M A S A R Y K O V A
U N I V E R Z I T A
PŘÍRODOVĚDECKÁ F A K U L T A
Molekulární
charakterizace
antivirového účinku
inhibitorů viru klíšťové
encefalitidy
Diplomová práce
HANA AL KIRBIOVÁ
Vedoucí práce: RNDr. Luděk Eyer, Ph.D.
Ústav experimentální biologie
Program Molekulární biologie a genetika
Brno 2022
MUIM I
SCI
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Bibliografický záznam
Autor:
Název práce:
Studijní program:
Vedoucí práce:
Rok:
Počet stran:
Klíčová slova:
Hana AI Kirbiová
Přírodovědecká fakulta
Masarykova univerzita
Ústav experimentální biologie
Molekulární charakterizace antivirového účinku inhibitorů viru
klíšťové encefalitidy
Molekulární biologie a genetika
RNDr. Luděk Eyer, Ph.D.
2022
70
virus klíšťové encefalitidy, nukleosidové analogy, antivirotika,
antivirotická rezistence, mutace, RNA-dependentní RNA
polymeráza
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Bibliographic record
Author:
Title of Thesis:
Hana AI Kirbiová
Faculty of Science
Masaryk University
Department of Experimental Biology
Molecular characterization of antiviral effect of tick-borne
encephalitis virus inhibitors
Degree Programme: Molecular biology and genetics
Supervisor:
Year:
Number of Pages:
Keywords:
RNDr. Ludek Eyer, Ph.D.
2022
70
tick-borne encephalitis virus, nucleoside analogues,
antivirotics, antiviral resistance, RNA-dependent RNA
polymerase
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Abstrakt
Virus klíšťové encefalitidy způsobuje vážné onemocnění nervové soustavy lidí
s potenciálně letálními nebo chronickými následky. Přes klinickou relevanci klíšťové
encefalitidy v současnosti stále není dostupné žádné specifické antivirotikum proti
této infekci. Z tohoto důvodu byl v posledních letech výzkum v této oblasti zaměřen
na nukleosidové analogy, které se již osvědčily v léčbě jiných flavivirových
onemocnění. Tato práce se konkrétně zaměřuje na tři nukleosidové inhibitory virové
replikace; 7-deaza-2'-C-metyladenosin (7-DCMA), 4'-azidocytidin (R-1479) a 4'azidoaracytidin
(RO-9187). Ke studiu mechanismu účinků těchto látek byly
selektovány mutantní virové kmeny disponující rezistencí k jednotlivým
nukleosidům, navíc byl selektován kmen rezistentní ke dvěma analogům zároveň,
konktrétně k látkám 7-DCMA a R-1479. Tyto kmeny byly dále fenotypově a
genotypově charakterizovány. Následně byly porovnáním genomů mutantních a
wild-type kmenů identifikovány bodové mutace v genu NS5 asociované s rezistencí
na jednotlivé analogy a byl sledován dopad těchto mutací na replikační fitness virů. U
mutant rezistentních na 7-DCMA byla identifikována mutace S603T, která byla
popsána již v předchozích studiích. U mutant rezistentních k R-1479 nebyla
potvrzena žádná primární mutace a u mutant rezistentních k RO-9187 byla nalezena
kandidátní mutace L611F. Dále byla identifikována zřejmě kompenzační mutace
Y453H, která se objevovala u všech typů mutant. Výskyt těchto mutací v genu NS5
pro RdRp potvrdil předpoklad, že nukleosidové analogy interagují s aktivním místem
této polymerázy. Porovnáním mutačních profilů jednotlivých mutant byla dále
vyloučena zkřížená rezistence mezi zkoumanými analogy, která by mohla v budoucnu
komplikovat léčbu těmito látkami nejen infekcí způsobenými virem klíšťové
encefalitidy ale i jiných flavivirů.
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Abstract
Tick-borne encephalitis virus causes severe and potentially lethal disease affecting
the human central nervous system and can develop into a chronic infection. Despite
the clinical relevance of tick-borne encephalitis, no specific antiviral therapy against
this infection is currently available. For this reason, in recent years research in this
area has focused on nucleoside analogues, that have already proven efficient in the
treatment of other flaviviral diseases. This thesis specifically focuses on three
nucleoside inhibitors of viral replication: 7-deaza-2'-C-methyladenosine (7-DCMA),
4'-azidocytidine (R-1479) and 4'-azidoaracytidine (RO-9187). To investigate the
mechanism of action of these substances, mutant virus strains resistant to these
nucleosides were selected, as well as a strain resistant to two analogues 7-DCMA and
R-1479 simultaneously. These strains were further characterized using phenotypic
and genotypic analysis. To identify the point mutations in the NS5 gene associated
with resistance to individual analogues, the genomes of mutant and wild-type strains
were compared. Subsequently, the impact of these mutations on the viral fitness was
monitored. The S603T mutation, that has been described in previous studies, has
been identified in 7-DCMA resistant mutants. No primary mutation was confirmed in
mutants resistant to R-1479 and one candidate mutation L611F was found in
mutants resistant to RO-9187. Furthermore, a Y453H compensatory mutation, which
occurred in all types of mutants, was identified. The occurrence of these mutations in
the NS5 gene for RdRp confirmed the hypothesis that nucleoside analogs interact
with the active site of this polymerase. Moreover, the presence of cross resistance,
that could complicate the future utilization of nucleoside analogues for treatment of
viral infections by these substances, was ruled out by comparing the mutation
profiles of individual mutants.
im u N i
S C I
M A S A R Y K O V A U N I V E R Z I T A
P Ř Í R O D O V Ě D E C K Á F A K U L T A
K O T L Á Ř S K Á 2 , 6 1 1 37 BRNO
I Č : 0 0 2 1 6 2 2 4
D I Č : C Z 0 0 2 1 6 2 2 4
ZADANÍ
DIPLOMOVÉ PRACE
Akademický rok: 2019/2020
Ústav: Ústav experimentální biologie
Studentka: Bc. Hana Al Kirbiová
Program: Molekulární biologie a genetika
Obor: Molekulární biologie a genetika
Ředitel Ústavu experimentální biologie PřF MU Vám ve smyslu Studijního a zkušebního řádu MU určuje diplomovou
práci s názvem:
Název práce: Molekulární charakterizace antivirového účinku inhibitorů viru klíšťové encefalitidy
Název práce anglicky: Molecular characterization of antiviral effect of tick-borne encephalitis virus inhibitors
Oficiální zadání:
Diplomová práce bude zaměřena na studium atestování biologických vlastností inhibitorů viru klíšťové encefalitidy molekulárními
metodami i klasickými virologickými technikami. Pozornost bude zaměřena na strukturní analoga nukleosidů
uplatňující se při inhibici replikace virové RNA. Studována bude rovněž rezistence viru na nukleosidové inhibitory
in vitro s cílem prozkoumat mechanismus účinku inhibičních látek. Získané poznatky povedou k hlubšímu porozumění
antivirovému účinku studovaných inhibitorů a budou tvořit základ pro vývoj nových terapeutik proti flavivirovým
infekcím.
Jazyk závěrečné práce: čeština
Vedoucí práce: Mgr. Luděk Eyer, Ph.D.
Datum zadání práce: 1. 10. 2019
V Brně dne: 2.10.2019
Souhlasím se zadáním (podpis, datum):
Bc. Hana Al Kirbiová Mgr. Luděk Eyer, Ph.D. RNDr. Pavel Lízal, Ph.D.
studentka vedoucí práce zástupce ředitele Ústavu experimentální
biologie pro pedagogické
záležitosti
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Čestné prohlášení
Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením
vedoucího práce s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
V Brně 15. května 2022
Hana AI Kirbiová
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Poděkování
Na tomto místě bych ráda poděkovala svému vedoucímu RNDr. Luďku Eyerovi, Ph.D.
za odborné vedení a cenné rady při psaní této práce a za jeho vždy pozitivní a
ochotný přístup. Mé poděkování patří také RNDr. Ivaně Huvarové, Mgr. Janu
Haviernikovi Ph.D. a ostatním členům laboratoře za nepostradatelnou pomoc a
příjemnou atmosféru při vypracování praktické části této práce. Dále bych chtěla
poděkovat svým rodičům, kteří mi byli podporou po celou dobu mého studia.
