Úvod do molekulární medicíny C7188 doc. Mgr. Jiří Šána, Ph.D. podzim 2024 1. Definice, náplň a historie oboru C7189 Úvod do molekulární medicíny – cvičení Čtvrtek 10:00 – 12:50 (3 kredity) 1. Úvod, návrh grantových projektů, hodno7cí proces AZV 2. Izolace RNA, měření koncentrace a kontrola kvality 3. Sekvenování nové generace, základy zpracování dat 4. qPCR 5. BiostaQsQka – GraphPad, JMP 6. KulQvace buněk a tvorba růstových křivek 7. Design in vitro studií & CRISPR/Cas9 & BioinformaQka 8. Transientní transfekce & Testy viability a migrace 9. Průtoková cytometrie – buněčný cyklus a apoptóza 10. Konzultační hodina 11. Prezentace Podmínky udělení zápočtu: - 2 protokoly - prezentace výsledků Vymezení pojmu MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA Obor medicíny, který vyvíjí způsoby diagnos5ky a léčby nemocí na základě poznání fungování genů, proteinů a dalších buněčných molekul. Molekulární medicína je založena na výzkumu, který ukazuje, jak mohou být určité geny, molekuly a buněčné funkce abnormální při onemocněních, jako je například rakovina. Molekulární medicína je široký obor, v němž se používají fyzikální, chemické, biologické, bioinformatické a lékařské techniky k popisu molekulárních struktur a mechanismů, k identifikaci základních molekulárních a genetických chyb nemocí a k vývoji molekulárních intervencí k jejich nápravě. Perspektiva molekulární medicíny klade důraz na buněčné a molekulární jevy a intervence spíše než na dřívější koncepční a observační zaměření na pacienty a jejich orgány. překlad překlad Vymezení pojmu MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA Termín molekulární medicína se používá k popisu role, kterou hraje DNA v lékařské praxi. Vzhledem k širokému uplatnění DNA v medicíně nelze molekulární medicínu považovat za tradiční obor, protože DNA překračuje jak přirozené hranice, jako je druh, tak umělé hranice, jejichž příkladem jsou lékařské obory. Molekulární medicína je obor založený na aplikaci poznatků a metod molekulární biologie do klinické medicíny vedoucí k cílené prevenci a vyššímu stupni integrace diagnózy a terapie. překlad Vymezení pojmu MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA bývá nesprávně synonimicky zaměňována s pojmy: - translační medicína (“from bench to bedside” neboli “od laboratorního stolu k lůžku pacienta”) - Interdisciplinární obor biomedicíny, který se opírá o tři hlavní pilíře: laboratoř, lůžko pacienta a komunita. Cílem translační medicíny je spojit obory, zdroje, odborné znalosti a techniky v rámci těchto pilířů a podpořit tak zlepšení prevence, diagnostiky a terapie. - personalizovaná medicína (individualizovaná či adresná medicína) - Personalizovaná medicína využívá informace o genech nebo proteinech konkrétního člověka k prevenci, diagnostice nebo léčbě nějakého onemocnění. Personalizovaná medicína se nejvíce uplatňuje v onkologii, kde využívá zjištěné informace o zhoubném nádoru konkrétního pacienta, které pomáhají stanovit diagnózu, naplánovat léčbu, zjistit, jak dobře léčba funguje, nebo stanovit prognózu. European Society for Translational Medicine, překlad Národní zdravotnický informační portál Vymezení pojmu MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA Koncepce a hlavní náplň oboru MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA 1 idenYfikace individuálních geneYckých dispozic ke konkrétním chorobám a formulace prevenYvních opatření (molekulární epidemiologie, nutrigenomika, ...) 