Vliv rozpouštědla krystalové violeti na hodnocení produkce biofilmu
A. Siváková, F. Růžička, V. Holá, M. Dvořáčková, M. Mahelová, T. Peroutková
Mikrobiologický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice u sv.
Anny v Brně, Brno, CZ
Summary
Biofilm formation is considered to be one of virulence factor of microorganisms [1]. It
helps them to colonize any environment, in medicine especially artificial materials such as
plastic catheters. Biofilm is also hard to eradicate because of its high resistance to antimicrobials.
There are several different techniques to visualize biofilm like fluorescence, highresolution
microscopic techniques or radiolabeling [2]. One of the commonly used method for
the indirect quantification is staining with crystal violet [3, 4]. In our study we tested three
different chemicals to dissolve crystal violet before the optical density of the solution was
spectrophotometrically measured. We tried ethanol, ethanol with HCl (100:3) and 33% glacial
acetic acid for releasing the bound dye [3]. We concluded that there was a significant
difference in their ability to dissolve crystal violet. The most efficient media for
resolubilization of crystal violet was 33% glacial acetic acid [5].
Úvod
Tvorba biofilmu je považována za jeden z faktorů virulence bakterií. Díky tomuto
způsobu růstu mohou kolonizovat jim jinak nepříznivá prostředí, a také jsou mnohem
odolnější vůči antibiotikům. Metod průkazu biofilmu je mnoho a mezi jednu z
nejjednodušších a nejběžnějších patří kultivace v mikrotitrační destičce barvená krystalovou
violetí.
Materiály a metody
Pro testy byly použity následující sbírkové kmeny: S. epidermidis (CCM7221), C.
albicans (SC5314), C. albicans (GDH2346), C. tropicalis (AAHB73). Dále bylo použito 6
klinických kmenů: Enterobacter cloacae, S. aureus, 2 kmeny P. aeruginosa a 2 kmeny C.
parapsilosis.
Jako médium ke kultivaci biofilmu byl použit BHI (HiMedia, India) bujón s
přídavkem 4 % glukózy.
Kmeny byly nejprve suspendovány ve sterilním fyziologickém roztoku do výsledné
hodnoty zákalu 0,5 McFarland. Z takto získané homogenní suspenze bylo odebráno 50 μl a
přeneseno do zkumavky obsahující 4 950 μl sterilního BHI bujónu se 4 % glukózy. Obsah byl
opět homogenizován na vortexu 10 s. Poté bylo odebráno 200 μl suspenze živného média s
kmenem a přeneseno do jamky s plochým dnem v mikrotitrační destičce pro tkáňové kultury
(GAMA GROUP a.s., Česká republika). Jakmile byla destička zaplněná, vzorky se ponechaly
24 hod aerobně kultivovat při teplotě 37°C, poté byly jamky 3x promyty 250 μl sterilního
fyziologického roztoku a fixovány sušením při 37°C přes noc.
Zafixované destičky byly barveny 15 min 250 μl krystalové violeti. Zbytky
nenavázaného barviva byly odstraněny promýváním pod tekoucí vodou, což se opakovalo 4x.
Po opláchnutí byly destičky osušeny a ponechány 2 hod při pokojové teplotě.
Do nabarvených destiček bylo napipetováno 150 μl rozpouštědla, které se nechalo
působit 15 min. Jako rozpouštědlo jsme postupně vyzkoušeli 95% denaturovaný ethanol,
kyselý alkohol (směs 100 ml 95% ethanolu a 3 ml koncentrované HCl) a 33% kyselinu
octovou. Po vyluhování barviva bylo 100 μl eluátu přeneseno do jamek s plochým dnem čisté
mikrotitrační destičky (GAMA GROUP a.s., Česká republika). Absorbance jednotlivých
eluátů byla měřena pomocí spektrofotometru (Anthos Labtec Instruments 10.500, Austria) při
vlnové délce 595 nm, referenční filtr 690 nm. Pro zvýšení přesnosti měření, kvůli
intenzivnímu zbarvení některých eluátů, byly eluáty dále ředěny v poměru 1:1 destilovanou
vodou a jejich absorbance byla opět hodnocena spektrofotometricky.