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Seznam pojmů a zkratek
7-DCM 7-deaza-2'-C-metyladenosin
CNS Centrální nervová soustava
CPE Cytopatický efekt
DAAs Přímo působící antivirotika, „Direct Acting Antivirais"
DMSO Dimethylsulfoxid
HAART „Highly Active Antiretroviral Therapy"
HCV Virus hepatitidy C, „Hepatitis C Virus"
HIV Virus lidské imunitní nedostatečnosti, „Human Immunodeficiency
Virus"
KE Klíšťová encefalitida
MOI Multiplikace infekce, Multiplication Of Infection"
MTáza Metyltransferáza
NS Nestrukturní protein
NTP Nukleosidtrifosfát, „Nucleoside Triphosphate"
ORF Otevřený čtecí rámec, „Open Reading Frame"
PCR Polymerázová řetězová reakce, „Polymerase Chain Reaction"
PFU Částice schopné tvořit plaky, „Plaque-Forming Units"
PS buňky Stabilní buňky prasečí ledviny, „Porcine kidney Stable cells"
RdRp RNA-dependentní RNA polymeráza
RT-PCR Reverzně transkripční PCR
UTR Nepřekládaný region, „Untranslated region"
VKE Virus klíšťové encefalitidy
WT Divoký typ, „Wild-Type"
Obsah
1. Úvod 13
2. Flaviviry 14
3. Virus klíšťové encefalitidy 14
3.1. Klíšťová encefalitida 15
3.2. Epidemiologie a subtypy virů klíšťové encefalitidy 15
3.3. Struktura a genom viru klíšťové encefalitidy 17
3.4. RNA-dependentní RNA polymeráza 18
4. Nukleosidová antivirotika 20
4.1. Struktura nukleosidových analogů 21
4.2. Strukturní modifikace nukleosidových analogů 22
4.3. Mechanismy účinku nukleosidových analogů 23
4.4. 7-deaza-2'-C-metyladenosin 25
4.5. 4'-azidocytidin (R-1479) 25
5. Rezistence k antivirovým nukleosidům 27
6. Cíle diplomové práce 29
5. Materiál a metody 30
5.1. Virové kmeny, buněčné kultury a nukleosidové analogy 30
5.2. Kultivační metody 31
5.2.1. Test inhibice virové replikace v buněčné kultuře 31
5.2.2. Plaková titrace 31
5.2.3. Selekce rezistentních virů 32
5.2.4. Fenotypová charakterizace rezistentních virových mutant 33
5.2.5. Kvantitativní studium cytopatického efektu 34
5.3. Molekulárně biologické metody 34
5.3.1. Izolace RNA 34
5.3.2. Reverzně transkripční PCR (RT-PCR) 35
5.3.3. Gelová elektroforéza 36
11
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
5.3.4. Extrakce DNA z gelu 37
5.3.5. Sekvenace genu NS5 37
6. Výsledky 38
6.1. Test inhibice replikace viru působením vybranými nukleosidovými analogy 38
6.2. Selektované mutantní kmeny 39
6.3. Zhodnocení plakové morfologie mutant 42
6.4. Zhodnocení tvorby cytopatického efektu mutatními kmeny VKE 43
6.5. Identifikace mutací v genomech rezistentních mutant 46
7. Diskuse 51
8. Souhrn 58
9. Summary 60
10. Literatura 62
12
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
1. Úvod
Klíšťová encefalitida (zkráceně KE) je onemocnění vyvolané virem klíšťové encefalitidy
(VKE) z čeledi Flaviviridae vyskytujícím se převážně v zalesněných částech Evropy, Ruska a
severovýchodní Asie (Steffen R., 2016.). Ročně je světově nahlášeno až 15 000 případů
tohoto onemocnění, Česká republika pak patří mezi země s nej vyšší incidencí v Evropě (Zajac
a kol., 2022). K E se může klinicky manifestovat od lehčích symptomů chřipkových
onemocnění až jako vážné a potenciálně letální infekce centrálního nervového systému
(CNS). V současné době existuje očkování proti K E sloužící k její prevenci, nicméně doposud
nebyla vyvinuta a schválena specifická léčba pro již probíhající infekci (Studahl a kol., 2013).
Z tohoto důvodu patří identifikace efektivních antivirotik proti K E mezi hlavní výzkumné
priority v postižených oblastech.
Mezi potencionální terapeutika využitelné k léčbě K E se v současnosti patří i
chemicky modifikované nukleosidové analogy, které se již běžně používají jako antivirotika
proti virovým infekcím způsobenými například viry chřipky, herpes simplex viry nebo viry
lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) (De Clercq a Neyts, 2009). Nukleosidové inhibitory již
v minulosti prokázaly účinky i proti jiným flavivirům, nejčastěji byly studovány v souvislosti
s viry Dengue viry (Yin a kol., 2009), západonilské horečky (Chen a kol., 2013) nebo
hepatitídy C (HCV) (Migliaccio a kol., 2003). Příkladem jsou relativně dobře prostudované
kandidátní nukleosidové 2'-C-metylované analogy, konkrétně 7-deaza-2'-C-metyladenosin (7DCM),
nebo nukleosidové analogy cytidinu se 4'-azido modifikací. Tyto analogy působí
stejně jako většina nukleosidových analogů jako inhibitory virové RNA-dependentní RNA
polymerázy (RdRp), čímž zabraňují replikaci viru (De Clercq a Neyts, 2009). Jelikož jsou
tyto látky zacíleny pouze na virové, a ne lidské proteiny, představují často bezpečnější
terapeutickou alternativu oproti ostatním antivirotikům cílícím na hostitelské enzymy.
Nicméně samotná identifikace účinných nukleosidových analogů proti V K E nestačí,
jelikož rychlost vzniku nových mutací v aktivním místě RdRp je mimořádně vysoká, což vede
k rychlému vývoji rezistence viru vůči léčivům a následné ztrátě jejich terapeutických účinků
(Migliaccio a kol., 2003). Rezistence tedy představuje jednu z hlavních překážek pro
praktické využití nukleosidových analogů s již prokazatelně antivirovými účinky, a proto je
žádoucí porozumět molekulárním mechanismům jejího vzniku a identifikovat konkrétní
mutace rezistentních mutant. Na základě těchto znalostí je možné se pokusit omezit výskyt
rezistentních kmenů, a to díky výběru vhodné kombinační antivirové terapie nebo nalezení
analogů s nízkou pravděpodobností navození virové rezistence.
13
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
2. Flavíviry
Čeleď Flaviviridae zahrnuje čtyři antigenně odlišné rody; Flavivirus, Hepacivirus,
Pestivirus a Pegivirus. Rod Flavivirus zahrnuje přibližně 70 druhů, včetně důležitých
lidských patogenů endemických po celém světě, kromě zmíněného V K E jsou to například
viry Dengue, žluté zimnice, západonilské horečky nebo viry Zika. Tyto viry jsou u člověka
původci mnoha závažných onemocnění se širokým spektrem klinických příznaků Flaviviry
jako čeleď lze dále rozdělit podle jejich vektorů do čtyř skupin: přenášené klíšťaty; přenášené
komáry (dále rozdělené na přenášené Culex nebo Aedes); bez známého vektoru; a infikující
pouze komáry (neschopné infikovat obratlovce). Ročně je hlášeno až 200 milionů nových
případů infekcí způsobených flaviviry přenášenými členovci (Baier, 2010). V K E patří mezi
arboviry (tedy viry přenášené členovci) přenášené na obratlovce prostřednictvím klíšťat
Ixodes ricinus nebo Ixodespersulcatus. Hlavními hostiteli a rezervoáry V K E jsou malé druhy
hlodavců, člověk je pak náhodný hostitel (Dumpis a kol., 1999).
Genetická variabilita flavivirů je omezena různými strukturálními a funkčními
požadavky systému dvou hostitelů, tj. obratlovců a bezobratlých. Podle vektoru, kterým je
virus šířen, se mění i rychlost evolučního vývoje viru, a to v závislosti na délce životního
cyklu vektoru. Obecně se flaviviry přenášené komáry zdají vyvíjet více než dvakrát rychleji
než flaviviry přenášené klíšťaty, což je pravděpodobně způsobeno dlouhým životním cyklem
klíšťat (Vechtova a kol, 2020).
3. Virus klíšťové encefalitidy
V K E jako původce klíšťové encefalitidy způsobuje široký rozsah symptomů s různou
klinickou závažností, od zcela asymptomatických nebo mírných chřipkových projevů až po
potenciálně letální neuroinfekce nebo dlouhotrvající chronické stavy. Jeho relevance
v medicínském prostředí v posledních desetiletích navíc nadále stoupá, což je dáno výrazným
nárůstem incidencí v endemických oblastech (Süss, 2003).
Vakcinace proti V K E je jako prevence v Evropě dostupná již přes 30 let, v současnosti
jsou k dispozici hned dvě vysoce účinné vakcíny; FSME-JMMUN® (Pfizer, USA) a
Encepur® (GlaxoSmithKline, USA). Nicméně v zemích, pro které je V K E endemický,
zůstává proočkovanost obyvatelstva stále nízká (Zavadska a kol., 2013), a navíc zde
neexistuje žádná specifická antivirová terapie KE. Léčba pacientů je tedy omezena pouze na
symptomatickou a podpůrnou péči zahrnující antipyretika, analgetika, zajištění správné
výživy, u těžších případů pak i plieni ventilaci a následné rehabilitace (Studahl a kol., 2013).
14
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Existuje tedy naléhavá potřeba účinné léčby a velký potenciál v tomto ohledu představují
právě nukleosidová antivirotika.
3.1. Klíšťová encefalitida
Infekce V K E se přenášejí dvěma různými cestami; kousnutím klíštěte infikovaného
V K E (nejčastěji Ixodes ricinus v Evropě a Ixodes persulcatus v Rusku), nebo konzumací
nepasterizovaného mléka a mléčných výrobků z virem infikované kozy, krávy či ovce (pouze
1% všech K E případů) (Gritsun a kol., 2003b).
