Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání
fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích

D 2004

Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích

SVOBODA, Marek, Jitka PACHOLÍKOVÁ, Pavel FABIAN and Dana DVOŘÁKOVÁ

Basic information

Original name

Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích

Name in Czech

Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích

Name (in English)

Authors

SVOBODA, Marek (203 Czech Republic, guarantor), Jitka PACHOLÍKOVÁ (203 Czech Republic), Pavel FABIAN (203 Czech Republic) and Dana DVOŘÁKOVÁ (203 Czech Republic)

Edition

1. vyd. Brno, Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004, p. 55-55, 2004

Publisher

Masarykův onkologický ústav v Brně

Other information

Language

Czech

Type of outcome

Stať ve sborníku

Field of Study

30200 3.2 Clinical medicine

Country of publisher

Czech Republic

Confidentiality degree

není předmětem státního či obchodního tajemství

Organization unit

Faculty of Medicine

ISBN

80-86793-01-X

Keywords in English

Izolace RNA; Real-Time PCR; formalin fixed tissue; lymphoma

Abstract

ORIG EN

V originále

Úvod Tkáně fixované ve formalínu a archivované v parafinových bločcích, jsou nejdostupnějším materiálem pro retrospektivní klinické studie. Význam tohoto zdroje narůstá v souvislosti s potřebou validace nově determinovaných diagnostických a prognostických markerů, jejichž výpovědní hodnotou je míra genové exprese. Kvantitativní analýza genové exprese je v současnosti nejčastěji prováděna pomocí Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) a DNA čipů. Tyto metody vyžadují dostatečné množství kvalitní RNA, což v případě jednoho DNA čipu znamená 10-50 ěg celkové RNA. Problém izolace RNA z tkání archivovaných v parafinu spočívá zejména v její nepoužitelnosti pro vysoký stupeň degradace. K ní dochází především v mezidobí od získání tkáně do završení její fixace. Pro tento účel nevhodná formalínová fixace způsobuje navíc tvorbu tzv. "cross-linking" vazeb mezi nukleovými kyselinami a proteiny a kovalentně modifikuje RNA. Náročnost izolace kvalitní RNA z parafinových bločků za účelem kvantitativního hodnocení genové exprese dokresluje i to, že dosud byla ve světové literatuře publikována pouze jediná práce popisující takový postup. Výsledky V naší práci prezentujeme vlastní způsob izolace RNA, který jsme úspěšně vyzkoušeli u 40 vzorků tkání fixovaných ve formalinu a archivovaných v parafinových bločcích. Stáří bločků se pohybovalo v rozmezí 1 až 29 let, RNA získaná z cca 8 řezů o šířce 8 ěm dosahovala po nezbytném ošetření DNasou I průměrné koncentrace 330 ng/ěl a indexu absorbance A260/280 1,68+/-0,16. Elektroforéza prokázala ve všech případech určitý stupeň degradace RNA, nicméně byla vždy zachována zřetelná detekce 28S i 18S rRNA. Vyizolovaná RNA byla velmi úspěšně použita k RT-PCR a QRT-PCR. Výsledky QRT-PCR kvantifikující expresi sledovaného genu byly ve shodě s výsledky semikvantitativního imunohistochemického hodnocení korespondujícího proteinu (t-test: p = 0,003). Před izolací RNA jsme ustoupili od deparafinizace, která neovlivnila výtěžnost, nicméně snižovala kvalitu RNA. Lyzační roztok byl založen na Proteinase K, obsahoval inhibitory RNAsy a doba lyzace činila 12 hodin při teplotě 60C. K samotné izolaci jsme použili v modifikovaném postupu Trizol. Závěr Vlastním protokolem jsme provedli úspěšnou izolaci RNA z tkání fixovaných formalínem a archivovaných v parafinových bločcích. RNA dosahovala dostatečného množství a kvality k použití pro RT-PCR a QRT-PCR. Zda ji bude možné využít i pro DNA čipy testujeme v současnosti.

In English

This abstract exists only in Czech language.

Citovat

SVOBODA, Marek, Jitka PACHOLÍKOVÁ, Pavel FABIAN and Dana DVOŘÁKOVÁ. Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích (--). In Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004. 1st ed. Brno: Masarykův onkologický ústav v Brně, 2004, p. 55. ISBN 80-86793-01-X.