2 aplikace molekulárně-biologických metod do klinické diagnosYky (mikrobiologická DNA diagnosYka, prenatální diagnosYka, ...) 3 zdokonalení diagnosYky na základě přesnější formulace onemocnění zohledňující jejich molekulární patologii (např. molekulární taxonomie nádorů) 4 idenYfikace nových terapeuYckých cílů (molekulárních struktur buňky) co nejvíce specifických pro dané onemocnění 5 vytváření nových léčebných strategií (cílená léčba, buněčná terapie, genová terapie, ...) 6 individualizace léčby na základě geneYckého pozadí jedince (farmakogeneYka/genomika) 7 zdokonalení a zrychlení transferu technologií z laboratoří k lůžku pacienta (translační medicína – „from bench to bedside“) 8 bioeYka a právo Vyvrácení dogmatu jedna nemoc = jedna léčba Vyvrácení dogmatu jedna nemoc = jedna léčba Neexistují dva naprosto stejné případy téže nemoci Jen velmi malá část lidských nemocí má jednoduchou, dokonce jedinou příčinu (některé dědičné nemoci a závažné infekce) I zde - hemofilie, tuberkulóza a AIDS kolísají individuální příznaky tak značně, že je nutné hovořit pouze o celkovém klinickém obrazu 1. Genetické dispozice ovlivňují průběh téměř všech nemocí 2. Mohou existutovat rozdílné molekulární podtypy v rámci jedné diagnózy Příklad molekulární klasifikace karcinomu prsu: - existuje šest molekulárních podtypů Sorlie et al, PNAS, 2001 Vyvrácení dogmatu jedna nemoc = jedna léčba Vyvrácení dogmatu jedna nemoc = jedna léčba Nejsou dvě léčby stejné = účinky jednoho léčiva se liší v závislosY na geneYckém pozadí jedince = farmakogeneYka, farmakagenomika Volba správné terapie nikoliv pouze na základě diagnózy, ale také vzhledem ke schopnos5 organismu nakládat s příslušnou látkou (vliv geneYky, vliv prostředí – interakce složek potravy) Farmakokine5ka – např. metabolická schopnost organismu CYP2D6 a CYP2C19 – metabolizují 30 % léků nebo kapacita organizmu odbourávat cytostaYkum 5fluorouracil pomocí enzymu dihydropyrimidin dehydrogenázy. Přibližně 0,2 % pacientů vykazují jeho úplnou ztrátu → toxicita, rezistence Cytochrom je protein, který slouží ke katalýze přenosu elektronů během metabolických reakcí. Podílejí se na reakci metabolismu léků, která určuje bezpečnost a účinnost léku u člověka. Vyvrácení dogmatu jedna nemoc = jedna léčba Inhibitory zpětného vychytávání noradrenalinu a serotoninu - léčba obsedantně kompulsivní poruchy a deprese Vyvrácení dogmatu jedna nemoc = jedna léčba Nejsou dvě léčby stejné = účinky jednoho léčiva se liší v závislosti na genetickém pozadí jedince = farmakogenetika, farmakagenomika Volba správné terapie nikoliv pouze na základě diagnózy, ale také vzhledem ke schopnosti organismu nakládat s příslušnou látkou (vliv genetiky, vliv prostředí – interakce složek potravy) Farmakokinetika → toxicita, rezistence Farmakodynamika – přítomnost molekulárních změn (např. mutace v genu KRAS => necitlivost na anti-EGFR léčbu – gefitinib, erlotinib) → rezistence Vyvrácení dogmatu jedna nemoc = jedna léčba Nejsou dvě léčby stejné = účinky jednoho léčiva se liší v závislosY na geneYckém pozadí jedince = farmakogeneYka, farmakagenomika Volba správné terapie nikoliv pouze na základě diagnózy, ale také vzhledem ke schopnos5 organismu nakládat s příslušnou látkou (vliv geneYky, vliv prostředí – interakce složek potravy) Farmakokine5ka → toxicita, rezistence Farmakodynamika → rezistence Předpoklad farmakogeneYky a farmakogenomiky: Gene5cké změny (predik5vní markery) spojené s fenotypy toxicity a rezistence jsou předem iden5fikovatelné. Vyvrácení dogmatu jedna nemoc = jedna léčba „If it were not for the great variability among individuals, Medicine might be a Science not an Art.“ Sir William Osler, The Principles and Prac4ce of Medicine,1892 Průměrné procento léčebné odpovědi u nejčastějších onemocnění Historie molekulární medicíny – Buněčná teorie Rudolf Ludwig Karl Virchow (1821 – 1902) 1855 Potvrdil buněčnou teorii “Omnis cellula e cellula” Každá buňka pouze z buňky Jan Evangelista Purkyně (1787, Libochovice – 1869, Praha) Heinrich Schliemann, Trója Ma9hias Schleiden a Theodor Schwann 1838 a 1839 1837 pražské Karolinum přisoudil buňkám jejich stěžejní význam pro život “… veškeré živé organizmy jsou tvořeny jednou či více buňkami a ta je základní strukturní jednotkou všech organism …” ALE “… buňky vznikají z neživé hmoty …” 1839 - protoplazma “O primitivní substanci ve vezikulech (buňkách) rostlinného a živočišného embryonálního těla” Základy buněčné teorie Formulovali buněčnou teorii ALE “… všechny buňky vznikají z blastému …” Historie molekulární medicíny – Evoluční teorie Charles Darwin (1809 – 1882) 1859 On the Origin of Species by Means of Natural Selection, or the Preservation of Favoured Races in the Struggle for Life O vzniku druhů přírodním výběrem, neboli uchováním prospěšných plemen v boji o život 1871 „Pohlavní výběr závisí na převaze určitých jedinců nad druhými stejného pohlaví, což se týká propagace druhů; zaTmco přírodní výběr závisí na vítězství obou pohlaví, v každém věku, za normálních podmínek života.“ 1831 – 1836 1742 dnů trvající výzkumná cesta kolem světa na lodi HMS Beagle druhá expedice lodi HMS Beagle1858 - Alfred Russel Wallace (Wallecova linie, Malajsie) Historie molekulární medicíny Johan Gregor Mendel (1822, Hynčice – 1884, Brno) Pokusy s rostlinnými hybridy 1865 (publikováno 1866) 1869 - jestřábník Zákon o uniformitě F1 Zákon o náhodné segregaci alel do gamet Zákon o nezávislé kombinovatelnosE alel Historie molekulární medicíny 1900 – Huge de Vries Carl Correns Erich von Tschermak 1902 – William Bateson geneQka homozygot heterozygot alelomorfa 1869 – Friedrich Miescher izolace nukleové kyseliny - nuklein - z jader bílých krvinek Historie molekulární medicíny 1909 – Wilhelm Johannsen 1909 – Thomas Hunt Morgan gen, genotyp, fenoty 1933 – Nobelova cena 1908 – Godfrey H. Hardy Wilhelm Weinberg Historie molekulární medicíny 1911 –Peyton Rous 1949 – Linus Pauling 1966 – Nobelova cena 1910 – Albrecht Kossel 1910 – Nobelova cena příčinou anémie srpkovitých buněk je “nenormálnost” hemoglobinu -> cesta ke zkoumání geneticky získaných mutací na molekulární úrovni beta-řetězec 6. pozice - k. glutamová -> valin Historie molekulární medicíny 1950 – 1959 Stanley Cohen Rita Levi-Montalcini 1953 – James D. Watson Francis H. C. Crick Rosalind Franklinová Maurice Wilkins 1957 – Arthur Kornberg 1986 – Nobelova cena Izolace nervového růstového faktoru 1962 – Nobelova cena DNA polymeráza 1959 – Nobelova cena Severo Ochoa a Arthur Kornberg za objev mechanizmu biosyntézy RNA a DNA Historie molekulární medicíny 1957 – Francis Crick George Gamow 1960 – Alfred G. Gilman Martin Rodbell 1966 – Marshal W. Nirenberg Heinrich Mathaei Severo Ochoa 1994 – Nobelova cena 1968 – Nobelova cena Historie molekulární medicíny 1975 – 1977 Frederik Sanger Walter Gilbert Paul Berg 1983 – Kary Mullis 1983 – Robert Weinberg 1980 – Nobelova cena 1993 – Nobelova cena Objev prvního lidského onkogenu RAS 1984 – Elizabeth Blackburnová, Carol