Inkubační doba K E po infekci se pohybuje od 2 do 28 dnů, nejčastěji však mezi 7 a 14
dny. Virus se během první fáze šíří systémově, vyvolává horečku a další příznaky, jako je
bolest hlavy, únava, myalgie, anorexie, nevolnost a/nebo zvracení. Pokud u pacientů nedojde
k virové invazi do CNS končí onemocnění po první fázi (a jedná se o tzv. monofázické
onemocnění). Asi u poloviny pacientů virus proniká do CNS a po krátkém asymptomatickém
období dochází k druhé fázi onemocnění již s neurologickými příznaky a symptomy (tzv.
bifázické onemocnění) (Bogovic a Strle, 2015). Druhé stadium je charakterizováno šířením
viru do CNS, kde je virová replikace spojena se zánětem, lyží a dysfunkcí buněk. Tato
neurologická fáze K E může být dále klasifikována na meningeální a fokální formy (tj. K E s
poškozením mozku vedoucím k paréze a/nebo paralýze). Tyto fokální formy mohou být
rozlišeny jako meningitidy, encefalitidy či encefalomyelitidy, případně encefaloradikulitidy, a
to na základě převažující oblasti postižení (Mansfield a kol., 2009). Těžší formy vyžadují
rekonvalescenci trvající týdny až měsíce. Až u dvou třetin postižených se může objevit i
postencefalitický syndrom, zahrnující dlouhotrvající obtíže jako jsou bolesti hlavy, závratě,
třes nebo poruchy soustředění, paměti a spánku (Haglund a Gunther, 2003). U některých
pacientů s K E může virus přetrvávat aktivní v CNS po delší dobu a infekční proces přetrvává,
v tomto případě se K E stává chronickým onemocněním (Gritsun a kol., 2003a).
3.2. Epidemiologie a subtypy virů klíšťové encefalitidy
K E s neurologickými symptomy se stala povinně oznamovanou na úrovni Evropské unie v
roce 2012 a nyní je pod dohledem Evropského centra pro prevenci a kontrolu nemocí. Virus
klíšťové encefalitidy je považován za endemický v téměř 30 evropských a 4 asijských zemích
(Lindquist a Vapalahti, 2008; Obr. 1). K E je nejvíce rozšířena v zalesněných oblastech, její
případy se obvykle vyskytují v období mezi dubnem a listopadem, které koreluje s aktivitou
klíšťat.
15
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Obrázek 1: Globální rozšíření klíšťové encefalitidy a jejího vektoru (Lindquist a
Vapalahti, 2008; upraveno)
Infekce je typicky způsobena jedním ze tří podtypů vina klíšťové encefalitidy,
jmenovitě se jedná o evropský (TBEV-Eu), sibiřský (TBEV-Sib) nebo dálně-východní
(TBEV-FE) podtyp. Podtyp TBEV-Eu převládá v celé Evropě, včetně evropské části Ruska,
zatímco podtypy TBEV-Sib a TBEV-FE jsou přítomny hlavně v Asii. V některých oblastech
koexistují dva nebo všechny tři hlavní podtypy (např. pobaltské státy, Sibiř, Ukrajina) (Ecker
et al., 1999). V Evropě má infekce TBEV-Eu obvykle za následek spíše mírnou formu K E s
úmrtností <2 % (Růžek a kol., 2019). Infekce TBEV-Sib také vede k obecně mírnému
onemocnění (nicméně s tendencí vzniku chronické formy), naproti tomu infekce TBEV-FE
podněcuje nejzávažnější formy K E a je spojena s vysokou úmrtností (až 30 %) (Gritsun a kol.,
2003b).
Přestože Rusko má ročně zdaleka největší počet potvrzených případů K E (Siiss,
2008), Česká republika má jednu z nej vyšších incidencí v Evropě, za rok se zde nahlásí 400
až 1 000 klinických případů (Růžek a kol., 2008). Nicméně sérologický průzkum prokázal, že
symptomatické projevy infekce se objeví asi jen u 40 % případů K E (Lunáčková a kol.,
2003).
Zvýšené riziko nákazy pro člověka může v následujících letech vzniknout třemi
způsoby: zlepšenými podmínkami pro přirozené přenosové cykly způsobené klimatickými
změnami vedoucí k zvýšenému výskytu infikovaných klíšťat nebo změně jejich geografické
distribuce do oblastí vyšších zeměpisných šířek a vyšších nadmořských výšek; změnami
lidského chování vedoucímu k větší expozici klíšťatům díky mezikontinentálnímu cestování
do endemických oblastí; a změnami zemědělských postupů vedoucí k vyšší spotřebě
syrového mléka (Martens, 1999).
16
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
33. Struktura a genorn viru klíšťové encefalitidy
Viriony V K E mají průměr přibližně 50 nm a jsou složeny ze sférického kapsidu obklopeného
lipidovou dvojvrstvou odvozenou od hostitele a dvou virových glykoproteinů, označovaných
jako obalový protein E a membránový protein M , která je odvozený od štěpeného prekurzoru
prM. Nukleokapsid obsažený uvnitř je tvořen pouze jediným virovým proteinem C a RNA
Obrázek 2: Struktura virionu VKE (Pulkkinen a kol., 2018; upraveno)
Genom V K E tvoří jednovláknová pozitivní RNA o délce asi 11 kb kódující virové
proteiny nutné pro replikaci viru. Obsahuje 5'-čepičku a jeden velký otevřený čtecí rámec
(ORF) ohraničený na svých 5' a 3' koncích nepřekládanými regiony (5' - a 3'- UTR). 3'-UTR
není polyadenylovaný. ORF kóduje jeden polyprotein (Obr. 3), který je ko- a posttranslačně
upraven na 3 strukturní proteiny (E, prM a C) a 7 nestrukturních - NS1 (glykoprotein), NS2A,
NS2B, NS3 (proteázová, helikázová a NTPázová aktivita), NS4A, NS4B a NS5
(metyltansferázová a RNA-dependentní RNA polymerizační aktivita) (Chambers a kol.,
1990). Protein NS5 je považován za nej konzervativnější gen, zatímco gen pro protein E za
jeden z nejvíce variabilních (Mandl a kol., 1989). Protein E je pravděpodobně nejvíce
imunogenní antigén a indukuje neutralizační a ochranné protilátky hostitele (Fiizik a kol.,
2018). Tato antigenní molekula hraje důležitou roli ve virulenci viru, pravděpodobně během
rané fáze virového cyklu.
genomem (Obr. 2).
Obalový protein E
Membránový protein M
Genomická RNA
Protein C
Lipidová
dvojvrstva
17
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
NH3-{^"strukturní proteiny
3400aa
nestrukturní proteiny J-COOH
í
& \ r C X I K
X X
ER lumen
NS2A NS2B NS4A |
X X x y x r x y x y x ; X V
A( NS5 )
Cytoplazma
Obrázek 3: Schématické znázornění polyproteinu VKE a jeho produktů štěpení, včetně
míst štěpení virovými a hostitelskými proteázami (Pulkkinen a kol., 2018; upraveno)
3.4. RNA-dependentní RNA polyrneráža
Flavivirový NS5 je nej větší nestrukturní protein kódovaný virovým genomem s délkou asi
900 aminokyselin. NS5 je charakteristická aktivitami N-terminální metyltransferázy (MTázy)
a C-terminální RNA-dependentní RNA-polymerázy (RdRp). Aktivita NS5 MTázy je
zodpovědná za opatření 5' konce virového genomu m7
G čepičkou, což je krok nezbytný pro
jeho stabilizaci a translaci na virové polyproteiny na ribozomech hostitelské buňky. Kromě
funkcí nezbytných pro replikaci viru, NS5 působí jako antagonista hostitelské interferonové
reakce tím, že interaguje a podporuje degradaci proteinu STAT2 (Ashour a kol., 2009).
Replikace čeledí Flaviviridae a Cystoviridae pomocí RdRp probíhá de novo
iniciačním mechanismem a vyžaduje tedy příměrový element pro usnadnění počátečních
kroků syntézy RNA (Butcher a kol., 2001). De novo RdRp využívají dva iniciační nukleosidtrifosfáty
(NTP) k vytvoření první fosfodiesterové vazby nascentního řetězce. To znamená, že
druhý nukleotid je přidán přímo na 3 -OH prvního iniciačního nukleotidu, na rozdíl od RdRp
závislých na oligonukleotidovém nebo proteinovém primeru (například u virů z čeledi
Picornaviridae).
Podobně jako RdRP ostatních RNA virů zaujímá terciální struktura RdRp V K E tvaru
pravé ruky se třemi doménami obklopující aktivní místo; prstovou, palcovou a dlaňovou. V
těchto doménách je sedm konzervativních motivů aminokyselinové sekvence označovaných
A-G (Obr. 4) hrajících klíčovou roli pro vazbu RNA, NTP, kovových iontů a pro katalýzu
polymerace. Dlaňová doména obsahující motivy A-E patří mezi strukturně
nej konzervativnější domény (zejména motivy A-C) mezi všemi známými polymerázami (Wu
a kol., 2015).
18
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Motivy A a C obsahují dva zbytky kyseliny asparagové, které jsou univerzálně
konzervovány v polymerázách nukleových kyselin a jsou nepostradatelné v katalytickém
mechanismu polymerizace (Beese a Steitz, 1991). Motiv B zahrnuje vysoce konzervativní
sekvenci serin-glycin. Serin je RdRP-specifický a je občas nahrazen threoninem ve wild-type
(WT) kmenech nebo terapeuticky
rezistentních kmenech, které se vyvinuly
palcová
doména prstová
doména
z virových populací vystaveným expozici
2'-C-ribóza modifikovaným
nukleosidovým analogům (Dutartre a
kol., 2006), příkladem je mutace S603T u
mutant rezistentních K 7-DCMA (Eyer a
kol., 2017). Motiv D je strukturálně
spojen s motivem A a společně
procházejí koordinovanými
konformačními změnami během
uzavírání a opětovného otevírání
aktivního místa (Gong a Peersen, 2010).
dlaňová
doména
Obrázek 4: Struktura flavivirové RdRp,
včetně domén a motivů (A-G) (Wu a kol.,
2015; upraveno)
Motivy F a G jsou lokalizovány v prstové doméně a oba hrají kritickou roli pro funkci
polymerázy. Samotná prstová doména se skládá ze dvou špiček prstů a jádra s jaderným
lokalizačním signálem, je vysoce mobilní a při iniciační fázi replikace dochází ke
konformačním změnám G a F motivů. Motiv F poskytuje vazebné místo pro nukleotidy
začleňující se do nového řetězce a je tvořen pozitivně nabitými zbytky RNA vazebného
tunelu. G-smyčka (korespondující s polohou G motivu u primer-dependentních RdRp)
vyčnívá k aktivnímu místu a může regulovat aktivitu RdRp, jelikož se nachází v místě vstupu
templátu do vazebného žlábku (Adachi a kol., 2002). Konformační změny prstových domén
pak ovlivňují i palcovou doménu, a tedy i prostorové uspořádání celé polymerázy.
