Vlastní fluorescence proteinů
Vlastní fluorescenci proteinů je způsobena aromatickými aminokyselinami v nich
obsaženými: tryptofanem (Trp, W), tyrozinem (Tyr, Y) a fenylalaninem (Phe, F).
Dominující je fluorescence tryptofanu, naopak prakticky vůbec se neuplatňuje fenylalanin.
V této úloze jsou změřena fluorescenční excitační a emisní spektra albuminu a čistého
tryptofanu a tyrozinu.
Vlastnosti L-tryptofanu
• MW = 204.23, ε (Trp) = 5690 M-1
cm-1
• absorpční maximum: λexmax = 276 nm
• fluorescenční emisní maximum: λemmax = 353 nm
• emise Trp je vysoce závislá na polaritě a okolním prostředí
Vlastnosti L-tyrozinu
• MW = 181.19; ε (Tyr) = 1280 M-1
cm-1
• absorpční maximum: λexmax = 275 nm
• fluorescenční emisní maximum: λemmax = 304 nm
• emise Tyr je relativně málo citlivá na polaritu rozpouštědla
Fluorescence proteinů je obvykle excitována při 280 nm nebo při delších vlnových
délkách, takže fenylalanin není ve většině experimentů excitován. Navíc je kvantový
výtěžek fluorescence Phe velmi malý (kolem 0,02). Tryptofanovou fluorescenci
v proteinech lze selektivně excitovat při 295-305 nm.
Materiál
• L-tryptofan (Applichem), L-tyrozin (Applichem)
• hovězí sérový albumin (BSA, MW = 67000), ε (BSA) = 49915 M-1
cm-1
• pufr A (50 mM NaCl, 50 mM Na-fosfát, pH 7,0)
Postup
1. Připravte roztoky Trp, Tyr a BSA nařeďte pufrem A pomocí tabulky:
zásobní
koncentrace
počet ředění
(např. 1000x)
finální koncentrace
(do 1500 μl)
Trp 20 μM 100 nM
Tyr 100 μM 500 nM
BSA 7.5 μM 50 nM
2. Změřte excitační a emisní spektra vzorků za podmínek uvedených v tabulce.
excitační
spektrum
emisní spektrum
λex (nm) λem (nm) λex (nm) λem (nm)
L-tryptofan 240-300 350 290 300-420
L-tyrozin 240-290 300 270 280-420
BSA 240-320 350 270,290 300-420
Výsledky
Určete, jaká část fluorescence BSA je způsobena tryptofanem a jaká tyrozinem za použití
diferenčního spektra.