Ctirad Hofr LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce C7230 FGP – Funkční genomika a proteomika NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR3 Využití fluorescence, Přímá fluorescence, Přímá a Nepřímá fluorescence, Biotin-Avidinová metoda imunofluorescence Fluorescenční metody se používají především, pokud potřebujeme zviditelnit určité látky a struktury v buňce. Některé fluorochromy (DAPI, ethidium bromid, Hoechst) se sami o sobě vážou na určité molekuly (např. na DNA) a můžeme je tedy použít na zviditelnění těchto molekul. Tento postup se nazývá přímá fluorescence. Pro většinu struktur v buňce bychom však nenašli fluorofor, který by se na ně specificky vázal. V takovém případě používáme metody imunofluorescence. Jsou vypracovány postupy, s jejichž pomocí si dokážeme vyrobit protilátku, která se specificky váže na téměř jakýkoli druh molekuly. Máme-li takovouto protilátku, můžeme na ni kovalentně navázat fluorofor a vyrobit tak fluoreskující molekulu specificky rozeznávající to, co potřebujeme. V tomto případě hovoříme o přímé imunofluorescenci. Příprava takovéto kombinované molekuly (konjugátu) není úplně jednoduchá, a proto se často používá nepřímá imunofluorescence. U této metody si nejdříve připravíme v určitém zvířecím druhu (např. v králíkovi) specifickou protilátku proti naší molekule (primární protilátka) a necháme ji navázat na molekulu nebo strukturu, kterou chceme lokalizovat. Po odmytí přebytečné primární protilátky se na preparát přidá komerčně dodávaná protilátka konjugovaná s fluoroforem, která specificky rozeznává všechny protilátky daného zvířecího druhu (v našem případě králíka). Ta se naváže na primární protilátku a zviditelní námi hledanou strukturu. Nevýhodou nepřímé fluorescence oproti přímé fluorescenci je nižší specifita. Biotin-avidinová imunofluorescence využívá silné vazby biotinu a bazického glykoproteinu avidinu. Biotin lze snadno navázat na molekuly primárních protilátek, na které se pak místo sekundárních protilátek s fluoroforem váže fluoroforem značený avidin. Výsledkem je jasná a ostrá fluorescence. Protože máme k dispozici celé barevné spektrum fluoroforů, můžeme zviditelnit více různých struktur v téže buňce a sledovat tak jejich vzájemnou lokalizaci. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR4 Fluorescenční mikroskop Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR5 Možné uspořádání Epifluorescenční mikroskop Transmisní mikroskop Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR6 Epifluorescenční mikroskop (Reflected light fluorescence microscope) • excitační světlo prochází objektivem, dopadá na preparát a emisní světlo se vrací zpět do objektivu • nutno použít zvláštní typ zrcadla, které odráží excitační světlo do objektivu a propouští emisní světlo do okuláru • používá se dichroické zrcadlo, které propouští a odráží světlo podle toho, jakou má vlnovou délku. Používá se tedy vždy takový typ zrcadla, který maximum excitačního světla odráží a maximum emisního světa propouští. • epifluorescenční typ mikroskopu je v současnosti více oblíbený než transmisní typ Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR7 Excitační a barierový (emisní) filtr • Abychom mohli dobře pozorovat emisní záření jehož intenzita je vždy nižší než intenzita excitačního záření, používáme dvojici filtrů. • Excitační filtr propouští z barevného spektra pouze část potřebnou pro excitaci fluorescence a zabraňuje průchodu světla o stejné či podobné vlnové délce jako světlo emisní, které by vytvářelo pozadí. • Bariérový filtr propouští pouze emisní část spektra a zabraňuje průchodu excitačního světla. Excitační světlo se od emisního sice liší barvou, ale je mnohem intenzivnější, takže by v něm fluorescenční emisní světlo, o které nám zejména jde, nebylo lidským okem rozlišitelné. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/opticalpaths/index.html Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR8 Anatomie mikroskopu https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/java/lightpaths/ix70fluorescence Invertovaný mikroskop objektiv zespodu Klasický epifluorescenční mikroskop objektiv shora Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR9 Funkce dichroického zrcadla Dichroické zrcadlo propouští a odráží světlo podle toho, jakou má vlnovou délku. Používá se vždy takový typ zrcadla, který odráží maximum excitačního světla a propouští maximum emisního světa podle excitačního a emisního maxima daného fluoroforu Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR10 Filtry • Vhodná kombinace dichroického zrcadla, excitačního a emisního filtru pro použitý druh fluoroforu se do epifluorescenčního mikroskopu vkládá pohromadě jako tzv. kostka, jejíž dvě stěny jsou tvořeny filtry a úhlopříčka dichroickým zrcadlem. Kostky jsou umístěny na výměníku a je možné je vyměňovat podle potřeby. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/lightpaths/fluorescence/index.html Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR11 Výběr vhodného filtru pro fluorofor https://www.microscopyu.com/tutorials/spectralprofiles Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR12 Transmisní fluorescenční mikroskop Transmition fluorescence microscope U tohoto typu mikroskopu prochází světlo excitačním filtrem a na preparát přichází zespodu jako u klasického světelného mikroskopu. Pro osvětlení preparátu se však používá kondenzor zástinový, který odráží světlo tak, že na preparát světlo dopadá z boku. Procházející excitační světlo tak prochází mimo objektiv a do objektivu se dostane emitovaná fluorescence. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR13 Konfokální mikroskop • Konfokální mikroskop umožňuje odstranit z obrazu objektu šum, který vytváří světlo nebo fluorescence emitovaná z těch rovin vzorku, na které není zaostřena optika. • Zdrojem světla je zpravidla laser, světlo prochází úzkou štěrbinou (source pinhole) a je zaostřeno do jednoho bodu vzorku. Světlo emitované z tohoto bodu je pak snímáno detektorem. Aby dopadlo na detektor, musí opět projít úzkou šterbinou (detector pinhole), která leží v místě, kam objektiv zaměřuje světlo ze zaostřeného bodu objektu. • Světlo emitované z osvětlených, ale nezaostřených bodů je fokusováno mimo stěrbinu a do detektoru nedopadá. Signál detektoru je odeslán do počítače, který zároveň dostává informaci o souřadnicích snímaného bodu. • Tímto způsobem je bod po bodu proskenován celý objekt v různých optických rovinách. Toto skenování je automatizováno a ovládáno řídícím počítačem. Z nashromážděných informací počítač sestaví celkový obraz. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR14 Virtuální mikroskopie http://micro.magnet.fsu.edu/primer/virtual/fluorescence/index.html http://www.microscopyu.com/tutorials/java/kohler/index.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie (doc. Neradil) Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR15 Literatura • Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. • Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm • Poděkování: Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem.