Téma 06_ Diagnostické metody založené na biosenzorech https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0003267017307857-fx1_lrg.jpg Biosenzor •Cílem je zjednodušit práce spojené s analýzou vzorku, dospět k přenosným systémům a zrychlit průběh stanovení. • •Zařízení, které převádí fyzikální nebo chemický signál na signál elektrický a jehož součástí je biologický materiál vzorek biorekogniční vrstva převodník (transducer) elektronická jednotka výstupní signál http://netcode.cz/img/188/wii-bio-senzor.jpg http://www.lekarna-doktorka.cz/pharmdata/obrazek.php?pdk=2740901 http://sorinonline.com/wp-content/uploads/2012/09/biosenzor.jpg The Fiber-optic Biosensor. http://farm9.staticflickr.com/8160/7639694222_132bae7d35_b.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/87/Glukometr_OT.jpg/220px-Glukometr_OT.jpg http://files.labtechnik.webnode.cz/200001183-d5efad65de/gpetSMALL.jpg http://www.temnakomora.cz/uploaded_files/1466_20100225142821.jpg https://www.growgarden.cz/482-818-medium/pipeta-kapatko-3ml.jpg Přímý kontakt se vzorkem Měření v nádobce Průtočné měření Průtočná cela Biorekogniční vrstva Rozpoznává stanovovanou látku Biokatalytická reakce (specifická přeměna): enzym, organela, buňka Bioafinitní reakce (specifická vazba): protilátka, nukleová kyselina (aptamer), receptor, bakteriofág Imobilizace molekul na povrch převodníků Biosenzorové materiály: kovy, křemík, uhlík a kompozitní materiály Membrány pro biosenzory: imobilizace biorekogničních molekul, řízení transportu látek (difuze, selektivita), zajištění mech. stability a biokompatibility Hrubě porézní (pory nad 5 nm): např. skleněná frita, permeabilitu ovlivňuje rozdíl hydrostatického tlaku na obou stranách, osmot. tlak se neuplatňuje, špatná permselektivita (projde vše) Jemně porézní (pory 1 až 5 nm): např. acetylcelulosa, difuze, permeabilita dána velikostí rozpuštěných látek Neporézní: rozpouštědlo prochází difuzí Mechanická imobilizace biomolekul: zejména pro biokatalytické senzory - mechanické zachycení: kápnutí roztoku biokomponenty + zakrytí dialyzační membránou (celulosa, acetylcelulosa, polykarbonáty) - adsorpce: někdy ve spojení s povrchem grafitu, reverzibilní proces na bázi hydrofobních interakcí, iontových sil, vodíkových můstků) Zachycení v gelu: inkluze biomolekuly uvnitř struktury membrány Polyakrylamid: směs akrylamidu, methylen-bis(akrylamidu) a enzymu, iniciace UV Želatina: často pro enzymové membrány. 5% želatina nabobtnat ve vodě a přidá se enzym, nechá se vyschnout, přiložit na povrch převodníku, překrýt dial. membránou Nafion: pro tvorbu permselektivních membrán, také funguje jako inotoměnič akukumulující kationty a odpuzující anionty Polyvinylalkohol (PVA): hydrofilní, neutrální, biokompatibilní, zesíťováním se tvoří polymer. Radiační polymerace ozáření směsi oligomerů a enzymu gama zářením (možnost poškození biomolekul). Pro chemické zesíťováníé PVA se používají triisokyanáty TIC, které spojují postranní hydroxyly PVA HEMA (poly (2-hydroxyethylmethakrylát): hydrofilní, biokomp. polymer. Směs s vodným roztokem enzymu se nechá zmrazit -80°C, poté polymerace gama zářením. Možnost poškození biomolekul Polyurethany (PU): vychází se z oligomerů (50 kDa), v přítomnosti enzymu se síťují difenylmethan diisokyanátem Zajímavou a úspěšnou kombinací jsou speciální polymery kombinujcící funkci imobilizace eznymu s polymerní strukturou nesoucí skupiny mediátorů přenášející elektrony, tzv. redox