Zmapovanie interakcií kolicínov U a Y s receptorom OmpA

BOSÁK, Juraj and David ŠMAJS. Zmapovanie interakcií kolicínov U a Y s receptorom OmpA (Mapping the interactions of colicins U and Y with their receptor OmpA). In XVII. Tomáškovy dny. Sborník abstraktů, str. 2-3, Brno. 2008.

Basic information

• Original name: Zmapovanie interakcií kolicínov U a Y s receptorom OmpA
• Name in Czech: Zmapovanie interakcií kolicínov U a Y s receptorom OmpA
• Name (in English): Mapping the interactions of colicins U and Y with their receptor OmpA
• Authors: BOSÁK, Juraj (703 Slovakia, guarantor) and David ŠMAJS (203 Czech Republic).
• Edition: XVII. Tomáškovy dny. Sborník abstraktů, str. 2-3, Brno, 2008.

Other information

• Original language: Slovak
• Type of outcome: Conference abstract
• Field of Study: Genetics and molecular biology
• Country of publisher: Czech Republic
• Confidentiality degree: is not subject to a state or trade secret
• RIV identification code: RIV/00216224:14110/08:00027995
• Organization unit: Faculty of Medicine
• Keywords (in Czech): outer membrane protein A; OmpA; koliciny U Y K L; E. coli
• Keywords in English: outer membrane protein A; OmpA; colicins U Y K L; E. coli
• Tags: E. coli, OmpA, outer membrane protein A

Abstract

OmpA (outer membrane protein A) je proteín bunečného povrchu gramnegatívnych baktérií, tvorený dvoma doménami, transmembránovým b súdkom a globulárnou C doménou v periplazme. Predpokladá sa význam OmpA pri spojení vonkajšej membrány s peptidoglykánom. OmpA je využívaný tiež ako receptor baktériofágov a kolicínov. Interakcia s OmpA bola potvrdená u štyroch kolícínov U, Y, K a L. Ako receptor zodpovedný za primárnu interakciu sa uplatňuje iba v prípade kolicínov U a Y. U zvyšných dvoch kolicínov (K a L) ma funkciu pomocnú. Baktérie rodu Escherichia coli a Enterobacter aerogenes, líšiace sa v citlivosti ku kolicínom U, Y, K a L, syntetizujú OmpA s rozdielnou sekvenciou aminokyselín. Identifikované variabilné oblasti povrchových slučiek boli rozdelené na 11 segmentov o dĺžke 1 až 3 aminokyseliny. Tieto segmenty boli následne mutagenizované pomocou PCR. 11 párov navrhnutých primerov nieslo špecifickú mutáciu, obsahujúcu sekvenciu aminokyselín z OmpA E. aerogenes. Ako templát pri amplifikácii metódou PCR bol použitý plazmid s génom ompA z E. coli (gén kóduje len transmembránový b-súdok), pôvodne citlivým ku kolicínom. U sekvenčne správnych plazmidov bola stanovená citlivosť ku kolicínom U a Y v kmeňoch E. coli BL21. Pokles citlivosti ku kolicínu U bol zaznamenaný v prípade mutagenézy segmentov 1, 2, 3, 7, 9. Citlivosť ku kolicínu Y bola znížená mutáciami v segmentoch 1, 2, 7 a 9. Výrazný pokles citlivosti (v rozsahu 2 rádov) bol zaznamenaný u segmentov 1 a 2, pokles citlivosti u segmentov 3, 7, 9 bol v rozsahu 1 rádu, čo svedčí o rôznej intenzite interakcií. Pre segmenty 1, 2, 3, 7 a 9 bola vykonaná PCR mutagenéza obdobným spôsobom, pričom boli nahradené jednotlivé aminokyseliny v týchto segmentoch. Stanovením citlivosti ku kolicínom U a Y bol zaznamenaný pokles citlivosti u segmentov 1.1 a 2.2. Boli identifikované dve aminokyseliny podieľajúce sa na interakcii s kolicínmi U a Y, jedná sa o izoleucín I45 a glycín G48. Navyše u kolicínu U bol zaznamenaný pokles citlivosti i v segmente 7.3, ktorý predstavuje aminokyselinu serín (S129). Jednoaminokyselinové zámeny v segmentoch 3 a 9 nemali na citlivosť ku kolicínom žiadny efekt, predpokladaným dôvodom je schopnosť kompenzácie zmeny jednej aminokyseliny zvyšnými interagujúcimi aminokyselinami. Interakcia s kolicínmi prebieha na rôznych povrchových slučkách proteínu OmpA, pričom interakcie sa účastní rôznou intenzitou viacero aminokyselín.

Abstract (in Czech)

OmpA (outer membrane protein A) je protein buněčného povrchu gramnegativních bakterií, tvořený dvěma doménami transmembránovým b skládaným listem a globulární C-doménou v periplazmě. Předpokladá se význam OmpA při spojení vnější membrány s peptidoglykanem. OmpA je využívaný též jako receptor bakteriofágů a kolicínů. Interakcia s OmpA byla potvrzená u čtyř kolicinů U, Y, K a L.

Abstract (in English)

OmpA (outer membrane protein A) is an important protein of gramnegative bacteria cell envelope. It contains two domains transmembrane b-barrel and periplasmic globular C domain. It is supposed the importance of this protein in connection of outer membrane with rigid peptidoglycan layer. OmpA acts also as a receptor for many antibacterial agens bacteriophages and colicins. OmpA interacts with four colicins U, Y, K, and L. For colicins U and Y, OmpA has a major receptor function, whereas for colicin K and L, it is only a protein helping with transport. Bacteria of strains Escherichia coli and Enterobacter aerogenes differ in their sensitivity to colicins U and Y. These two strains have variability in OmpA sequence. Variable amino acids of OmpA extracellular loops were distributed into 11 segments. Every segment was built of 1 to 3 amino acids. We used PCR in mutagenesis of OmpAs segments. We proposed 11 pairs of primers. Every primers pair has a specific sequence from insensitive OmpA of E. aerogenes. By PCR mutagenesis, it was amplified a plasmid with ompA E. coli (only sequence of b-barrel), which was originally sensitive to colicins. Constructs were verifying by sequencing and the correct plasmids with targeted mutation were transformed in E. coli BL21 (lDE3ompA-). Then we provide a sensitivity of strains with mutant OmpA to colicins U and Y. The decrease of sensitivity to colicin U was observed in strains E. coli with mutation in OmpA segments 1, 2, 3, 7 and 9. By colicin Y, sensitivity was reduced in strains with mutation in segment 1, 2, 7, 9. The strong decrease of sensitivity was upon mutagenesis of segments 1 or 2 and weaker decrease of sensitivity was observed after mutation in segments 3, 7 or 9. This shows a different intensity of interaction. For identified segments 1, 2, 3, 7 and 9, PCR mutagenesis was done by analogous way, where simple amino acids were replaced. For segments 1.1 and 2.2, we observed a decrease of sensitivity. These two segments present amino acids isoleucin I45 and glycin G48. Change of one amino acid in segments 3, 7 or 9 has no effect on sensitivity to colicin. We suppose, the reason is a very small decrease of sensitivity or ability of other interacting amino acids to compensate the change of one amino acid. Colicins interact with receptor OmpA on various extracellular loops, and these interactions join several amino acids with various intensity.

Links

• MSM0021622415, plan (intention): Name: Molekulární podstata buněčných a tkáňových regulací

Investor: Ministry of Education, Youth and Sports of the CR, Molecular basis of cell and tissue regulations