Mutagenesis as a tool for improving lectins from pathogenic bacteria

MRÁZKOVÁ, Jana, Martina POKORNÁ a Michaela WIMMEROVÁ. Mutagenesis as a tool for improving lectins from pathogenic bacteria. In Struktura a interakce biomolekul II. 2012.

Základní údaje

• Originální název: Mutagenesis as a tool for improving lectins from pathogenic bacteria
• Název česky: Mutageneze jako nástroj pro vylepšování lektinů z patogenních mikroorganismů
• Autoři: MRÁZKOVÁ, Jana (203 Česká republika, domácí), Martina POKORNÁ (203 Česká republika) a Michaela WIMMEROVÁ (203 Česká republika, garant).
• Vydání: Struktura a interakce biomolekul II, 2012.

Další údaje

• Originální jazyk: angličtina
• Typ výsledku: Konferenční abstrakt
• Obor: 10600 1.6 Biological sciences
• Stát vydavatele: Česká republika
• Utajení: není předmětem státního či obchodního tajemství
• Kód RIV: RIV/00216224:14310/12:00066760
• Organizační jednotka: Přírodovědecká fakulta
• Klíčová slova česky: lektiny mutageneze řízená evoluce patogenní bakterie
• Klíčová slova anglicky: lectins mutagenesis directed evolution pathogenic bacteria

Anotace

Directed evolution is widely used in protein engineering for producing proteins with altered or improved properties. This powerful tool includes several main approaches. The first is a random mutagenesis, which is used for creating random mutations anywhere in the gene of interest. The second is a targeted random mutagenesis, which is utilized for preparing mutants with random base substitutions in selected hotspots. In addition, a site directed mutagenesis is based on rational design and it serves for creating specific amino acid substitutions in selected hotspots. In our work two technical approaches - the targeted-random mutagenesis via mixture of oligonucleotide primers and the site directed mutagenesis via two primers carrying specific substitution – are employed. Lectins are proteins produced by different organisms. They are able to bind various sugars specifically. This fact is very important especially in host pathogen interactions where lectins help to pathogen in adhesion to sugar moieties presented on host cells. Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia solanacearum and Burkholderia cenocepacia are opportunistic pathogens which attack mainly imunocompromised patients. These bacteria produce lectins that display significant similarities. The PA-IIL lectin from bacterium P. aeruginosa was chosen as a primary target gene to be modified via targeted random mutagenesis. This soluble protein is well-characterized and it shows very high affinity for L-fucose but it can bind several monosaccharides with similar stereochemistry e.g. L-galactose or D-mannose. Orthologues of this lectin have been identified in bacteria R. solanacearum (RS-IIL) and B. cenocepacia (BC2L-A). However, these two PA-IIL-like lectins prefer D-mannose instead of L-fucose. The aim of this work is to produce Ca-dependent lectins with a sharp specificity to L-fucose. The lectins with improved properties could be further used in biotechnology and for bioanalytical purposes.

Anotace česky

Řízená evoluce je široce využívaná v proteinovém inženýrství pro produkcí proteinů s pozměněnými anebo vylepšenými vlastnostmi. Tento účinný nástroj zahrnuje několik hlavních přístupů. První je náhodná mutageneze, která je využívána pro tvorbu náhodných mutací kdekoliv v genu zájmu. Druhým je cíleně náhodná mutageneze, která je využívána k přípravě mutantů s náhodnými substitucemi v předem vybraných místech. Další metodou je místně cílená mutageneze, která je založená na racionálním designu a slouží pro vytváření specifických záměn aminokyselin ve vybraných místech. V této práci jsou využity dvě mutační techniky - cíleně náhodná mutageneze pomocí směsi oligonukleotidových primerů a místně cílená mutageneze pomocí primerů nesoucích specifické substituce. Lektiny jsou proteiny produkované různými mikroorganismy. Jsou schopné specificky vázat různé cukry. Tento fakt je velmi důležitý především při interakci hostitele s patogenem, kdy lektiny pomáhají patogenu v adhesi na cukerná residua přítomná na hostitelských buňkách. Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia solanacearum a Burkholderia cenocepacia jsou příležitostné patogeny, které napadají především pacienty se sníženou imunitou. Tyto bakterie produkují lektiny, které vykazují významnou podobnost. PA-IIL lektin z bakterie P. aeruginosa byl vybrán jako primární cílový gen k modifikaci pomocí cíleně náhodné mutageneze. Tento rozpustný protein je velmi dobře charakterizován a vykazuje velmi vysokou afinitu pro L-fukosu ale váže ještě několik dalších monosacharidů s podobnou stereochemií např. L-galaktosu nebo D-mannosu. Ortology tohoto lektinu byly identifikovány v bakteriích R. solanacearum (RS-IIL) a B. cenocepacia (BC2L-A). Nicméně tyto dva lektiny preferují vazbu D-mannosy namísto L-fukosy. Cílem této práce je připravit Ca-dependentní lektiny čistě specifické pro L-fukosu. Lektiny s vylepšenými vlastnostmi mohou být později využity v biotechnologii a pro bioanalytcké účely.

Návaznosti

• GD301/09/H004, projekt VaV: Název: Molekulární a strukturní biologie vybraných cytostatik. Od mechanistických studií k chemoterapii rakoviny

Investor: Grantová agentura ČR, Molekulární a strukturní biologie vybraných cytostatik. Od mechanických studií k chemoterapii rakoviny