Měření spektrálních charakteristik a stanovení koncentrace
DNA a proteinů
Spektroskopie v UV oblasti umožňuje stanovit koncentraci a čistotu biologických molekul.
Molekuly DNA mají absorpční maximum kolem 260 nm, molekuly proteinů kolem 280 nm.
Pro přímé spektrální určení koncentrace se využívá Lambert-Beerova zákona pro
monochromatické světlo, který lze zapsat ve tvaru A = c.ε za předpokladu, že měříme v 1 cm
kyvetě a známe extinkční koeficient ε, který má jednotku [M-1
cm-1
] pro molární koncentraci
nebo [mL.mg-1
cm-1
] pro koncentraci v mg/mL.
V případě, že neznáme extinkční koeficient, můžeme pro určení koncentrace DNA o vysoké
molekulární hmotnosti použít zjednodušeného předpokladu, že roztok dvouřetězcové DNA
o absorbanci 1 má koncentraci 50 µg/mL a pro převod na molární koncentraci nukleotidu
DNA pak vztah 320 µg/mL = 1 mM.
Pro určení koncentrace proteinů spektroskopicky lze využít absorbance proteinů při 280 nm.
Jestliže známe primární sekvenci aminokyselin proteinu, lze extinkční koeficient vypočítat
https://web.expasy.org/protparam/. Ze změřené absorbance pak určíme koncentraci proteinu.
Znalost extinkčního koeficientu není nutná v případě univerzální Bradfordovy metody.
Bradfordova metoda je v současnosti nejrozšířenější způsob určování koncentrace proteinu.
Bradfordova metoda využívá posunu absorpčního maxima „Coomassie Blue“ po vazbě na
protein. Za použití kalibrační křivky se známou koncentrací proteinu lze určit skutečnou
koncentraci neznámého proteinu nebo směsi proteinů.
Materiál
• DNA (Salmon sperm; přibližná koncentrace = 7,2 mg/mL)
• Oligonukleotid CNF2_Bot (5´ GTTATCCTTTGAGGGTTTAG; přibližná
koncentrace = 0,02 mg/mL)
• BSA (hovězí sérový albumin;  = 0.677 mL mg-1
cm-1
, MW = 66 430 Da; přibližná
koncentrace 5 mg/mL)
• TE pufr; 50/50 pufr: 50 mM Sodium Phosphate, 50 mM NaCl, pH 7.0
• Bradford reagent (BioRad)
• Kyvety a spektrofotometr
DNA
1. Připravte roztok DNA v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo možno přesně
určit koncentraci DNA.
2. Změřte absorpční spektrum DNA v rozsahu vlnových délek 220 až 350 nm.
3. Určete polohu absorpčního maxima.
4. Stanovte přesnou koncentraci DNA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance
naředěného roztoku při 260 nm. Koncentraci vyjádřete v mg/mL a v OD/mL.
5. Nařeďte roztok oligonukleotidu v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo
spektroskopicky možno přesně stanovit jeho koncentraci.
6. Změřte absorpční spektrum v rozsahu vlnových délek 220 až 600 nm.
7. Nastavení přístroje Hach Lange DR6000:
Skenování vln.délky – Možnosti – λ - nastavit hodnoty min a max λ – OK – Nulovat
- Načítat
8. Na základě zadané sekvence oligonukleotidu stanovte extinkční koeficient 260
a spektroskopicky určete jeho koncentraci. Potřebné parametry lze získat na stránce
https://eu.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer
9. Změřte spektrum značeného oligonukleotidu ve stejném rozsahu vlnových délek
a porovnejte jej se spektrem neznačeného oligonukleotidu.
Protein
UV spektroskopie
1. Připravte roztok BSA v 50/50 pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo možno přesně
určit koncentraci BSA.
2. Změřte absorpční spektrum BSA v rozsahu vlnových délek 240 až 350 nm:
Nastavení přístroje Beckman DU®730:
Wavelength Scan – Options – λ – nastavit hodnoty min a max λ – OK – blank - vzorek
3. Určete polohu absorpčního maxima.
4. Stanovte přesnou molární koncentraci BSA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance
naředěného roztoku při 280 nm.
Bradfordova metoda
1. Připravte standardní kalibrační křivku pro měření koncentrace proteinu Bradfordovou
metodu.
2. Změřte koncentraci BSA pomocí této metody.
3. Vezměte roztok reakčního Bradfordova činidla z lednice a nechte jej zahřát na
pokojovou teplotu a promíchejte.
4. Připravte roztoky blanku a standardů BSA o celkovém objemu 1mL do mikrozkumavek
tak, že do 980 µL reakčního Bradfordova činidla přidejte vždy 20 µL 50/50 pufru nebo
20 µL 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.75 mg/mL, 1 mg/mL a 1.5 mg/mL
standardů.
5. Současně připravte stejným způsobem roztok BSA ze zásobního roztoku, který jste
naředili tak, aby bylo možno přesně určit jeho koncentraci.
6. Všechny roztoky dobře promíchejte a nechte inkubovat 5 min při pokojové teplotě.
Inkubace by neměla přesáhnout 1h.
7. Nastavení spektrofotometru Beckman DU®730: Protein Assay Analysis – Bradford
– Start – Standard Curve – Standards Setup - vypište hodnoty koncentrací standardů od
nejmenší přes Edit concentration – Done – změřte absorbanci blanku (činidlo s pufrem),
poté standardů. Změňte rovnici na Non-linear - Done
8. Změřte absorbanci blanku, jednoho standardu (pro kontrolu) a poté neznámého vzorku
a pomocí kalibrační křivky určete jeho koncentraci.
9. Porovnejte hodnoty koncentrace zásobního roztoku BSA určené spektroskopicky při
280 nm a pomocí Bradfordovy metody.
Tabulka pro přípravu kalibračních roztoků ve 2 mL zkumavkách
c [mg/mL]
Objem BSA (zásobní je 5 mg/mL) ve 20 uL
/ zbývající objem pufru do celk. objemu 20 uL [uL]
Absorbance
(595 nm)
0.0 (blank) 0 / 20 0.00
0.125
0.25
0.5
0.75
1.0
1.5