@inproceedings{726215,
   author = {Svoboda, Marek and Pacholíková, Jitka and Fabian, Pavel and Dvořáková, Dana},
   address = {Brno},
   booktitle = {Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004},
   edition = {1.},
   keywords = {Izolace RNA; Real-Time PCR; formalin fixed tissue; lymphoma},
   language = {cze},
   location = {Brno},
   isbn = {80-86793-01-X},
   pages = {55-55},
   publisher = {Masarykův onkologický ústav v Brně},
   title = {Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích},
   year = {2004}
}

TY  - JOUR
ID  - 726215
AU  - Svoboda, Marek - Pacholíková, Jitka - Fabian, Pavel - Dvořáková, Dana
PY  - 2004
TI  - Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích
PB  - Masarykův onkologický ústav v Brně
CY  - Brno
SN  - 808679301X
KW  - Izolace RNA
KW  - Real-Time PCR
KW  - formalin fixed tissue
KW  - lymphoma
N2  - Úvod Tkáně fixované ve formalínu a archivované v parafinových bločcích, jsou nejdostupnějším materiálem pro retrospektivní klinické studie. Význam tohoto zdroje narůstá v souvislosti s potřebou validace nově determinovaných diagnostických a prognostických markerů, jejichž výpovědní hodnotou je míra genové exprese. Kvantitativní analýza genové exprese je v současnosti nejčastěji prováděna pomocí Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) a DNA čipů. Tyto metody vyžadují dostatečné množství kvalitní RNA, což v případě jednoho DNA čipu znamená 10-50 ěg celkové RNA. Problém izolace RNA z tkání archivovaných v parafinu spočívá zejména v její nepoužitelnosti pro vysoký stupeň degradace. K ní dochází především v mezidobí od získání tkáně do završení její fixace. Pro tento účel nevhodná formalínová fixace způsobuje navíc tvorbu tzv. "cross-linking" vazeb mezi nukleovými kyselinami a proteiny a kovalentně modifikuje RNA. Náročnost izolace kvalitní RNA z parafinových bločků za účelem kvantitativního hodnocení genové exprese dokresluje i to, že dosud byla ve světové literatuře publikována pouze jediná práce popisující takový postup. Výsledky V naší práci prezentujeme vlastní způsob izolace RNA, který jsme úspěšně vyzkoušeli u 40 vzorků tkání fixovaných ve formalinu a archivovaných v parafinových bločcích. Stáří bločků se pohybovalo v rozmezí 1 až 29 let, RNA získaná z cca 8 řezů o šířce 8 ěm dosahovala po nezbytném ošetření DNasou I průměrné koncentrace 330 ng/ěl a indexu absorbance A260/280 1,68+/-0,16. Elektroforéza prokázala ve všech případech určitý stupeň degradace RNA, nicméně byla vždy zachována zřetelná detekce 28S i 18S rRNA. Vyizolovaná RNA byla velmi úspěšně použita k RT-PCR a QRT-PCR. Výsledky QRT-PCR kvantifikující expresi sledovaného genu byly ve shodě s výsledky semikvantitativního imunohistochemického hodnocení korespondujícího proteinu (t-test: p = 0,003). Před izolací RNA jsme ustoupili od deparafinizace, která neovlivnila výtěžnost, nicméně snižovala kvalitu RNA. Lyzační roztok byl založen na Proteinase K, obsahoval inhibitory RNAsy a doba lyzace činila 12 hodin při teplotě 60C. K samotné izolaci jsme použili v modifikovaném postupu Trizol. Závěr Vlastním protokolem jsme provedli úspěšnou izolaci RNA z tkání fixovaných formalínem a archivovaných v parafinových bločcích. RNA dosahovala dostatečného množství a kvality k použití pro RT-PCR a QRT-PCR. Zda ji bude možné využít i pro DNA čipy testujeme v současnosti.
ER  -

SVOBODA, Marek, Jitka PACHOLÍKOVÁ, Pavel FABIAN and Dana DVOŘÁKOVÁ. Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích (--). In \textit{Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004}. 1st ed. Brno: Masarykův onkologický ústav v Brně, 2004, p.~55. ISBN~80-86793-01-X.

Detailed Information on Publication Record