W. Greiderová Jack W. Szostak 2009 – Nobelova cena Historie molekulární medicíny – Genová terapie Genová terapie 1987 – první rekombinantní DNA vakcína pro hepatitidě B, vytvořená inzercí segmentu virové DNA do kvasinkového vektoru 1990 – první podání genové terapie (retrovirové vektory s funkčním enzymem) u pacientky s ADA immunodeficiencí Ashanthi DeSilva Klinická studie se SCID X1 imunodeficiencí u 14 dětí (u 2 došlo k rozvoji AL) Historie molekulární medicíny – projekt HUGO (1988 – 2001) 1985-1990: diskuse o sekvenování lidského genomu – “nebezpečné” - “nesmyslné” - “nemožné” 1988-1990: Založen HUMAN GENOME PROJECT (HGP) 20 laboratoří z USA, Velké Británie, Japonska, Francie, Německa a Číny Asi 2800 lidí, vedoucí: Francis Collins, NIH Mezinárodní spolupráce: HUGO (Human Genome Organisation) Cíle: – genetická mapa lidského genomu – fyzická mapa: marker každých 100 kbp – sekvenování modelových organismů (E. coli, S. cerevisiae, C. elegans, Drosophila, myš) – objevit všechny lidské geny (předpokl. 60-80 tisíc) – sekvenování celého lidského genomu (3000 Mbp) do r. 2005 s rozpočtem 3 bil. USD Historie molekulární medicíny – projekt HUGO (1988 – 2001) Květen 1998 • Craig Venter zakládá soukromou biotechnologickou společnost CELERA GENOMICS, Inc. a vyhlašuje záměr sekvenovat celý lidský genom za 3 roky a 300 mil. USD metodou whole-genome shotgun, několik desítek zaměstnanců (sponzorováno Applied Biosystems) • V té době výsledek práce HGP: sekvenováno cca 4 % lidského genomu. Celera Genomics & akad. spolupracovníci publikují draft genomu Drosophila melanogaster (cca 2/3 z 180 Mbp) • ... whole-genome shotgun lze použít i pro velké genomy • ... Lidský genom: závod mezi Human Genome Project a Celera Genomics Únor 2001 - Remíza HGP publikuje draft lidského genomu v časopisu Nature 15.2.2001. Celera Genomics publikuje svou sekvenci lidského genomu v Science 16.2.2001. Historie molekulární medicíny – projekt HUGO (1988 – 2001) Pracovníci veřejného konsorcia byli zavázáni tzv. Bahamskou deklarací, která stanovila, že se výsledky sekvenování musí do 24 hod. vystavit veřejně na internetu, aby všechna pracoviště mohla využít výsledků ostatních. Tato data ovšem využívali i pracovníci Celery, kteří ovšem nebyli Bahamskou deklarací vázáni a své výsledky nezveřejňovali. Historie molekulární medicíny – sekvenace individuálních genomů Craig Venter Září 2007, 10 mil. USD 32 million DNA fragmentů, 20 billionu bazí Total variants: 4.1 million 3.1 million SNPs 4000 genů mělo pozměněné proteinové produkty Venter netrpí CF ani Huntigtonovou chorobou James D. Watson Říjen 2007 Méně než 1 mil. USD Publikován v GeneBank Trvalo méně než 2 měsíce Následovaly sekvenační analýzy dalších jedinců z různých etnik, které přinesly podstatné informace o interpersonálních rozdílech ve struktuře genomů. Historie molekulární medicíny – sekvenování nové generace Nové technologie založené na principu masivního paralelního sekvenování next-generation DNA sequencing technology Srpen 2009 Délka projektu: 8 týdnů 48 000 USD (Venter 10 MUSD -> HUGO: 3 000 MUSD) Roche 454 Genome/ Sequencer pla$rom Solexa Ilumina SOLiD Applied Biosystems Paralelní sekvenování miliónů sekvencí, celkem 100 – 3000 Mb/run, jednotlivé sekvence dlouhé 20 – 400 bp Historie molekulární medicíny 1998 – objev RNA INTERFERENCE a microRNA Craig Mello a Andy Fire u C. Elegans –NOVÝ NÁSTROJ GENOVÉ TERAPIE Craig Mello na slavnostním banketu po udílení Nobelových cen za rok 2006.