Motiv E je tvořen rozhraním mezi dlaňovou a palcovou doménou a hraje roli ve vazbě
příměrového nukleotidu (Malet a kol., 2008). Flaviviry s de novo iniciačním mechanismem
obsahují příměrovou smyčku integrovanou do jejich palcové domény. Tato smyčka obsahuje
platformu sloužící ke stabilizaci 3' konce templátové RNA a iniciačních NTP a díky tomu je
doména palce mnohem objemnější než u RdRP závislých na příměru. Navíc dva kolmé
kladně nabité tunely umožňují přístup a vazbu templátové RNA a substrátovým NTP k
aktivnímu místu (Obr. 5). RdRp ke své aktivitě potřebuje ve svém aktivním místě i dva M g 2 +
ionty, které katalyzují tvorbu fosfodiesterové vazby. Vazebné místo zinkového iontu na pantu
19
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
mezi dvěma subdoménami se může podílet na otevírání struktury RdRp směrem ke
konformaci pro elongaci (Malet a kol., 2008).
Obrázek 5: Znázornění aktivního místa RdRp s Mg2 +
ionty a tunelů pro vstup a výstup RNA
při replikaci (Picarazzi a kol., 2020; upraveno)
Flavivirová RNA-dependentní RNA polymeráza je považována za jeden z
nej atraktivnějších cílů při vývoji antivirových činidel, jelikož její polymerizační aktivita je
nezbytná pro replikaci viru a lidské hostitelské buňky takové RdRp postrádají (Cerutti a
Casas-Mollano, 2006). To zajišťuje vysokou specifitu léčby s minimálními vedlejšími účinky
pro lidský organismus. Antivirová léčiva zacílená na RdRp mohou buďto přímo inhibovat
aktivitu polymerázy nebo její nezbytné interakce s ostatními proteiny nebo s RNA templátem
a promotorovými prvky. Klinické využití nukleosidových inhibitorů replikace jako terapeutik
bylo již validováno proti reverzní transkriptáze HIV nebo polymerázám viru hepatitídy B a
viru herpes (De Clercq, 2005).
4. Nukleosidová antivirotika
Nukleosidové analogy představují nejširší skupinu antivirotik s nejrůznějšími mechanismy
účinku, v současné době je jich na trhu k dispozici k léčbě virových infekcí asi 25 druhů a
další jsou zkoumány v klinických a preklinických studiích (Jordheim a kol., 2013). Na rozdíl
od antibiotik, není cílem těchto antivirotik usmrcení patogena způsobujícího infekci, ale
inhibice jeho replikace v hostitelském organismu. Nukleosidové inhibitory flavivirové RdRp
jsou atraktivními cíli pro navrhování V K E léčiv, jelikož lidské replikační/transkripční enzymy
postrádají aktivitu RdRp. Očekává se tedy, že takové sloučeniny budou dobře tolerované
lidským organismem a vykazovat méně škodlivých vedlejších účinků, protože nejsou zacílené
na lidské, ale na virové proteiny (De Clercq a Neyts, 2009). Další výhodou těchto antivirotik
20
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
je předchozí osvětlení jejich základních mechanismů účinků a farmakokinetických vlastností,
a mohou tak sloužit jako výchozí bod pro vývoj nových generací nukleosidových analogů se
zlepšenými biologickými parametry. Přestože k terapii K E nebyla žádná z těchto sloučenin
doposud schválena, vysoký stupeň homologie mezi polymerázami V K E a jinými flaviviry
ukazuje na potenciál nukleosidových analogů jako inhibitorů V K E (Koonin a Dolja, 1993).
Nicméně nukleosidová antivirotika se osvědčily v léčbě jiných virových onemocněních, a
to především v kombinační terapii, například u tzv. HAART („Highly Active Antiretroviral
Therapy,,). HAART typicky zahrnuje podání kombinace tří nebo více antiretrovirových léčiv,
které inhibují replikaci HIV několika mechanismy, takže množení viru rezistentnímu vůči
jednomu činidlu je inhibováno působením dalších dvou činidel (Shafer a Vuitton, 1999).
Právě nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy HIV představují základní kámen této
terapie.
4.1.Struktura nukleosidových analogů
Přirozeně se vyskytující nukleosidy představují jedinečný výchozí bod pro navrhování léčiv
díky jejich zapojení do řady důležitých biologických procesů a jejich roli jako základních
stavebních elementů pro syntézu RNA nebo DNA. Na základě toho mohou být navrhnuly
přesné modifikace nukleosidové struktury, které mají za následek změnu jejich klíčových
interakcí v místě vazby s cílovými enzymy, čehož lze využít pro terapeutické účely.
Nukleosidy se přirozeně skládají z cukerné části (pentózy) a nukleobáze spojené N glykosidovou
vazbou, zatímco nukleotidy jsou nukleosidy, které zároveň obsahují alespoň
jednu fosfátovou (nebo fosfátu podobnou) skupinu (Obr. 6).
cukr
Obrázek 6: Obecná struktura nukleosidového monofosfátu (Seley-Radtke a Yates,
2018, upraveno)
heterocyklická báze
N H 2
fosfát
glykosidová vazba
21
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Po vstupu do buněk specifickými transportéry na plazmatické membráně jsou nukleosidy
fosforylovány buněčnými nukleosidovými kinázami za vzniku aktivních nukleosidových
trifosfátů. V ideálním případě nukleosidový analog napodobuje strukturu přirozeného
nukleosidu natolik, aby byl rozpoznán buněčnými nebo virovými enzymy a začleněn do
replikačního cyklu D N A nebo RNA. Tyto analogy však mají jednu nebo více modifikací své
struktury, a způsobují tak cílené narušení správné replikace nebo jiných biologických procesů.
Protože rozpoznávání nukleosidu enzymy je závislé na mnoha faktorech, včetně stereochemie
nukleosidu, elektronových efektů a interakcích vodíkových vazeb, je možné navrhnout
nukleosidový analog s aktivitou proti konkrétnímu biologickému cíli, zejména pokud známe
mechanismus jeho účinku a máme k dispozici informace o vazebném místě enzymu.
4.2. Strukturní modifikace nukleosidových analogů
V průběhu let byly provedeny četné modifikace nukleosidové struktury, a to včetně změn na
cukerném kruhu, nukleobázi, glykosidické vazbě nebo fosfátových skupinách. Tyto
modifikace zahrnují například přidání substituentu nebo funkční skupiny, nahrazení atomu v
kterékoli části nebo přesunutí atomu do jiné polohy. Počet možných modifikací se navíc
mnohonásobně zvyšuje kombinací těchto úprav.
Jednotlivé uhlíkové atomy cukerného kruhu a hydroxyly představují nejběžnější
kandidáty pro navázání různých skupin. Metylová skupina připojena zejména na 2' nebo 3'
pozici často způsobuje zvýšení účinnosti terapeutických molekul, a to změnou konfigurace
cukerné složky. Tato změna má pak za následek zabránění vazby nových nukleotidů do
rostoucího řetězce nukleové kyseliny při replikaci. Mezi takové terminátory replikace patří
například 2'-C-metyladenosin s antivirotickými účinky proti H C V a zároveň nízkou
cytotoxicitu in vitro (Migliaccio a kol., 2003). V úvodních studiích s 2'-C-metyladenosinem a
2'-C-metylguanosinem bylo zjištěno, že biologická aktivita těchto analogů by mohla být
potenciálně až několikanásobně zvýšena odstraněním dusíku v poloze 7 z purinového kruhu
za vzniku „deaza" analogu (Olsen a kol, 2004).
Deazapurinové nukleosidy se schopností narušit různé biologické funkce byly poprvé
objeveny v sekundárních metabolitech bakterií Streptomyces (McCarty a Bandarian, 2008).
Odstranění dusíku z purinové nebo pyrimidinové báze by mohlo být využito k prozkoumání
účinku interakcí vodíkových vazeb v enzymových vazebných místech. Vzhledem k tomu, že
odstranění nebo přidání silného donoru nebo akceptoru vodíkové vazby v bázi ovlivňuje
reaktivitu i vlastnosti na jiných pozicích báze, může mít tato změna zásadní dopad na
výslednou aktivitu nukleosidu (Liu a kol., 2001). Konktrétně modifikace 7-deaza mění úhel a
22
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
délku glykosylové vazby, což vede k přeskupení obecného elektronového charakteru purinové
báze a zejména k narušení dostupnosti 3'-hydroxylové skupiny nukleotidu pro tvorbu
fosfodiesterové vazby při replikaci. Modifikace 7-deaza tedy může vést ke zvýšené potenci
nukleosidového analogu ve smyslu ukončení syntézy virové RNA, jak bylo dokázáno u
kombinovaného analogu i s pentózovou modifikací 7-deaza-2'-C-metyladenosinu (Eyer a
kol., 2015).
