Methods of directed evolution of PA-IIL lectin

MRÁZKOVÁ, Jana, Martina POKORNÁ and Michaela WIMMEROVÁ. Methods of directed evolution of PA-IIL lectin. In XIV. Setkání biochemiků a molekulárních biologů. 2010. ISBN 978-80-210-5164-5.

Basic information

• Original name: Methods of directed evolution of PA-IIL lectin
• Name in Czech: Metody řízené evoluce lektinu PA-IIL
• Authors: MRÁZKOVÁ, Jana (203 Czech Republic, belonging to the institution), Martina POKORNÁ (203 Czech Republic, belonging to the institution) and Michaela WIMMEROVÁ (203 Czech Republic, guarantor, belonging to the institution).
• Edition: XIV. Setkání biochemiků a molekulárních biologů, 2010.

Other information

• Original language: English
• Type of outcome: Conference abstract
• Field of Study: 10600 1.6 Biological sciences
• Country of publisher: Czech Republic
• Confidentiality degree: is not subject to a state or trade secret
• RIV identification code: RIV/00216224:14310/10:00044241
• Organization unit: Faculty of Science
• ISBN: 978-80-210-5164-5
• Keywords (in Czech): řízená evoluce; náhodná mutageneze in vitro; cíleně-náhodná mutageneze;lektin PA-IIL; Pseudomonas aeruginosa
• Keywords in English: directed evolution; random mutagenesis in vitro; targeted-random mutagenesis;lectin PA-IIL; Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Directed evolution is a powerful tool widely used in protein engineering for producing proteins with altered or improved properties. This approach includes a lot of methods used to create diverse mutant libraries and to screen these libraries. In our work two mutation techniques are being used. The first one is random mutagenesis by error-prone PCR (which introduces nucleotide changes during PCR due to the use of error-prone DNA polymerase and reaction conditions). The second one is targeted-random mutagenesis (which employs mixture of special primers carried random base substitutions on selected site). LecB, the gene coding PA-IIL lectin from bacterium Pseudomonas aeruginosa, was chosen as a target gene to be modified via random mutagenesis. This soluble protein is well-characterized and it is indisputable that it displays an unusually high affinity for monosaccharides widely occurring as terminal residues in cell surface glycoconjugates highly present in cystic fibrosis mucins. The mutagenesis could help us to create a protein with improved specificity and affinity. Currently, methods for high-throughput screening of mutant libraries and their binding properties by surface plasmon resonance have been optimised to find mutants with modified affinity and specificity. The mutated lectins with improved properties could be further used in biotechnology and for bioanalytical purposes.

Abstract (in Czech)

Řízená evoluce je účinný nástroj široce používaný v proteinovém inženýrství k produkci proteinů s pozměněnými anebo vylepšenými vlastnostmi. Tento přístup zahrnuje mnoho metod, které se používají k produkci knihoven mutantů a ke screeningu těchto knihoven. V naší práci jsou používány dvě mutační techniky. První je náhodná mutageneze pomocí error-prone PCR (která zavádí nukleotidové záměny během PCR pomocí DNA polymerasy náchylné k chybám a mutačních reakčních podmínek). Druhá technika je cíleně-náhodná mutageneze (která využívá směsi speciálních primerů nesoucích náhodné záměny bazí na vybraném místě). Gen lecB, který kóduje lektin PA-IIL původem z Pseudomonas aeruginosa byl vybrán jako cílový gen, který bude modifikován náhodnou mutagenezí. Tento rozpustný protein je dobře charakterizován a vykazuje neobvykle vysokou afinitu pro monosacharidy, které se často vyskytují jako terminální residua glykokonjugátů buněčného povrchu v mucinu pacientů s cystickou fibrosou. Mutageneze by nám měla pomoci vytvořit protein s vylepšenou afinitou a specifitou. V současné době jsou optimalizovány metody pro high-throughput screening knihoven mutantů a testování vazebných vlastností mutantů pomocí resonance povrchového plasmonu, aby byli nalezeni mutanti s pozměněnou afinitou a specifitou. Mutované lektiny s vylepšenými vlastnostmi by mohly být v budoucnu využity v biotechnologiích a pro bioanalytické účely.

Links

• GA303/09/1168, research and development project: Name: Lektiny z lidských patogenů - struktura, funkce, inženýrství

Investor: Czech Science Foundation, Lectins from human pathogens - structure, function, engineering

• GD301/09/H004, research and development project: Name: Molekulární a strukturní biologie vybraných cytostatik. Od mechanistických studií k chemoterapii rakoviny

Investor: Czech Science Foundation

• LC06030, research and development project: Name: Biomolekulární centrum

Investor: Ministry of Education, Youth and Sports of the CR, Biomolecular centre

• MSM0021622413, plan (intention): Name: Proteiny v metabolismu a při interakci organismů s prostředím

Investor: Ministry of Education, Youth and Sports of the CR, Proteins in metabolism and interaction of organisms with the environment