relays. Výchozím materiálem je poly-4-vinylpyridin. Ten se částečně využije pro tvorbu komplexu s osmiem (mediátor), a částečně se do něj kvarterizací zavedou reaktivní aminoskupiny. Pak se směs modifikovaného oligomeru, enzymu a bifunkčního PEGDE nanese na povrch grafitové elektrody, kde se vytvoří biovrstva nesoucí uvniř struktury fixované molekuly mediátoru Zesíťování biomolekul: membránu lze vytvořit přímo z molekul enzymu či jiných bílkovin jejich zesíťováním vhodným bifunkčním činidlem, nejčastěji glutaraldehydem Kovalentní imobilizace biomolekul Pracovní povrch senzorů: sklo, křemík, modifikace uhlíku (grafit, skelný uhlík, kompozitní směsi), ušlechtilé kovy (Au, Pt) Imobilizaci nutno zajistit kovalentní vazbou Úprava povrchu senzorů 1.Silanizace: aktivace povrchu kontaktní vrstvou silanu (gama-aminopropyltriethoxysilan APTES nebo APTS a glycidoxypropyltriethoxysilan GOPS 2. 2. 2. 2. 2. 2. Spontánní tvorba monovrstev: pevné adsorpce thiosloučenin (thioly , disulfidy) na povrch Au, Pt a Ag Bis(N-hydroxysukcinimidester kys. 3,3´-dithiopropionové DSP Navázání biomolekul: předpokládá se vazba biomolekuly na některou z následujících funkčních skupin - 1. Aminoskupina: glutaraldehyd, chloranil, diazotační reakce 2. Karboxyskupina: karbodiimidy, vznik amidové, sestrové či thioesterové vazby DCC (dicyklohexylkarbodiimid) ve vodě nerozpustný (provádět v DMFO) EDC (1-ethyl-3-(3-dimethyladminopropyl)-karbodiimid CMC (1-cyklohexyl-3-(2-morfolinoethyl)-karbodiimid methoxy-p-toluensulfonát Citlivější bílkoviny: pomocí karbodiimidů a N-hydroxylsukcinimidu NHS, nebo přes směsné anhydridy 3. Hydroxyskupina: pro imobilizace na povrchy modifikované sacharidovou vrstvou (dextran) - aktivace epichlorhydrinem, bromkyanem (jedovatý), triazinová metoda oxyranová cykloadice biomolekul přes NH2- nebo OH- Biokatalytické senzory Elektrochemické převodníky -referentní elektrody, pomocné elektrody, pracovní elektrody - Potenciometrické elektrody: -změna potenciálu vyvolaná akumulací náboje na rozhraní elektrody a roztoku -převodník: iontově-selektivní elektroda (ISE) s enzymovou vrstvou -využití hlavně pro enzymové senzory -rozsah měřitelných koncentrací závisí na ISE: 10 uM až 0,1 M, obvykle však 0,1 až 10 mM -měří se potenciál pracovní elektrody proti referentní elektrodě, v systému přitom neteče proud Amperometrické bioelektrody -poskytují jako signál proud, který je úměrný koncentraci analytu. -proud se měří při konstantním napětí pracovní elektrody -velikost proudu prošlá za daný čas v systému pak udává náboj, který odpovídá molárnímu množství látky přeměněné na elektrodách. -elektrochemická oxidace na anodách -redukční děje na katodách - Biosenzory na bázi elektrod pro kyslík a peroxid vodíku -raný typ biosenzorů typu enzymových elektrod, kyslíkové elektrody (Clarkovy) -membrána propustná pro kyslík (teflon, polypropylen, polyethylen - -Katodická redukce kyslíku: - - - -Anodická oxidace peroxidu vodíku: - Enzymy oxidázy – jako biorekogniční element -oxidace molekuly substrátu (analytu) za účasti kyslíku, vzniká peroxid vodíku nebo voda - - Enzymy dehydrogenázy – jako biorekogniční element -katalyzují redoxní reakce s účastí NAD(P)+/NAD(P)H párů - - -Pro elektrochemickou detekci NADH je použitelná amperometrická reoxidace vznikajícího NADH. Konduktometrické převodníky -použití střídavého napětí na pracovní elektrodě (protii stejnosměrného u elektrochemických technik) -měření