Další modifikace cukerného kruhu stojící za zmínku je substituce elektron-akceptorové
azidové skupiny do 4'-polohy pentózy, která snižuje elektronovou hustotu na cukerném kruhu.
Je zajímavé, že přítomnost 4'-azido skupiny v těchto analozích ovlivnila 3' a 5'-hydroxylové
skupiny způsobem, který tyto dvě skupiny přivedl blíže k sobě (Maag a kol., 1992; Chen a
kol., 1992). Změna konformace hydroxylových skupin na pentóze tedy umožňuje, aby 4'azido
analogy působily jako terminátory řetězce DNA, přestože jsou označované jako pseudoobligátní
terminátory řetězce.
4.3. Mechanismy účinku nukleosidových analogů
Obecně existují dva typy virových inhibitorů; přímé inhibitory virové polymerázy (tzv.
„Direct Antiviral Agents" - DAAs) a inhibitory způsobujících letální mutagenezi (letální
mutageny). Jako zástupce druhé skupiny lze zmínit ribavirin, favipiravir a 5-fluorouracil. Tyto
látky se začleňují při replikaci do virových nascentních RNA řetězců, což má za následek
chybné párování vedoucí k akumulaci bodových mutací ve virových genomech. Postupně se
zvyšující četnost mutací vede k „degradaci" genetické informace a postupnému vymizení
(letální extinkci) virionů z infikované kultury (Crotty a kol., 2000).
Mnoho přímo působících antivirových nukleosidových analogů se pak zaměřuje na
virovou polymerázu odpovědnou za replikaci virového genomu, u flavivirů konkrétně na
RdRp (Eyer a kol., 2018). Nukleosidové analogy interagují přímo s konzervativním aktivním
místem virové polymerázy, na rozdíl od nenukleosidových inhibitorů polymerázy, které často
interagují s nekonzervativními místy tolerantními na mutace (mutace zde nemají zásadní vliv
na funkci polymerázy) (Wang a kol., 2003). Mutace v aktivním místě RdRp tak mohou
zásadně ovlivňovat vazbu nukleosidových antivirotik, které tak mohou ztratit svůj
terapeutický účinek.
Většina nukleosidových analogů používaných jako antivirová činidla působí
mechanismem inhibice prodlužování řetězce nukleové kyseliny během replikace. Aby tyto
sloučeniny fungovaly jako terminátory syntézy nascentního řetězce, musí být převedeny na
svou 5'-trifosfátovou formu pomocí buněčných nebo virových kináz, než mohou být
23
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
kompetitivně inkorporovány do nascentních řetězců flavivirové RNA. Po inkorporaci se
odštěpí pyrofosfátová skupina za vzniku 5'-monofosfátu a dochází k tvorbě neúplných, a tedy
nefunkčních řetězců virové RNA (Obr. 7). U obligatórnich terminátorů řetězce je tento efekt
docílen chybějící 3'-hydroxylovou skupinou, které je nezbytná pro tvorbu fosfodiesterové
vazby s přicházejícím NTD. Nukleosidové inhibitory flavivirové RdRp však působí jako tzv.
neobligátní terminátory řetězce, jelikož i přes přítomnost 3'-hydroxylové skupiny dochází
kinhibici replikace RNA. Tato skupina je u těchto nukleosidů totiž konformačně, stericky
nebo vlivem elektronových efektů bráněna sousedními substituenty před připojením
příchozího nukleotidu. V nukleosidových analozích cílených na RNA polymerázu NS5B
HCV nebo RdRp V K E těmito substituenty může být například 2'-C-metylová nebo 4'-C-azido
skupina (De Clercq a Neyts, 2009).
Nascentní RNA c '
Templátová RNA 3'
R d R p
Nukleosidový
analog
Nascentní RNA 5'
Templátová RNA 3'
Nukleosid
trifosfát
5'
Replikace
Termi nace
Nukleosid
monofosfát
5'
Obrázek 7: Mechanismus terminace replikace RNA začleněním nukleosidového
trifosfátu pomocí RdRp (Yamamoto a kol., 2016; upraveno)
Kromě zmíněné terminace nascentního řetězce a mutageneze virové nukleové kyseliny,
nukleosidové inhibitory mohou blokovat i jiné procesy nutné k zajištění úspěšného průběhu a
dokončení replikace viru. Například neplanocin A nebo decitabin jsou deriváty inhibující
hostitelskou S-adenosylhomocystein hydrolázu nebo virovou MTázu, bez které nedochází
k tvorbě stabilizační čepičky m7
G pro mRNA, a tedy její translaci do virových proteinů (Lim
a kol., 2010). Specifické nukleosidové inhibitory NTPázy/helikázy pak mají za následek
sníženou stabilitu dvoušroubovice a aktivitu polymerázy (Borowski a kol., 2001). Dalším
mechanismem může být i zasáhnutí do biosyntézy nukleotidů a snížení jejich intracelulárních
zásob (Eyer a kol., 2018).
24
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
4.4. 7-deaža-2'-C-metyladenosin
7-deaza-2'-C-metyladenosin (7-DCMA; také
p c v N H 2
známý jako MK-608; Obr. 8) je analog Q I \~~^V
původně vyvinutý jako inhibitor H C V H O ^ ^ ^ ^ X ^ / ^ " ^ . ^ ^ ^
společností Merck Research Laboratories ) N - - 1
^ ^
(Olsen a kol., 2004), nyní s již prokázanými H O O H
širokospektrálními antivirovými účinky v Obrázek 8: Struktura 7-DCMA
rámci pozitivních jednovláknových RNA virů, včetně virů z rodu Flavivirus. Účinky 7D
C M A byly důkladněji testovány například u viru západonilské horečky (Eyer a kol., 2019)
nebo u viru Zika (Eyer a kol., 2016a; Zmurko a kol., 2016), po jehož epidemiologickém
propuknutí v Oceánii a Latinské Americe roku 2015 byl tento analog mezi prvními
popsanými inhibitory tohoto viru na bázi nukleosidů.
Kombinace 7-deaza modifikace adenosinu a substituce 2'-C-metyl-ribózy vedla k silným
inhibičním účinkům VKE, nevykazující navíc žádný cytotoxický účinek na buněčné linie PS
(„Porcine kidney Stable cells"). Jeho inhibiční aktivita proti V K E byla prokázána i in vitro na
myším modelu, kde zvýšil přežití a snížil projevy neuroinfekce a virové titry v mozcích myší
infikovaných letální dávkou viru (Eyer a kol., 2017).
Předchůdci tohoto analogu 2'-C-metyladenosin, 2'-C-metylguanosin i 2'-C-metylcytidin
prokázali také inhibiční aktivitu vůči HCV, nicméně na rozdíl od 7-DCMA vykázali
nedostatečnou stabilitu v séru i tkáních a nízkou biodostupnost. Oproti tomu 7-DCMA není
citlivý na deaminaci nebo štěpení enzymy metabolizujícími adenosin a je lépe fosforylován na
aktivní trifosfát (Olsen a kol., 2004).
4.5. 4'-ažídocytidin (R-1479)
Pomocí metod screeningu velkých nukleosidových ^
knihoven v kombinaci s racionálním přístupem pro J ^ Q - - ' ' V S / 0 \ > N ^ / ^ '
návrh léčiv bylo identifikováno několik ( N 3 j \ / o
cytidinových analogů s azidovou skupinou v poloze H O " O H
C'4 jako silných inhibitorů replikace H C V
(Klumpp a kol., 2006). Později se ukázalo, že dva 0 b r á z e k 9 :
Struktura R-1479
4'-azido modifikované nukleosidové analogy, 4'-azidocytidin (R-1479; Obr. 9) a jeho
stereoizomer 4'-azido-aracytidin (RO-9187), vykazovaly in vitro antivirovou aktivitu proti
V K E i viru západonilské horečky (Eyer a kol., 2019). R1479-trifosfát jako substrát pro
polymerázu H C V a kompetitivní inhibitor inkorporace cytidin trifosfátu po začlenění
25
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
blokoval další prodlužování replikované RNA. Tyto výsledky naznačují, že přítomnost
azidové skupiny u R1479 konformačně a stericky interferuje s chemickou reakcí v poloze 3'
důležitou pro připojení dalšího nukleotidu (Klumpp a kol., 2006). Významnou výhodou
tohoto analogu může být i absence zkřížené rezistence s třídou 2'-C-metyl-nukleosidů, což
podporuje další zkoumání možných kombinací nukleosidových léčiv k omezení negativního
efektu rezistence na léčbu (Klumpp a kol., 2006).
Bohužel R-1479 vykazující silnou aktivitu proti HCV, stejně jako mnoho nukleosidových
analogů, zároveň projevil nízkou biologickou dostupnost. Proto bylo vyvinuto proléčivo
tohoto analogu balapiravir (R-1626), u kterého je k 5' pozici 4'-azidocytidinu připojena
esterová monofosfátová skupina, napomáhající překonat první aktivační fosforylační krok po
vstupu do buněk. Balapiravir sice prokázal zvýšenou antivirovou aktivitu ve srovnání s
mateřským analogem R-1479 a byl účinný v klinických studiích proti H C V (Klumpp a Smith,
2011), nicméně kvůli nepříznivé toxicitě (Pockros a kol., 2008) a vývoji silnějších
nukleosidových analogů (např. sofosbuviru), byl další pokrok tohoto analogu zastaven.
