Random mutagenesis of lectins and high-throughput screening of mutant libraries

MRÁZKOVÁ, Jana, Martina POKORNÁ a Michaela WIMMEROVÁ. Random mutagenesis of lectins and high-throughput screening of mutant libraries. In 36th FEBS Congress. ISSN 1742-464X. 2011.

Základní údaje

• Originální název: Random mutagenesis of lectins and high-throughput screening of mutant libraries
• Název česky: Náhodná mutageneze lektinů a high-throughput screening knihoven mutantů
• Autoři: MRÁZKOVÁ, Jana (203 Česká republika, domácí), Martina POKORNÁ (203 Česká republika, domácí) a Michaela WIMMEROVÁ (203 Česká republika, garant, domácí).
• Vydání: 36th FEBS Congress, 2011.

Další údaje

• Originální jazyk: angličtina
• Typ výsledku: Konferenční abstrakt
• Obor: 10600 1.6 Biological sciences
• Stát vydavatele: Itálie
• Utajení: není předmětem státního či obchodního tajemství
• Impakt faktor: Impact factor: 3.790
• Kód RIV: RIV/00216224:14740/11:00049899
• Organizační jednotka: Středoevropský technologický institut
• ISSN: 1742-464X
• UT WoS: 000292333102529
• Klíčová slova česky: lektin; PA-IIL; náhodná mutageneze; high-throughput screening, cíleně-náhodná mutageneze
• Klíčová slova anglicky: lectin; PA-IIL; random mutagenesis; high-throughput screening; targeted-random mutagenesis
• Štítky: rivok

Anotace

Random mutagenesis is often used in protein engineering for producing proteins with altered or improved properties. Random mutagenesis includes a lot of methods used to create diverse mutant libraries and to screen these libraries. In our work two methodical directions are being applied. Error-prone PCR is based on error-prone DNA polymerase which introduces nucleotide changes during extension of amplified DNA. Mutational reaction conditions can support even higher number of random substitutions. Targeted-random mutagenesis is being performed by mixture of special oligonucleotide primers carried random base substitutions on selected site(s). An effective high-throughput screening must be employed while large mutant libraries are produced by random mutagenesis techniques. Currently, methods of high-throughput screening have been optimized to maximize of automation of this process. Several approaches simplifying the protein mixture for binding studies were applied. A signal sequence for expression to periplasm was added to gene of our interest and cultivation of cell culture in the presence of glycine for protein leaking out has been performed. An oligohistidine anchor was added to N terminus of proteins of our interest and chelating chromatography in mini spin columns has been tested. Due to good thermostability of target proteins, temperature clean-up of cell lysate has been optimized. LecB, the gene coding PA-IIL lectin from bacterium P. aeruginosa, was chosen as a primary target gene to be modified via random mutagenesis. This soluble protein is well-characterized and it shows very high affinity for L-fucose but it can bind several monosaccharides with similar stereochemistry [1]. The aim of this work is to produce mutants with interestedly modified specificity and/or affinity for monosaccharides. The mutated lectins with improved properties could be further used in biotechnology and for bioanalytical purposes.

Anotace česky

Náhodná mutageneze je často využívána v proteinovém inženýrství k produkci proteinů s pozměněnými nebo vylepšenými vlastnostmi. Náhodná mutageneze zahrnuje mnoho metod, které jsou používány k produkci rozmanitých knihoven mutantů a ke screeningu těchtno knihoven. V této práci jsou aplikovány dva metodické směry. Error-prone PCR je založena na DNA polymerase náchylné k chybám, která zavádí nukleotidové změny během prodlužování amplifikované DNA. Mutační reakční podmínky mohou napomáhat vyššímu počtu náhodných substitucí. Cíleně-náhodná mutageneze je prováděna pomocí směsi speciálních oligonukleotidových primerů. které nesou náhodné substituce bazí na vybraném místě. Efektivní high-throughput screening je nezbytný, protože technikami náhodné mutageneze jsou produkovány rozsáhlé knihovny mutantů. V současné době jsou optimalizovány metody high-throughput screeningu, aby byla maximalizována automatizace tohoto procesu. Bylo aplikováno několik postupů ke zjednodušení směsi proteinů pro vazebné studie. Ke genu zájmu byla přidána signální sekvence pro expresi do periplasmy a byla provedena kultivace buněčné kultury v přítomnosti glycinu pro sekreci do media. Na N-konec proteinů byla přidána oligohistidinová kotva a byla testována chelatační chromatografie v minicentrifugačních kolonkách. Díky dobré termostabilitě cílových proteinů bylo možno zoptimalizovat teplotní přečištění hrubých buněčných lyzátů. LecB, gen kódující PA-IIL lektin z bakterie P. aeruginosa byl vybrán jako primární cílový gen pro modifikaci pomocí náhodné mutageneze. Tento rozpustný protein je velmi dobře charakterizovaný a vykazuje vysokou afinitu pro L-fukosu, ale dokáže také vázat několik monosacharidů s podobnou stereochemií. Cílem této práce je připravit mutanty se zajímavě pozměněnou specifitou a/nebo afinitou pro monosacharidy. Mutované lektiny s vylepšenými vlastnostmi mohou být později využity v biotechnologii a pro bioanalytické účely.

Návaznosti

• GA303/09/1168, projekt VaV: Název: Lektiny z lidských patogenů - struktura, funkce, inženýrství

Investor: Grantová agentura ČR, Lektidy z lidských patogenů - struktura, funkce, inženýrství

• GD301/09/H004, projekt VaV: Název: Molekulární a strukturní biologie vybraných cytostatik. Od mechanistických studií k chemoterapii rakoviny

Investor: Grantová agentura ČR, Molekulární a strukturní biologie vybraných cytostatik. Od mechanických studií k chemoterapii rakoviny

• LC06030, projekt VaV: Název: Biomolekulární centrum

Investor: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, Biomolekulární centrum

• MSM0021622413, záměr: Název: Proteiny v metabolismu a při interakci organismů s prostředím

Investor: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, Proteiny v metabolismu a při interakci organismů s prostředím