vodivosti je málo specifické, takže se může uplatnit jako univerzální typ převodníku. -Sledování změn vodivosti při biochemických reakcích vyžaduje produkci či spotřebu iontů nebo jiné změny (změna velikosti nabitých částic) -produkce iontů je velmi často spojena s účinkem hydroláz a amidáz, změnu velikosti nabitých částic zase vyvolává účinek fosfatáz, fosfatáz a nukleáz. -např. stanovení močoviny pomocí reakce ureázy: - - - problém je vlastní vodivost prostředí, nutno používat málo vodivé pufry (např. imidazol) Kalorimetrické biosenzory (toto už není elektrochemie) -využívají změny teploty v průběhu enzymatických reakcí. -spíše okrajová záležitost, meze detekce do 10 uM, rozlišení 0,001 °C - - Dva nejběžnější enzymové biosenzory 1.Glukometr -stanovení glukosy v krvi (diabetes) -praktický lineární rozsah do 20 mM a LOD 0,1 mM -imobilizovaný enzym: glukóza oxidáza (A. niger, Penicilium notatum) se dvěma PAD kovalentně vázanými na podjednotky -nebo glukóza dehydrogenáza (NAD+ dependentní) -dnes také PQQ-dependentní glukóza dehydrogenáza z Acinetobacter calcoaceticus (PQQ je koenzym pyrolochinolinochinon) – snadný přenos elektronů na mediátor (ferrocen) -dále také pyranóza oxidáza, reaguje i s dalšími sacharidy - 2. Biosenzor pro stanovení ethanolu -v nápojích a také u řidičů z dechu -výhradní užití alkohol oxidázy z kvasinky Pichia pastoris -specifická aktivita kolem 40 IU/mg Optické enzymové systémy -využití planárních světlovodů nebo optických vláken -přímé a zprostředkované -u přímého typu se opticky měřená látka (nejčastěji fluorofor) přímo vyskytuje v biokatalytické reakci (měříme např. NADH (pro stanovení alkoholu), nebo FADH. NADH je slabý fluorofor, kvant.výtěžek = 0,02, ex/em = 350/450 nm -biorekogniční element jsou dehydrogenázy imobilizované před koncem optického vlákna -zprostředkované: využívají optické indikátory (nejčastěji pro pH a kyslík) -detekce kyslíku: zhášení fluorescence (kyselina pyromáselná, perylen, dekacyklen, organokovové komplexy ruthenia) -pH změny pomocí acidobazických fluorescenčních indikátorů (1-hydroxypyren-3,6,8-trisulfonová kyselina, nebo 4-methylumbelliferon - Chemiluminisence: -pro detekci peroxidu vodíku se používá luminol, peroxyoxaláty nebo akrydinové soli Bioluminiscence: -využití luciferázy - Bioafinitní senzory Využívají jako biorekogniční složku biomolekuly, tvorba biokomplexu s molekulou analytu. Antigen Antigen Protilátka Bioafinitní senzory jeden z afinitních partnerů imobilizován na povrchu převodníku •přímé afinitní biosensory -vznik biokomplexu je možné sledovat přímo v průběhu afinitní interakce (v reálném čase) -jako převodníky slouží speciální optické světlovodné systémy nebo piezosensory - • nepřímé afinitní biosensory - jeden z afinitních partnerů je vhodně označen, na konci interakce se pak stanoví množství značky navázané na povrchu sensoru Sensors 13 01763f2 1024 Převodníky pro přímé afinitní senzory •vznik biokomplexu průběžně v reálném čase bez pomocí značek •jeden reakční partner je imobilizován na povrchu převodníku, druhý je volně v roztoku, průběžně se sleduje vazba na citlivém povrchu •měřený signál odráží pouze změny na povrchu sensoru a v jeho těsné blízkosti •optické převodníky •piezoelektrické převodníky • •použitelné pro imunosenzory, DNA-senzory, fágové senzory atd. Odraz světla od vhodného povrchu. Při totálním odrazu světla proniká část energie ve formě exponenciální vlny (zhášivá vlna, evanescentní