Později byl balapiravir analyzován v klinické studii proti viru Dengue (Chen a kol., 2014),
léčba však nebyla dobře tolerována kvůli nežádoucím účinkům, ani se nesnížila virová nálož
nebo čas odeznění horečky, takže klinické studie byly ukončeny. Stejně tak byl balapiravir
zcela neaktivní proti V K E in vitro, pravděpodobně kvůli jeho špatnému intracelulárnímu
vstřebávání nebo nedostatečné fosforylaci kinázami v testovaných buněčných liniích (Eyer a
kol., 2016b).
4.6. 4'=ažidoaracytídin (RO-9187)
2'-a-deoxy-2'-p-hydroxy-4'-azidocytidin (RO-9187),
arabino stereoizomer 4'-azidocytidinu (Obr. 10), je H O
sloučenina strukturně příbuzná 2deoxyribonukleosidům,
zejména díky absenci 2'-ahydroxyl
substituentu na ribózovém kruhu. Podobně jako Obrázek 10: Struktura RO-9187
další arabinonukleosidy nebo 2'-deoxyribonukleosidy, 4'-azidoaracytidin zaujímá přednostně
2'-endo konformaci, která je typická pro B-formu DNA (Klumpp a kol., 2008). Tím se RO-
9187 výrazně liší od nukleosidů s 2'-a-hydroxy substituenty, které se vyznačují 3'-endo
konformaci, typickou pro A-formu RNA (Eldrup a kol., 2004).
Tato sloučenina byla objevena při pokusech o vyvinutí účinnějších ribonukleosidů
inhibujících H C V (Smith a kol., 2007). Antivirová aktivita RO-9187 proti V K E byla poněkud
překvapivá, jelikož 2'-a-hydroxyl byl obecně považován za vysoce důležitý pro specifické
26
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
vodíkové vazby NTP aktivním místem virové RdRp. Nicméně ztráta této interakce je
pravděpodobně kompenzována interakcemi polymerázy s 2'-(3-hydroxy a 4'-azido
substituenty RO-9187 a ve výsledku je zodpovědná za silnou a selektivní inhibiční aktivitu
tohoto analogu (Klumpp a kol, 2008). Stejně jako u 4'-azidocytidinu aktivita RO-9187 je silně
závislá na buněčné linii, sloučeniny byly aktivní pouze v PS buňkách, ale ne v UKF-NB4
buňkách, zřejmě kvůli metabolickým rozdílům ve fosforylační procesech nebo v
deaminaci/demetylaci odlišných analogů (Eyer a kol., 2016b).
5. Rezistence k antivirovým nukleosidům
Stále větší počet flavivirových infekcí se léčí pomocí přímo působících antivirotik (DAAs),
jejichž mechanismus účinku je zacílen na virový replikační aparát. Pokud však léčba
dostatečně neeliminuje virus z infikovaných buněk, může selekční tlak vést k rychlému vývoji
virové rezistence (Chotiyaputta a kol., 2012). Když mluvíme o rezistenci ve vztahu
k antivirotikům, obvykle máme na mysli snížení citlivosti na léčivo měřené v systému
tkáňových kultur nebo in vivo. Z klinického hlediska rezistence představuje riziko pro
efektivitu léčby nejen u daného pacienta, ale i pro pacienty budoucí, jelikož má za následek
ztrátu účinnosti již osvědčených terapeutik na populační úrovni.
Fenotypové změny projevující se vývojem rezistence k nukleosidovým analogům
pozorovaných u RNA virů jsou nejčastěji výsledkem mutací ve virovém genomu. Byly
identifikovány dva typy mutací: primární (signaturní) mutace, které jsou přímo zodpovědné
za virovou rezistenci v selektivním prostředí, a sekundární neboli kompenzační mutace.
Primární mutace ovlivňují interakce antivirotik s jejich cílovými enzymy a tvoří genetický
základ rezistence, zároveň jsou však obvykle spojeny se sníženou replikační fitness viru.
Z tohoto důvodu se pravděpodobně ve virovém genomu objevují i kompenzační mutace,
jejichž funkcí je obnovení původní hodnoty fitness (Tanaka a Valckenborgh, 2011). Tyto
mutace jsou obecně buď neutrální nebo škodlivé v nepřítomnosti cílové mutace, a je tedy
pravděpodobné, že po odstranění mutace primární rezistence z genomu viru vymizí
(Khudyakov, 2010).
Flaviviry se vyznačují vysokou mírou mutací a vysokou genetickou diverzitou
(Simmonds, 2004), což znamená, že pokud polymorfismy podporující rezistenci neexistují v
populaci již na začátku léčby, pravděpodobně se objeví brzy poté. Mutageneze je výsledkem
vysoké míry replikace a chybovostí virové RNA polymerázy, která postrádá exonukleázovou
korektivní („proofreading") aktivitu. Výsledkem je existence tzv. quasispecies, tedy virových
27
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
populací skládajících se z velkého počtu subpopulací s variantními genotypy se sekvenční
rozdílností méně než 5 %. Díky tomu jsou tyto populace zvýhodněny při působení
selektivního tlaku, například právě v přítomnosti antivirových látek, jelikož je zde
mnohonásobně vyšší šance, že v této populaci již existuje nebo se dříve vyselektuje varianta
odolná vůči tomuto tlaku (Frost a McLean, 1994).
Počet a typ mutací nezbytných k výskytu rezistence neboli tzv. genotypová bariéra
rezistence, se často liší podle antivirového cíle a chemické povahy antivirotik (Gotte 2012). O
mnoha starších antivirových léčivech je známo, že mají nízké genotypové bariéry; viry
obvykle vyžadují pouze jednu nebo dvě substituce v genomu k zisku rezistence. Obecným
cílem vývoje léků je zvýšit tuto genotypovou bariéru tak, aby rezistence nevznikala příliš
snadno. Ukázalo se například, že kombinační terapie s nukleosidovými analogy mají vysokou
genotypovou bariéru vůči rezistenci, jelikož replikační cyklus virů je inhibován dvěma nebo
více různými mechanismy. Navíc se mezi těmito látkami vyskytuje velmi malá zkřížená
rezistence, tedy jev, kdy dochází k získání rezistence virem na danou látku bez její přímé
expozici, ale po expozici látkám ze stejné třídy léčiv (Gritsenko a Hughes, 2015).
Fenotypová bariéra rezistence pak udává, jak jednotlivé mutace ovlivňují virové
(replikační) fitness. Replikační fitness viru je pak definována jako schopnost produkovat
potomstvo v prostředí přirozeného výběru (Richman, 2000), v tomto případě v přítomnosti
antivirotického činidla. Mutace zodpovědné za vznik rezistence jsou tedy výhodné pouze
pokud zároveň nesníží fitness viru natolik, že virus ztratí selekční výhodu oproti ostatním
subpopulacím kompetujícím o stejné biologické zdroje (De Luca, 2006).
28
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
6. Cíle diplomové práce
Mezi hlavní cíle této diplomové práce patří:
1. Testování antivirové aktivity vybraných nukleosidových analogů klasickými
(kultivačními) virologickými metodami.
2. Selekce virových mutant rezistentních na vybrané nukleosidové analogy.
3. Fenotypová a genotypová charakterizace získaných virových mutant rezistentních na
nukleosidové analogy.
4. Lokalizace identifikovaných mutací v genomu V K E a na základě pozice v genomu
(konkrétně v genu NS5) odvodit možný mechanismus účinku vybraných nukleosidových
analogů.
29
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
5. Materiál a metody
5.1.Virové krneny, buněčné kultury a nukleosidové analogy
Všechny experimenty byly provedeny s kmeny V K E Hypr, který je zástupcem
západoevropského subtypu VKE. Pro virovou kultivaci, selekci virů rezistentních vůči lékům,
studie kinetiky růstu viru a plakové titrace byly použity stabilní buňky prasečí ledviny (PS),
které jsou široce využívané při studiích V K E (Kozuch a Mayer, 1975). Tyto buňky byly
kultivovány při 37 °C v Leibovitzově (L-15) médiu doplněném 6% fetálním bovinním sérem
a 1% směsí penicilinu a glutaminu (Sigma-AIdrich).
V této prácí byly použity 2 rodiny nukleosidových analogů; metylované a 4'azidované
analogy (Obr. 11). Metylované analogy 7-deaza-2'-C-metyladenosin (7-DCMA),
2'-C-metyladenosin (2'-CMA), 2'-C-metylguanosin (2'-CMG), 2'-C-metylcytidin (2'-CMC)
byly zakoupeny od Carbosynth. 4'-azidované sloučeniny 4'-azidocytidin (R-1479), 4'azidoaracytidin
(RO-9187) byly zakoupeny od MedChemExpress, 4'-azidouridin a doposud
nepojmenovaný 4'-azidovaný analog (reakční meziprodukt získaný při syntéze 4'azidouridinu)
označený jako Analog 1 byly zakoupeny také od Carbosynth. Pro studie in vitro
byly testované sloučeniny solubilizovány ve 100% dimetylsulfoxidu (DMSO), čímž byly
získány zásobní suspenze ve výchozí koncentraci 10 mM.