Mikrotitrační destička s biofilmem byla po eluci opláchnuta pod tekoucí vodou. Po
usušení byly jednotlivé jamky dále eluovány 150 μl 33% kyseliny octové 15 min.
Absorbance jednotlivých eluátů byla měřena spektrofotometricky při vlnové délce 595 nm,
referenční filtr 690 nm.
Výsledky
Nejlépe vytvořily biofilm kmeny S. epidermidis, S. aureus a C. tropicalis. Tyto kmeny
měly odečtenou hodnotu absorbance v neředěném eluátu s kyselinou octovou vyšší než 1,7.
Všechny kmeny C. albicans a C. parapsilosis tvořily biofilm v BHI se 4 % glukózy pouze
slabě, hodnota jejich absorbance byla v průměru 0,1 – 0,3 . Kmeny E. cloacae a
P. aeruginosa byly středně silnými producenty biofilmu a hodnoty odečtených absorbancí
byly v rozmezí 0,57 – 0,87.
U kmenů S. epidermidis, S. aureus a C. tropicalis se hodnoty odečtených absorbancí
statisticky významně lišily při hladině významnosti 0,01 pro jednotlivá rozpouštědla
krystalové violeti. Tento rozdíl hodnot absorbancí byl jak mezi 95% denaturovaným
ethanolem a 33% kyselinou octovou, tak mezi kyselým alkoholem a 33% kyselinou octovou.
Pro kmeny C. albicans, C. parapsylosis, E. cloacae se neprokázal statisticky
významný rozdíl mezi hodnotami absorbancí jednotlivých eluátů při použití 95%
denaturovaného ethanolu, kyselého alkoholu a 33% kyseliny octové.
Diskuze a závěr
Při porovnání hodnot absorbancí u jednotlivých kmenů při použití různých
rozpouštědel krystalové violeti vyšlo najevo, že hodnoty u kmenů, které silně tvoří biofilm
nejsou ve statisticky významném rozmezí (hladina významnosti 0,01) totožné. Došlo k
postupnému nárůstu hodnot absorbancí podle kyselosti rozpouštědla barviva. Toto lze
vysvětlit tím, že krystalová violeť patří mezi zásaditá barviva [6] a je tedy lépe rozpustná v
kyselých rozpouštědlech, což se projeví především při vyšší koncentraci barviva, které je
třeba rozpustit. Z tohoto důvodu se zdá metoda odbarvení za použití 33% kyseliny octové
jako nejlepší (tento výsledek odpovídá postupu u Stepanovic [5]).
Literatura
1. Růžička F, Holá V, Votava M, et al. Biofilm detection and the clinical significance of
Staphylococcus epidermidis isolates. Folia Microbiol. 2004; 49(5): 596-600
2. Negri M, Goncalves V, Silva S, et al. Crystal violet staining to quantify Candida adhesion
to epithelial cells. British Journal of Biomedical Science. 2010; 67 (3): 120-125
3. Stepanovic S, Vukovic D, Hola V, et al. Quantification of biofilm in microtiter plates:
overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm
production by staphylococci. APMIS. 2007; 115: 891-899
4. Hannig Ch, Follo M, Hellwig E, Al-Ahmad A. Visualization of adherent micro-organisms
using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 2010; 59: 1-7
5. Stepanovic S, Vukovic D, Dakic I, et al. A modified microtiter-plate test for quantification
of staphylococcal biofilm formation. Journal of Microbiological Methods. 2000; 40: 175-179
6. Müller J, Chytil F. Barviva v mikroskopické technice. 1. vyd. Praha: Academia; 1966. s.
215