MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Návod do cvičení KVALITATIVNÍ ANALÝZA NEZNÁMÝCH VZORKŮ PIV POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY S BEZKONTAKTNÍ VODIVOSTNÍ DETEKCÍ Mgr. Kateřina Dadáková Mgr. Aleš Mádr 2013 Vzniklo díky finanční podpoře Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy z Fondu rozvoje vysokých škol, projekt č. 599/2013/G6. Laboratorní cvičení KVA L IT A T IV N Í A NA LÝZ A N E Z N ÁM ÝC H VZ OR KŮ P I V P O MO C Í CE-C4 D 1 TEORETICKÝ ÚVOD 1.1 Kapilární elektroforéza 1 Kapilární elektroforéza (CE) je elektromigrační separační technika. Separace probíhají v kapiláře s vnitřním průměrem typicky 25 – 75 μm, celkové délky 20 – 100 cm. Kapilára je naplněna elektrolytem, na jejíž konce je aplikováno stejnosměrné elektrické napětí. Separační princip je v základním uspořádání založený na rozdílné pohyblivosti iontů v elektrickém poli. Iontová pohyblivost je funkcí náboje a velikosti částice. Zmíněný elektroforetický princip separace lze v CE snadno rozšířit o chromatografické principy anebo principy molekulového síta, a to pouhou modifikací elektrolytu, kterým je kapilára naplněna v průběhu separace. Aplikační možnosti CE jsou velmi rozsáhlé. CE může sloužit k stanovení anorganických i organických iontů, neutrálních látek, proteinů a peptidů, fragmentů nukleových kyselin, či dokonce živých bakteriálních buněk. V praxi nachází uplatnění jako komplementární analytická technika ke kapalinové chromatografii a nejvíce se využívá v akademické sféře a farmaceutickém průmyslu. Jelikož je separace závislá na náboji částic, který je v případě slabých kyselin a zásad závislý na pH prostředí, používaný elektrolyt je vždy pufrem. Na pH je závislý i elektroosmotický tok (EOF), který lze jednoduše popsat jako tok elektrolytu kapilárou v důsledku náboje na vnitřní stěně kapiláry. V CE se nejčastěji využívají kapiláry křemenné pro dobrou transparentnost v UV oblasti spektra a dobrou tepelnou vodivost. Obrázek 1 -Strukturní vzorce silanolové a siloxanové skupiny; reakční schéma disociace silanolové skupiny. EOF je někdy nežádoucí, a proto se eliminuje přídavkem hydrofilních polymerů do základního elektrolytu, jako jsou (hydroxyethyl)-celulosa nebo polyethylenglykol. Podstatnou součástí každé separační techniky je detektor, který zaznamenává změny vlastností roztoku procházejícího kapilárou. K nejběžnějším detekčním technikám patří spektrofotometrie v UV a viditelné oblasti spektra. Dále lze využít fluorescenční detekci, hmotnostní spektrometrii anebo elektrochemické detekce založené na principech amperometrie a konduktometrie. 1.2 Bezkontaktní vodivostní detekce 2 Bezkontaktní vodivostní detekce (C4 D) patří mezi univerzální detekční techniky. Je založena na měření elektrické vodivosti roztoku, který se nachází v tzv. detekční cele. Elektrody nejsou v přímém kontaktu s měřeným roztokem, neboť se využívá vysokofrekvenčního signálu, který prochází i nevodivým materiálem, jakými jsou vzduch a stěna kapiláry. Na první elektrodu se přivádí vysokofrekvenční střídavý signál, který je jako střídavý proud registrován druhou elektrodou. Velikost prošlého proudu je úměrný vodivosti roztoku, který se nachází v detekční cele. Registrovaný proud je usměrněn, zesílen, pomocí A/D převodníku digitalizován a dále již zpracováván počítačem. 1 Landers, J. P., Capillary and Microchip Electrophoresis and Associated Microtechniques, CRC Press: Boca Raton, 2008, s. 1567. 