Obrázek 11: Struktura dalších nukleosidových analogů: 1) 2-C-metyladenosin,
2) 2'-C-metylguanosin, 3) 2'- metylcytidin, 4) Analog 1 a 5) 4'-azidouridin
30
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
5.2.Kultivační metody
5.2.1. Test inhibice virové replikace v buněčné kultuře
Inhibice replikace V K E zprostředkovaná nukleosidovými analogy byla hodnocena v buňkách
PS. Konfluentní monovrstvy PK buněk byly kultivovány na 96-jamkové destičce po 24 hodin
(s přibližnou koncentrací 2-104
aplikovaných buněk na jamku), poté bylo z jamek odsáto
médium a nahrazeno 200 ul čerstvého 0,5 % DMSO média obsahujícího danou koncentraci
testované sloučeniny. Každá z testovaných sloučenin 7-DCMA, 2'-CMA, 2'-CMG, 2'-CMC,
R-1479, RO-9187, 4'-azidouridin a Analog 1 byla testována v triplikátech v koncentracích 0-
50 uM. Následně byly buňky infikovány kmenem Hypr V K E při multiplicitě infekce (MOI)
0,1. Po 72 hodinách inkubace se médium odebralo a po kontrole cytopatického efektu pod
mikroskopem Olympus BX-5 se zmrazilo na -80 °C. Virové titry byly stanoveny plakovou
titrací.
5.2.2. Plaková titrace
Pro stanovení virových titrů v dané virové suspenzi byla použita metoda plakové titrace.
Výsledky tohoto testu mohou sloužit pro zvolení správného počátečního ředění při konstrukci
růstových křivek, stanovení míry inhibice viru nebo pro popis morfologie plaků.
Plakové titrace byly provedeny v opět PS buňkách na 24-jamkových destičkách.
Nejdříve se připravila desetinásobná ředění viru, kdy do všech jamek bylo naneseno 180 ul
média L-15 a poté pouze do první jamky bylo přidáno 20 ul viru V K E Hypr. Následně se
přeneslo pipetou s novou špičkou vždy 20 ul média s virem z předchozí jamky do sousední až
do ředění o výsledné koncentraci 10"1
až 10"7
. Do každé jamky byly přidány buňky PS v 300ul
suspenzi (v koncentraci 0,6 až 1,5 x 105
buněk na jamku) a destička se lehce protřepala. Po
4hodinové inkubaci byla suspenze překryta směsí 400 ul 3% karboxymetylcelulózy a 2x
koncentrovaného L-15 média. Následovala další inkubace po 4 až 6 dní v termostatu při 37°C.
Pro nabarvení byla pokrývka odstraněn a destičky byly promyty 0,9% roztokem NaCl a
buněčné monovrstvy byly obarveny naftalenovou černí (40 až 60 minut). Jednotlivé plaky
v jamkách byly spočítány a titry viru byly vyjádřeny jako plakotvorné jednotky (PFU standardizovaný
měřitelný ekvivalent infekční virové částice) na 1 ml vzorku podle
následujícího vzorce:
počet plak
Titr viru — :
d x v
kde d představuje ředění vzorku a v objem viru v 1 ml.
31
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
5.2.3. Selekce rezistentních virů
PS buňky v suspenzi média byly vysazeny na 96-jamkové destičky (koncentrace přibližně 2 x
104
buněk na jamku) a inkubovány po dobu 24 hodin za vytvoření konfluentní monovrstvy.
Po inkubaci bylo médium odsáto z jamek a nahrazeno 200 ul čerstvého média obsahujícího
příslušný nukleosidový analog (koncentrace viz Tab. 1). Současně byly buňky infikovány
kmenem Hypr V K E při multiplicitě infekce (MOI) 0,1. Tvorba cytopatického efektu (CPE)
byla monitorována vizuálně pomocí mikroskopu Olympus BX-5. Po vytvoření CPE
v infikovaných kulturách bylo kultivační médium sklizeno a použito pro infekci čerstvých
buněčných monovrstev v dalších pasážích. Jednotlivé pasáže byly prováděny s postupně se
zvyšujícími koncentracemi testované látky až do koncentrace 10 pM u RO-9187 a 50 pM u
R-1479 (Tab. 1). Souběžně byl kultivován standardní typ V K E (označovaný jako wild-type,
WT) v přítomnosti 0,5 % DMSO, tedy bez přídavku testovaných inhibitorů a byl použit jako
negativní kontrola. Po poslední pasáži byly kmeny V K E rezistentní na daný nukleosidový
analog i kontrolní kmeny V K E sklizeny a podrobeny další subkultivaci, aby se vytvořila
zásobní suspenze viru pro další experimenty (titr suspenze přibližně 104
-106
PFU/ml).
V této diplomové práci byly použity nebo vyselektovaný následující mutanty VKE:
(i) Mut7-DCMA-1 a Mut7-DCMA-2. Selekce proběhla ve dvou nezávislých experimentech,
pro selekci byl použit nukleosidový analog 7-DCMA v koncentračním rozsahu 0 - 5 0 pM.
Tyto mutanty byly selektovány již v dřívější studii (mutanta označovaná jako S603T, Eyer a
kol., 2017) podle schématu níže (Obr. 12) a v rámci této práce byly použity jako pozitivní
kontroly, pro osvojení metodiky související s manipulací a charakterizací rezistentních
virových variant a dále pro srovnání jejich mutačních profilů s ostatními selektovanými
mutanty. Vlastnosti této mutanty jsou podrobně popsány v práci Eyer a kol. (2017).
7-deaza-2'-CMA
5 uM 10 uM 20 uM 50 uM
1 I 1
číslo pasáže
5 6 7 8 9 10 11 12
Obrázek 12: Schéma pasáží při selekci mutant Mut7-DCMA-1 a Mut7-DCMA-2
získaných v předchozí studii (Eyer a kol., 2017; upraveno)
32
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
(ii) MutR-1479. Selekce proběhla v rámci této práce, byla provedena také ve dvou
nezávislých experimentech, avšak jeden ze selektovaných kmenů v průběhu pasážování
vymizel. Pro selekci byl použit analog R-1479 v koncentračním rozsahu 0-50 uM.
(iii) Mut7-DCMA/R-1479-1 a Mut7-DCMA/R-1479-2. Selekce proběhla v rámci této práce
a byla provedena také ve dvou nezávislých experimentech. Jako výchozí biologický materiál
pro selekci této mutanty byla použita mutanta Mut7-DCMA-1. Selekce byla provedena
pasážováním při konstantní koncentraci nukleosidu 7-DCMA (50 uM) a při postupně
zvyšující se koncentraci nukleosidu R-1479 (0 - 50 uM).
(iv) MutRO-9187. Selekce proběhla v rámci této práce, byla provedena také ve dvou
nezávislých experimentech, avšak jeden ze selektovaných kmenů v průběhu pasážování
vymizel. Pro selekci byl použit nukleosid RO-9187 v koncentračním rozsahu 0-10 uM.
Schéma pasážování a použité koncentrace j sou patrné z Tabulky 1.
Tabulka 1: Schéma pasáží při selekci jednotlivých rezistentních mutant v této práci
znázorňující jaké koncentrace daných látek byly použity v jednotlivých pasážích
MutR-1479 Mut7-DCMA/R-1479-1 MutRO-9187
pasáž Koncentrace
R-1479 [uM]
pasáž
Koncentrace
RO-1479 [uM] +
50 uM 7-DCMA
pasáž
Koncentrace
RO-9187 [uM]
1 5 1-4 5 1 0,1
2-7 10 5-7 10 2-4 0,25
8-10 25 8-10 20 5,6 0,5
11,12 50 11-13 25 7 1
14-17 50 8,9 2,5
10 5
11 10
5.2.4. Fenotypová charakterizace rezistentních virových mutant
Monovrstvy PS buněk (koncentrace přibližně 2 x 104
buněk na jamku), které byly kultivovány
po dobu 24 hodin v 96jamkových destičkách, byly ošetřeny 200 ul 0,5% DMSO média
obsahujícího testované sloučeniny (7-DCMA a/nebo R-1479) v duplikátech v koncentračním
rozmezí od 0 do 50 uM. Jamky byly následně infikovány při MOI 0,1 mutantním kmenem
V K E rezistentním k dané látce (kmeny Mut7-DCMA-l/2, MutR-1479 nebo 7-DCMA/R-
1479-1/2) a před odběrem média inkubovány po dobu 72 hodin při 37°C. Virové titry byly
stanoveny z odebraného média s virovými mutanty a pomocí plakové titrace a použity ke
stanovení křivek závislosti virového titru selektovaných mutant na koncentraci daných látek a
stanovení plakové morfologie mutantních virů.
33
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
5.2.5. Kvantitativní studium cytopatického efektu
Pro studium cytopatického efektu byly PS buňky vysazeny na 96-jamkové destičky, ošetřeny
médiem s testovanými sloučeninami a infikovány mutantními kmeny VKE, jak je popsáno u
předchozí metody 5.2.4. Kultivační médium bylo odstraněno 72 h po infekci, aby bylo
dosaženo 40 až 50% cytopatického účinku u buněk infikovaných virem. Buněčné monovrstvy
pak byly promyty 0,9% roztokem NaCl a barveny naftalenovou černí po dobu 40 až 60 minut
a opláchnuly. Poté byla měřena absorbance při vlnové délce 540 nm metodou skenování
plochy dna jamek přístrojem Synergy H l Hybrid Multi-Mode Reader.
5.3.Molekulárně biologické metody
5.3.1. izolace RNA
Ze zásobních suspenzí růstového média s mutantními nebo WT viry byla izolována RNA
pomocí kitu QIAmp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) následovně:
1. Vzorek odstředíme na centrifuze při 4 000 R P M po dobu 5 minut.
2. K odebranému 140 ul média s vyselektovaným rezistentním kmenem vzorku přidáme
600 ul lyzačního pufru A V L a 6 ul carrier RNA v l,5ml mikrozkumavce.
3. Promícháme 15 sekund na vortexu a inkubujeme při pokojové teplotě 10 minut.
4. Přidáme 600 ul 96 % etanolu a promícháme.
5. Na kolonku napipetujeme 700 ul vzorku a centrifugujeme 1 minutu 7 000 RPM.
Kolonku poté vložíme do nové 2ml mikrozkumavky.