vlna) do spodních vrstev, což se využívá při studiu povrchových jevů n2 > n1 Evanescentní vlna Exponenciální vlna: šíření světla světlovodem – interference mezi dopadajícícm a odraženým paprskem – vznik elmag. stojatého vlnění, tzv. exponenciální vlna Odraz světla od vhodného povrchu. Při totálním odrazu světla proniká část energie ve formě exponenciální vlny (zhášivá vlna, evanescentní vlna) do spodních vrstev, což se využívá při studiu povrchových jevů Refraktometrický převodník – změna extiknč. koef, indexu lomu Zvýšení citlivosti zavedením afinitních převodníků Localized surface plasmon - Wikipedia Povrchová plasmonová rezonance Interakce exponenciální vlny s látkami na vnějším povrchu senzoru (změny indexu lomu v poli exp. vlny vyvolané navázáním biomolekul na citlivý povrch) Změna podmínek pro šíření světla v optickém systému Kvantifikace podle změn intenzity nebo fázového posunu vedeného světla, které jsou úměrné množství povrchově navázané látky Full-size image Povrchová plasmonová resonance („surface plasmon resonance“) https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d5/Surface_Plasmon_Resonance_%28SPR%29.jpg SPR - video https://www.youtube.com/watch?v=sM-VI3alvAI IOS (INTEGRATED OPTICAL SENSOR) – výstupní mřížka -citlivá oblast je umístěna v oblasti refrakční mřížky pro výstup světla z planárního světlovodu -paprsek se zavede do světlovodu pomocí čočky, v oblasti difrakční mřížky vystupuje patrsek pod uhlem α -po výstupu ze senzoru se svazek paprsků pomocí čočky sleduje pomocí detektoru citilivého na změnu pozice Piezoelektrické biosenzory Piezoeletrický efekt V anizotropních krystalech (křemen, turmalín, Rochellova sůl) vzniká při mechanickém namáhání elektrické napětí. Pokud se na krystal přivede střídavé napětí o vhodné rezonanční frekvenci, začne krystal se stejnou frekvencí vibrovat. Piezoelektrické biosenzory Po navázání látky na povrch elektrod dojde ke změně rezonanční frekvence. Změní se hmotnost celého systému a vibrace se zpomalí – frekvence poklesne. http://www.peta.unas.cz/biosenzory/Biosenzory_soubory/obrazky/piezo.gif Nepřímé afinitní senzory Použití vhodného značkového systému: fluorescence, chemi/bio-luminiscence, enzym Průběh heterogenní: 1. komplex je zachycen na vhodném povrchu (citlivá oblast převodníku), 2. po proběhnutí reakce se odstraní reakční směs, 3. povrch se promyje, 4. změří se množství zachycené značky Výchozí metoda: ELISA, FIA, CLIA Imunosenzory •Imunochemické afinitní biosenzory používající jako biorekogniční element protilátky Imobilizace protilátky na biočip Imobilizace různých protilátek na biočip Elektrochemické imunosenzory Spojení jednoduchého, levného, velmi citlivého elektrochemického převodníku s vysokou specifitou protilátky Pracovní povrch: pracovní elektroda nebo výměnná membrána s imobilizovanou protilátkou Značka: enzymy (aktivitu měříme elektrochemicky) nebo redox aktivní látky a cheláty kovů (po uvolnění z komplexu se stanoví voltametricky) Elektrochemické imunosenzory Heterogenní stanovení •elektroda je modifikována protilátkou •váže tracer při kompetitivním stanovení •zachycená enzymová aktivita se pak stanoví po přídavku substrátu: -amperometricky (změna proudu) -potenciometricky (změna potenciálu) S P e- S P e- Amperometrické stanovení peroxidáza (peroxid vodíku + jodid, ferrocen nebo hydrochinon) laktáza (kyslík + hydrochinon) kataláza (peroxid vodíku) glukóza oxidáza (kyslík nebo ferrocen + glukóza) alkalická fosfatáza (p-aminofenylfosfát) galaktosidáza (p-aminofenyl-beta-D-galaktosid) acetlycholinesteráza (acetylcholin) Potenciometrické stanovení ureáza (močovina) Značky: fluorescenční, luminiscenční Zdroj světla: laser, světlo emitující diody, výbojky či lampy Detektor: fotonásobič, fotodiody Nepřímé optické imunosenzory Fluorescenční značky pro nepřímé optické imunosenzory fluorescein, tetramethylrhodamin cyaniny Cy5, Cy3 QD „quantum dots“ Fluorescencence capillary fill device (FCFD) Afinitní imunosenzor využívající k detekci fluorescenční značku, která emituje světlo do planárního světlovodu Odlišení volného a vázaného fluoroforu Biosenzory na bázi nukleových kyselin -nejen k diagnostickým účelům, ale i rychlejší sekvenační metody, detekce mutací a poškození DNA při analýze genetických chorob -kombinací s PCR získávají tyto typy senzorů vyšší citlivost (vývoj křemíkových čipů, na kterých přímo běží PCR) -pro analýzu se využívá hybridizace vzorku s komplementární sekvencí (sondou, próbou), která je navázána na citlivém povrchu biosenzoru jako biorekogniční prvek -průběh hybridizace a její kvantitativní rozsah vyhodnocuje fyzikálně-chemický převodník: 1) elektrochemický a nebo 2) optický - Elektrochemické biosenzory pro DNA - založena na elektrochemické (elektrolytické) oxidaci/redukci určitých skupin v molekulách bazí -v průběhu elektrolýzy dochází k oxidaci/redukci určitých skupin bazí v nukleových kyselinách -typické metody pro stanovení: cyklická voltametrie, diferenciální pulzní polarografie, adsorpční přenosová voltametrie, chronopotenciometrie -obecně pro všechny tyto metody: elektrochemická odezva klesá pro dsDNA, kdy jsou báze párovány, a tedy méně přístupné pro přenos elektronů. Elektrochemické přeměny nastávají u DNA adsorbované na povrch elektrody -Diferenciální pulzní polarografie: signál ssDNA (III) je mnohonásobně vyšší než dsDNA (II), a jeho velikost ukazuje na změny stavu dsDNA (studium poškození DNA) -Chronopotenciometrie: mezi pracovní a pomocnou elektrodu se přivede konstantní proud a měří se časová změna potenciálu mezi prac.a ref. elektrodou -Odezva je dána konc. změnami látek v okolí elektrody v průběhu elektrolýzy -Záznam potenciálu na čase se matematicky transformuje – signál s oddělenými maximy. -Principem je pokles elchem signálu oxidace guaninu po vytvoření dsDNA Indikátory hybridizace -využivá se vazby indikačních molekul na ds DNA, umožňují citlivou detekci průběhu hybridizace -interkalátory: váží se dovnitř dsDNA mezi sousední páry bazí (ethidium, propidium, proflavin, chloroquin, doxorubicin. -vazba do malého žlábku: netropsin, [Co(2,2´-bipyridyl)3]3+ -interakce oběma způsoby: DAPI -povrchová interakce se záporně nabidou kostrou: neuvyžívá se -Měření: (I) imobilizace proby na porvrch elektrody adsorpcí, (II) hybridizace se vzrokem, (III) vazba indikátoru, (IV) elektrochemické měření (např. chronopotenciometrie) -Možno též optické převodníky (optická vlákna): detekce fluorescence indikátorových molekul, nebo SRP (bez fluoroforu), nebo piezoelektrické senzor Hybridizační sekvenace Využití kombinatorických přístupů Analyzovaná sekvence se nechá hybridizovat se souborem krátkých prob (6 až 20 bazí), který obsahuje všechny možné kombinace stejné délky sestavených ze 4 bazí Podle toho, se kterými probami DNA hybridizuje, se usuzuje na přítomnost známé krátké sekvence v jejím řetězci Pomocí překrývajících se úseků