2 Opekar, F., Štulík, K., Chem. Listy 2000, 104, 1148-1154. 2 Laboratorní cvičení KVA L IT A T IV N Í A NA LÝZ A N E Z N ÁM ÝC H VZ OR KŮ P I V P O MO C Í CE-C4 D Na obrázku 2 můžete vidět schéma detekční cely a její zjednodušení do podoby elektrického obvodu složeného ze dvou kondenzátorů (C) a odporu (R). Obrázek 2 - Schéma bezkontaktního vodivostního detektoru a zjednodušené schéma elektrického obvodu detekční cely (vpravo). 2 PRAKTICKÁ ČÁST 2.1 Přístroje, materiál a chemikálie - Agilent G7100A CE System - Bezkontaktní vodivostní detektor (interní označení: 2.46 MHz C4 D) - Ultrazvuková lázeň - Automatické pipety 20 – 200 μl, 100 – 1000 μl - Kádinka, 150 ml - Stříkačkový membránový filtr s velikostí pórů 0,2 μm - Injekční stříkačka, 10 ml - Plastové mikrozkumavky (eppendorfky), objem 1,5 ml - Plastové špičky k automatickým pipetám - Plastové vialky a víčka kompatibilní s přístrojem pro CE - Kyselina octová, 99,9% - 1% (m/m) (hydroxyethyl)-celulosa (připravuje se minimálně den před cvičení za kontinuálního míchání) - 10 mM 4-nitro-L-fenylalanin (NO2-Phe) v 1M HCl - 1M NaOH - 0,1M NaOH - Milli-Q H2O (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) 2.2 Nastavení přístroje pro CE Základní elektrolyt: 10% (v/v) kyselina octová, 0,05 % (m/m) (hydroxyethyl)-celulosa Vzorek: 1,025× ředěné pivo s přídavkem 250 μM NO2-Phe Dávkování vzorku: 50 mbar 6 s Separační napětí: +24 kV Teplota kazety: 25 °C Kapilára: 50 μm/365 μm vnitřní/vnější průměr; 48,0/33,6 cm celková/efektivní délka Promývání kapiláry: 180 s 1M NaOH, 30 s 0,1M NaOH, 60 s H2O, 120 s BGE; 60 s H2O Doba analýzy: 20 min 3 Laboratorní cvičení KVA L IT A T IV N Í A NA LÝZ A N E Z N ÁM ÝC H VZ OR KŮ P I V P O MO C Í CE-C4 D 2.3 Příprava vzorků 1. Přibližně 20 ml vzorku piva se přelije do kádinky o objemu 150 ml nebo větším. Následně je ponořen do ultrazvukové lázně na 5 sekund. Vzorek se tak zbaví většiny rozpuštěného CO2 a dojde k jeho napěnění. Jakmile pěna opadne, je vzorek přefiltrován přes membránový filtr s velikostí pórů 0,2 μm a dodatečně odplyněn ponořením do ultrazvukové lázně na 10 minut. 2. Takto upravený vzorek se nechá temperovat na teplotu zásobního roztoku NO2-Phe (10 mM NO2-Phe). Poté se smíchá 25 μl 10 mM NO2-Phe s 975 μl vzorku piva. Vznikne tak 1,025× ředěný vzorek piva obohacený o 250 μM NO2-Phe. Po promíchání jsou vzorky připraveny k analýze. 3. Do viálky se přenese 600 μl vzorku, viálka se vzorkem se umístí do známé pozice v karuselu a spustí se analýza. 2.4 Analýza a vyhodnocení záznamů Pod odborným dohledem se neznámé vzorky piv postupně zanalyzují. Podle obrázku 3 se provede integrace vyznačených oblastí. Plochy jednotlivých oblastí se importují do připravené tabulky, která ukáže procentuální shodu s knihovnou v závislosti na zvolené chybě. Podle rozdílů ve shodách mezi jednotlivými vzorky piv v knihovně se pořízený záznam neznámého vzorku srovná s dvěma až třemi záznamy z knihovny s nejvyšší procentuální shodou. Závěrem by měla být úspěšná identifikace neznámého vzorku piva anebo sdělení, že neznámý vzorek piva nemá žádnou shodu s knihovnou (jedná se zkrátka o pivo, které v knihovně není). Obrázek 3 - Oblasti záznamu, které se integrují metodou parabolické interpolace. Plochy jednotlivých oblastí se exportují do tabulkového softwaru pro hledání nejvyšší shody s knihovnou. Záznam je 1,025× ředěné pivo Bernard světlé výčepní pivo obohacené o 250 μM NO2-Phe (IS). 2.5 Úkol Identifikace neznámého vzorku piva. 4