
Klebsiella (+) od Escherichia (-), Proteus (+) od Providencia (-), identifikace Helicobacter pyroli
(+)
Lysin-, ornitin- a arginindekarboxylasa
Dekarboxylace aminokyselin za tvorby CO2 a aminu (alkalizace média)
Enterobakterie
Redukce dusičnanů
Dusičnan jako alternativní akceptor elektronů, redukce na dusitan nebo dusík
Identifikace enterobakterií (obvykle +)

Využití standardizovaných testovacích systémů
-urychlení zpracovávání velkého množství identifikovaného materiálu a odstranění nesrovnalostí v
určování (rozdíly v přípravě médií, provedení/hodnocení testů...), jsou vyráběny standardizované
diagnostické soupravy.
-reprezentativní soubory biochemických testů:
1.používají mikrometody, šetří materiál, energie
2.v jedné diagn. soupravě je 10 – 20 testů (i víc)
3.testy jednoduché, snadno proveditelné
4.přiložené diagnostické tabulky k urychlení interpretace výsledků
5.dodávající firmy zaručují možnost konzultací sporných výsledků
6.dlouhá skladovací lhůta
7.
-soupravy biochem. obsahují vysušená média v mikrotitračních deskách, do kterých se kapou suspenze
test. bakterií.
-soupravy (Lachema Brno):
-ENTEROtest a ENTEROrapid (Enterobacteriaceae)
-ANAEROtest (anaeroby)
-STAPHYtest (stafylokoky a mikrokoky)
-STREPTOtest (streptokoky a enterokoky)
-NEFERMtest (G- nefermentující tyčky)
Pro vyhodnocení: diferenciační tabulky nebo vhodný software (např. TKW)

ENTEROtest 24
Princip metody:
Diagnostická souprava ENTEROtest 24 je určena pro definitivní identifikaci bakterií z čeledi
Enterobacteriaceae a Vibrionaceae do 24 hodin. Souprava obsahuje 24 biochemických testů umístěných
na třech řádcích (trojstripu) dělené mikrotitrační destičky.
https://www.erbalachema.com/images/produkty/galerie/img-5606-130429095132.jpg
https://www.erbalachema.com/images/produkty/galerie/img-5620-130429100025.jpg
https://www.erbalachema.com/images/produkty/galerie/img-5714-130429100025.jpg

Pro vyhodnocení lze využít program TNW, který u vybraného výsledku vypočte identifikační skóre a T
index. Identifikační skóre je míra výlučnosti identifikace, procento pravděpodobnosti, že kmen
náleží právě k tomuto taxonu (druhu) a žádnému jinému: > 99 % je výborné odlišení; 96-99 % značí
velmi dobré odlišení; 90-96 % kmen je odlišen a < 90 % značí neodlišený kmen. T index určuje
typičnost identifikovaného kmene vzhledem k vypsanému taxonu. Čím vyšší T index, tím podobnější je
daný kmen obecné charakteristice daného taxonu: > 75 typický kmen; 0,5-7,75 méně typický kmen;
0,25-0,5 netypický kmen; < 0,25 zcela netypický kmen. Pro atypický kmen program TNW doporučí další
rozlišující testy, případně ukáže nestandardní výsledky.







Disková difuzní metoda
Stanoví citlivost nebo resistenci podle toho, zda vyšetřovaná bakterie na agarové půdě vytvoří nebo
nevytvoří přípustnou inhibiční zónu kolem disku s určitou koncentrací antibiotika po předepsané
době inkubace
Půdy: Mueller Hinton agar (MHA) – nejpoužívanější, nízký obsah antagonistů antibiotik, MHA+5% ovčí
krve – pro náročnější bakterie (pneumokoky, streptokoky, meningokoky)
Obohacené půdy pro některé náročnější bakterie – hemofily
Antiobitické disky:
Sestavy antibiotik podle vyšetřované bakterie (doporučené sestavy – NRL pro antibiotika)
Základní a rozšířené řady
Sestavy antibiotik podle klinického materiálu
Terapeutické disky, diagnostické disky
Testy citlivosti na antibiotika

