SVOBODA, Marek, Jitka PACHOLÍKOVÁ, Pavel FABIAN and Dana DVOŘÁKOVÁ. Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích (--). In Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004. 1. vyd. Brno: Masarykův onkologický ústav v Brně, 2004. p. 55. ISBN 80-86793-01-X.
Other formats:   BibTeX LaTeX RIS
Basic information
Original name Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích
Name in Czech Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích
Name (in English) --
Authors SVOBODA, Marek (203 Czech Republic, guarantor), Jitka PACHOLÍKOVÁ (203 Czech Republic), Pavel FABIAN (203 Czech Republic) and Dana DVOŘÁKOVÁ (203 Czech Republic).
Edition 1. vyd. Brno, Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004, p. 55-55, 2004.
Publisher Masarykův onkologický ústav v Brně
Other information
Original language Czech
Type of outcome Proceedings paper
Field of Study 30200 3.2 Clinical medicine
Country of publisher Czech Republic
Confidentiality degree is not subject to a state or trade secret
Organization unit Faculty of Medicine
ISBN 80-86793-01-X
Keywords in English Izolace RNA; Real-Time PCR; formalin fixed tissue; lymphoma
Tags formalin fixed tissue, Izolace RNA, Lymphoma, real-time PCR
Tags Reviewed
Changed by Changed by: prof. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., učo 19402. Changed: 14/10/2007 01:03.
Abstract
Úvod Tkáně fixované ve formalínu a archivované v parafinových bločcích, jsou nejdostupnějším materiálem pro retrospektivní klinické studie. Význam tohoto zdroje narůstá v souvislosti s potřebou validace nově determinovaných diagnostických a prognostických markerů, jejichž výpovědní hodnotou je míra genové exprese. Kvantitativní analýza genové exprese je v současnosti nejčastěji prováděna pomocí Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) a DNA čipů. Tyto metody vyžadují dostatečné množství kvalitní RNA, což v případě jednoho DNA čipu znamená 10-50 ěg celkové RNA. Problém izolace RNA z tkání archivovaných v parafinu spočívá zejména v její nepoužitelnosti pro vysoký stupeň degradace. K ní dochází především v mezidobí od získání tkáně do završení její fixace. Pro tento účel nevhodná formalínová fixace způsobuje navíc tvorbu tzv. "cross-linking" vazeb mezi nukleovými kyselinami a proteiny a kovalentně modifikuje RNA. Náročnost izolace kvalitní RNA z parafinových bločků za účelem kvantitativního hodnocení genové exprese dokresluje i to, že dosud byla ve světové literatuře publikována pouze jediná práce popisující takový postup. Výsledky V naší práci prezentujeme vlastní způsob izolace RNA, který jsme úspěšně vyzkoušeli u 40 vzorků tkání fixovaných ve formalinu a archivovaných v parafinových bločcích. Stáří bločků se pohybovalo v rozmezí 1 až 29 let, RNA získaná z cca 8 řezů o šířce 8 ěm dosahovala po nezbytném ošetření DNasou I průměrné koncentrace 330 ng/ěl a indexu absorbance A260/280 1,68+/-0,16. Elektroforéza prokázala ve všech případech určitý stupeň degradace RNA, nicméně byla vždy zachována zřetelná detekce 28S i 18S rRNA. Vyizolovaná RNA byla velmi úspěšně použita k RT-PCR a QRT-PCR. Výsledky QRT-PCR kvantifikující expresi sledovaného genu byly ve shodě s výsledky semikvantitativního imunohistochemického hodnocení korespondujícího proteinu (t-test: p = 0,003). Před izolací RNA jsme ustoupili od deparafinizace, která neovlivnila výtěžnost, nicméně snižovala kvalitu RNA. Lyzační roztok byl založen na Proteinase K, obsahoval inhibitory RNAsy a doba lyzace činila 12 hodin při teplotě 60C. K samotné izolaci jsme použili v modifikovaném postupu Trizol. Závěr Vlastním protokolem jsme provedli úspěšnou izolaci RNA z tkání fixovaných formalínem a archivovaných v parafinových bločcích. RNA dosahovala dostatečného množství a kvality k použití pro RT-PCR a QRT-PCR. Zda ji bude možné využít i pro DNA čipy testujeme v současnosti.
Abstract (in English)
This abstract exists only in Czech language.
PrintDisplayed: 24/11/2020 16:26