pak rekonstruujeme celou sekvenci. Probíhá na křemíkovém čipu, rychlé stanovení (minuty) Vyhodnocení: fluorescenční sonda na analyzovanou DNA, nebo indikátor hybridizace. Detektor: CCD kamera, počítačové vyhodnocení, rekonstrukce sekvence Biočipy pro afinitní senzory •Imobilizace protilátek, receptorů, ligandů, nukleových kyselin, uhlovodíků, látek s určitými biologickými vlastnostmi (kationty, anionty, látky s hydrofilním/fobním povrchem) •Některé mají nízkou specifitu a vážou celé skupiny proteinů, jiné jsou vysoce specifické •Stacionární vs. průtočné uspořádání •Výroba: mikroelektronické technologie: sítotisk, litografie, nanotechnologie DNA chips microfluidic surface plasmon resonance fluorescent probes Schematické znázornění principu mikročipových/microarrayových technologií Biočipy založené na bakteriofágách Mikročip pro studium interakce virus-hostitel Multi-analytové mikročipy (arrays) detekce a identifikace mnoha antigenů v jediném stanovení Aplikace mikročipů pro studium vztahů virus-hostitel Aplikace mikročipů pro detekci biomarkerů infekce v séru pacienta sandwich upořádání protilátka-biomárker-protilátka Mikročip pro detekci protilátek proti mnohočetným patogenům v lidském séru Mikročip (tzv. multiplex microarray) pro detekci mnohočetných patogenů v liském séru) microfluidic protein biochip Mikrofluidní (průtočné) senzory/mikročipy Průtoková injekční analýza (FIA) -nástřik vzorku do toku nosného média a jeho definované naředění – disperze -disperzní faktor (D) dán poměrem původní koncentrace vzorku a maxima koncentrace v zóně vzorku procházející detektorem, D = C0/Cmax -FIA je tvořena pumpou P, vedením pro nosné médium C (carrier) a pomocným reagentem (R, referenční) -po nástřiku vzorku (S, sample) pomocí injekčního ventilu V se obě větve spojí, smíchají v míchací smyčce MC (mixing coil) a nakonec prochází detektorem D do případného odpadu W (waste) -vedení kapaliny: hadičky (vnitřní průměr 0.5 až 1 mm), polypropylen, teflon, PVC, silikonová guma -pumpa: peristaltická, tvořena krokovým motorem, ten otáčí diskem, který má lna obvodu několik otočných válečků rolerů, které tlačí na pružnou hadičku, a tak vytlačují kapalinu -ventily: pro nástřik vzorku -detektor: klasický (chemický, fotoemtrický, fluorometrický či elektrochemický, nebo je detektorem přímo biosenzor (biokatalytický, afinitní...) -poloha detektoru vzhledem k proudícícmu médiu: (A) detektor pralelně s tokem média, (B) v ústí trubičky – pro elektrochem. detekci, (C) kaskádové, (D) wall-jet cela -signál je buď maximum nebo plocha píku odpovídající zóně vzorku prošlé detektorem. - Two-line Single-line Zone sampling Splitted flow Splitted flow s představěným bioreaktorem: rozdělení vzorku na dvě linie, jedna projde bioreaktorem. Před vstupem do detektoru se obě větve spojí, na záznamu jsou dvě maxima. Stanovení 2 reagentů vedle sebe: sacharóza a glukóza ve vzorku: detektor je biosenzor s imobilizovanou glukosa oxidasou, v bioreaktoru je imobilizována invertáza s mutarotázou. První pík je volná glukóza, druhý pak navíc glukóza vzniklá v reaktoru ze sacharózy. Závěr •zjednodušení práce spojené s analytickými metodami •zrychlení analýzy •zpřístupnění analýzy v provozech a oblastech mimo výzkum (např. pacient, jatka) •přenosné systémy, možnost analýzy v terénu •rychlá detekce mnoha analytů v jediném stanovení •minimální nebo žádné zpracování vzorku před analýzou •Studium kinetiky afinitních interakcí