Disková difuzní metoda
Inkubace 18 -24 h při 36 °C
Aerobní, anaerobní, mikroaerofilní (5% CO2) protředí
Hodnocení inhibiční zóny – porovnání s hraničními hodnotami pro citlivé kmeny
Kvalitativní i kvantitativní hodnocení
U některých kmenů nestačí, nutno vyšetřit MIC nebo MBC
MIC = minimální inhibiční koncentrace (nejnižší koncentrace antibiotika, která je schopna zastavit
růst bakterie)
MBC = nejnižší koncentrace antibiotika schopna usmrtit bakterie (bakteriocidní)

Disková difuzní metoda



Diluční mikrometoda
Hodnotí se MIC v jamkách mikrotitrační destičky, které obsahují zvolené koncentrace antibiotik v
bujónu
MIC = první nezkalená jamka mikrotitrační destičky

E test (antimikrobiální gradientová metoda)
Plastový proužek napuštěný antibiotikem ve stoupající koncentraci
MIC se odečítá v místě, kde inhibiční zóna protíná proužek
Figure 2




Fagotypizace
•typizace bakterií na základě citlivosti k různým bakteriofágům
•zařazení do tzv. fagotypu: skupina kmenů citlivých k určitému fágu/skupině fágů
•polyvalentní fág 812 a jeho mutanty v rozmezí hostitele (Staphylococcus)
•typizační sada pro koaguláza-negativní kmeny stafylokoků (fágy Ph- a U- série)
•
Diagnostické metody založené na bakteriofágách

•Bakteriofágy s fluorescenčně značenou DNA (po adsorpci, injekci udílí buňce fluorescenční fenotyp)
•Fluorescenčně značené fágové komponenty  (endolyzin, bičíková vlákna, kapsidy)
•Fágem integrované reportérské geny (mění fenotyp infikované bakterie)
1.kolorimetrické: lacZ gen – štěpení o-nitrofenyl-beta-galaktozidu na žlutý o-nitrofenol
2.fluorescentní: gen pro GFP
3.bioluminiscentní: luciferázové reportérské geny (bakteriální lux, světluškový luc)
•Fágy s navázanými kvantovými tečkami (quantum dots)
Detekční systémy založené na chemicky/geneticky upravených bakteriofágách

Co to jsou kvantové tečky (quantum dots, QDs)?
Jedná se o polovodičové částice o velikosti několika nm, které mají optické a elektronické
vlastnosti odlišné od makroskopických částic z důvodu zákonů kvantové mechaniky. Při excitaci např.
UV světlem přechází elektrony kvantové tečky z valenčního pásma na vodivostní pásmo. Excitovaný
elektron se pak vrací zpět do valenčního pásma, přičemž uvolňuje energii vyzářením světla.
QDs se někdy označují jako umělé atomy, protože se vyznačují diskrétními elektronovými stavy a
pásmy jako přirozené atomy nebo molekuly. TAké elektronové vlnové funkce QDs připomínají vlnové
funkce reálných atomů.
QDs mají vlastnosti na pomezí makroskopických polovodičových částic a diskrétních atomů nebo
molekul. Jejich optoelektronické vlastnosti se mění jako funkce velikosti a tvaru. Větší QDs 5-6 nm
emitují delší vlnové délky (oranžová – červená). Menší QDs 2-3 nm emitují kratší vlnové délky
(modrá – zelená).

POPO-1
Fluorescenčně značené fágy pro monitoring přirozených populací mořských bakterií


Bakteriofágy s navázanými kvantovými tečkami pro vysoce citlivou detekci bakterií



Fluorescenčně značené fágy (P22) pro detekci bakteriálních druhů (Salmonella)



Využití značených bakteriofágů pro detekci patogenů v potravinách



Využití značených bakteriofágů pro detekci patogenů ve vodě



Využití značených bakteriofágů pro diagnostiku bakterií v klinicích vzorcích