Bi6721c Speciální metody analýzy mikroorganizmů I. - cvičení

Přírodovědecká fakulta
jaro 2009
Rozsah
0/3/0. 3 kr. Ukončení: z.
Vyučující
doc. RNDr. Alena Španová, CSc. (cvičící)
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. (cvičící)
RNDr. Aleš Kovařík, CSc. (cvičící)
Garance
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc.
Ústav experimentální biologie - Biologická sekce - Přírodovědecká fakulta
Kontaktní osoba: doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc.
Rozvrh seminárních/paralelních skupin
Bi6721c/01: St 8:00–10:50 Bpb,02012, B. Rittich, A. Španová
Bi6721c/02: St 11:00–13:50 Bpb,02012, B. Rittich, A. Španová
Předpoklady
NOW ( Bi6721 Spec. met. an. mikroorg. I. )
Předmět je určen pro studenty, kteří chtějí prakticky zvládnout základní nekultivační mikrobiologickou metodu PCR.
Omezení zápisu do předmětu
Předmět je nabízen i studentům mimo mateřské obory.
Jiné omezení: Přednost mají posluchači specializace mikrobiologie.
Mateřské obory/plány
Cíle předmětu
Bezpečnost práce v mikrobiologické laboratoři. Základní postupy při práci s DNA: izolace a purifikace bakteriální DNA, srážení DNA ethanolem, stanovení koncentrace a čistoty DNA. Ověření intaktnosti DNA pomocí gelové elektroforézy na agaróze, barvení DNA na gelu a dokumentace gelu. Příprava PCR směsi pro amplifikaci specifického úseku DNA buněk Salmonella a provedení PCR reakce. Detekce PCR produktu pomocí gelové elektroforézy na agaróze a výpočet délky amplifikovaného fragmentu. Stanovení citlivosti PCR. Provedení PCR s hrubým lyzátem buněk po imunomagnetická separace (IMS) buněk Salmonella. K cvičení patří přednáška Bi6721.
Na konci kursu studenti prokáží praktickou schopnost provádět PCR.
Osnova
  • 1. Bezpečnost práce v mikrobiologické laboratoři. Pipetování malých objemů roztoků automatickými pipetami.
  • 2.Příprava buněk Salmonella Typhimurium LB5000 pro izolaci bakteriální DNA. Lyze buněk.
  • 3. Deproteinace DNA pomocí fenolu. Přesrážení DNA ethanolem.
  • 4. Ověření intaktnosti DNA pomocí gelové elektroforézy na agaróze. Vizualizace DNA a dokumentace gelu.
  • 5. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA. Ředění DNA na koncentraci vhodnou pro PCR.
  • 6. Zásady provozu PCR laboratoře. Příprava PCR směsi pro amplifikaci specifického úseku DNA purifikované z buněk Salmonella. Provedení PCR reakce.
  • 7. Detekce PCR produktu pomocí gelové elektroforézy.
  • 8. Stanovení velikosti amplifikovaného produktu s použitím standardů o známé velikosti.
  • 9. Příprava PCR směsi z hrubého lyzátu buněk. Pozitivní a negativní kontroly. Provedení +PCR a detekce PCR produktu.
  • 10. Imunomagnetická separace (IMS) buněk Salmonella. IMS-kultivace (IMS-CM) buněk Salmonella. IMS-polymerázová řetězová reakce (IMS-PCR). Stanovení citlivosti PCR.
  • 11. Detekce PCR produktů pomocí agarózové gelové elektroforézy.
  • 12. a 13. Zápočtová úloha - identifikace baktérií Salmonella v neznámém vzorku pomocí PCR.
  • 14. Vyhodnocení protokolů. Zápočtový test.
Literatura
  • F.Sambrook and D.W. Russell Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001
Metody hodnocení
Cvičení je ukončeno zápočtem a testem.
Navazující předměty
Další komentáře
Předmět je vyučován každoročně.
Předmět je zařazen také v obdobích jaro 2008 - akreditace, jaro 2011 - akreditace, jaro 2003, jaro 2004, jaro 2005, jaro 2006, jaro 2007, jaro 2008, jaro 2010, jaro 2011, jaro 2012 - akreditace, jaro 2014, jaro 2016, jaro 2017, jaro 2018, jaro 2019, jaro 2020, jaro 2021.