6. Napipetujeme zbytek vzorku na kolonku a centrifugujeme 1 minutu při 7 000 RPM.
7. Na kolonku přidáme 500 ul promývacího pufru AW1 a centrifugujeme 1 minutu při 7
000 R P M a kolonku vložíme do nové 2ml mikrozkumavky.
8. Přidáme 500 ul promývacího pufru AW2 a centrifugujeme 3 minuly při 11 000 RPM,
poté vylijeme eluát a centrifugujeme další 2 minuly při 11 000 RPM.
9. Kolonku přendáme do čisté l,5ml mikrozkumavky a přidáme 60 ul elučního pufru
AVE, inkubujeme 1 minutu při pokojové teplotě a naposledy centrifugujeme 1 minutu
při 7 000 RPM.
10. Izolovanou RNA uchováváme při -80 °C.
34
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
5.3.2. Reverzně transkripční PCR (RT-PCR)
Pro RT-PCR bylo využito kitu QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit (Qiagen) a
následujícího postupu:
1. Rozmrazíme templátovou RNA, roztoky primerů, dNTP Mix, 5x pufr QIAGEN
OneStep RT-PCR a vodu bez RNázy a umístěte je na led.
2. Připravíme směs pro jednokrokovou RT-PCR (Tab. 2) s příslušnými primery (Tab. 3):
Tabulka 2: Nastavení reakce pro jednokrokovou RT-PCR.
Složky reakce Objem na 1 vzorek [ul]
OneStep Ahead RT-PCR Master Mix 2.5x 10
OneStep Ahead RT-Mix, 25x 1
Primer F* 1,25
Primer R* 1,25
Voda bez RNázy 5
Tracer 0,2
Templátová RNA (viz krok 4) 4
Celkový objem reakce: 25
•Tabulka 3: Charakteristika primerů použitých pro RT-PCR; jejich polarita (F =
„Forward", R = „Reverse"), sekvence, hybridizační teplota (HT), pozice v genomu VKE
Hypr (accession: NC_001672) a délka amplifikovaného segmentu (Růžek, 2005)
Primer Polarita Sekvence 5' -> 3'
HT
PC]
Pozice
Délka
fragmentu
2K F CTG T G G G G G TTT CTG CCT CT 50,8 7606-7625
915
2L R GTT TCG C T G TAC TGC T C C C G 50,8 8540-8521
915
1G F
TGG A G A C C A GAG A G G G C C
AA
50,8 8400-8419
812
1H R CTT CTT GAG G T G C C A G C C C A 50,8 9231-9212
812
2G F
GAA ATT G G G A G A ATT C G G
AGT G G C G
55 9048-9072
810
2H R
C G C CCT C C C A A C GAG TTC
ATC TTG
55 9882-9859
810
1E F TTG TTC A C A C C A TTT C C A C G 50,8 9792-9811
1330
1F R A G C G G G TGT I I I T C C G A G TC 50,8
11141-
11122
1330
35
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
3. Reakční směs důkladně promícháme a nadávkujeme příslušné objemy do PCR
zkumavek.
4. Přidáme templátovou RNA do j ednotlivých PCR zkumavek.
5. Naprogramujeme termocykler (použit T100 thermal cycler) podle programu
uvedeného v Tab. 4:
Tabulka 4: Podmínky jednokrokové RT-PCR pro amplikony < 1 kbp
Krok Čas Teplota [°C]
Reverzní transkripce 10 min 50
Počáteční krok aktivace P C R 5 min 95
Počet cyklů:
40
Denaturace 10s 95Počet cyklů:
40 Hybridizace 10s 50,8/55 viz Tab 3.
Počet cyklů:
40
Extenze 10s 72
Závěrečná extenze 2 min 72
5.3.3. Gelová elektroforéza
K separaci a vizualizaci produktů PCR bylo využito metody gelové elektroforézy
následujícím způsobem:
1. V baňce připravíme 1,5% agarózový gel smícháním 0,45 g agarózy s 30 ml TBE pufru
(Tris. kyselina boritá a EDTA), po zahřátí přidáme Midori Green DNA Stain (2 pl na 100
ml agarózového gelu; NIPPON Genetics EUROPE GmbH) a necháme ztuhnout
s hřebínkem v nalévací vaně.
2. Po ztuhnutí a vyjmutí hřebínku ponoříme gel do elektroforetické vany s TBE pufrem.
3. Před nanesením jednotlivých vzorků do jamek k nim přidáme 6 pl nanášecího pufru PCR
loading buffer Yellow load (Top-Bio).
4. Do jamek v gelu naneseme vzorky, do jedné z jamek naneseme velikostní marker
FastGene lOObp DNA ladder RTU (54pg/500pl; NIPPON Genetics EUROPE GmbH).
5. Do eletr oforetické vany pustíme proud o konstantním napětí 90 V po dobu 40-50 minut.
6. Po ukončení reakce gel vyjmeme a pořídíme fotografii gelu pomocí přístroje Azure c300
Gel Imaging System.
36
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
5.3.4. Extrakce DNA 2 gelu
Purifikace extrakcí z agarózovího gelu byla provedena pomocí kitu Wizard SV Gel and PCR
Clean-Up System (Promega) následovně:
1. Zvážíme l,5ml mikrocentrifugační zkumavku pro každý fragment DNA, který chceme
izolovat, a zaznamenáme hmotnost.
2. Vyřízneme DNA fragment v minimálním objemu agarózy a plátek gelu přeneseme do
zvážené mikrocentrifugační zkumavky a zaznamenáme hmotnost. Pro získání hmotnosti
plátku gelu odečteme hmotnost prázdné zkumavky od celkové hmotnosti.
3. Přidáme Membráne Binding Solution v poměru 10 (ri na 10 mg plátku agarózového gelu.
4. Přeneseme rozpuštěnou gelovou směs do sestavy minikolony SV a odběrové zkumavky a
inkubujeme 1 minutu při pokojové teplotě.
5. Centrifugujeme sestavu v mikrocentrifuze při 14 000 R P M po dobu 1 minuty, poté
vylijeme kapalinu ze sběrné zkumavky.
6. Promyjeme kolonku přidáním 700 (d Membráne Wash Solution a centrifugujeme sestavu
po dobu 1 minuty při 14 000 R P M a znovu vyprázdníme sběrnou zkumavku.
7. Opakujeme promytí s 500 ul Membráne Wash Solution a centrifugujeme sestavu SV
Minicolumn po dobu 5 minut při 14 000 RPM.
8. Vyprázdníme sběrnou zkumavku a znovu centrifugujte sestavu kolonky při 14 000 R P M
po dobu 1 minuty s otevřeným víčkem, aby se odpařil veškerý zbytkový etanol.
9. Opatrně přeneseme SV Minicolumn do čisté l,5ml mikrocentrifugační zkumavky a
naneseme 50 Nuclease-Free Water přímo do středu kolony. Inkubujeme při pokojové
teplotě po dobu 1 minuty, a centrifugujeme po dobu 1 minuty při 14 000 RPM.
10. Minikolonu SV vyhodíme a zkumavku s eluovanou D N A skladujeme při teplotě 4 °C.
5.3.5. Sekvenace genu NS5
Pro pokrytí důležitých částí genu NS5 V K E bylo pomocí PCR produkováno 8 (4 kódující a 4
antikódující) překrývajících se fragmentů DNA. D N A byla purifikována pomocí High Pure
PCR product purification kit (Roche) podle doporučení výrobce. Produkty PCR byly přímo
sekvenovány komerční službou (SEQme, Česká republika) pomocí Sangerovy sekvenační
metody. Nukleotidové i odvozené aminokyselinové sekvence byly analyzovány pomocí
editoru pro zarovnání sekvencí AliView, verze 1.28. Jako referenční genom pro identifikaci
mutací sloužil kmen WT pasážován zároveň s příslušnými mutanty, pro lokalizaci mutací pak
genom V K E , kmen Hypr (accession: NC 001672). Pro vytvoření schémat lokalizace
identifikovaných mutací (Obr. 15-18) byl použit software Geneious Prime®, verze 2021.2.2
(Biomatters, Ltd.).
37
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
6. Výsledky
6.1. Test inhibice replikace viru působením vybranými nukleosidovými
analogy
Pro porovnání antivirové aktivity vybraných 2'-C-metylovaných (Graf 1) a 4'-azidovaných
(Graf 2) nukleosidových analogů proti kmenu Hypr V K E byly tyto látky v koncentracích 0-50
uM inkubovány s virem na PS buňkách po dobu 72 hodin. Testované metylované nukleosidy
byly následující: 7-DCMA, 2'-CMA, 2'-CMG a 2'-CMC; 4'-azidované nukleosidy pak RO-
9187, R-1479, 4'-azidouridin a Analog 1 (reakční meziprodukt získaný při syntéze 4'azidouridinu).
Výsledné Grafy 1 a 2 pak ukazují závislost míry inhibice virové replikace na
koncentraci daných látek.
1 0 7
n
1 0 1
1 1 1 1 1 1 1 i 1
0 0.1 0.6 1 2.5 6 12 25 50
Koncentrace nukleosidu [(jM]
Graf 1: Závislost virového titru na koncentraci metylovaných analogů
U všech zkoumaných metylovaných nukleosidových analogů byla pozorována
antivirová aktivita proti V K E projevující se snížením virového titru o několik řádů (až 105
"6
krát
u 50 uM). Při nižších koncentracích látek (0,1 - 0,6 uM) se jako nej silnější inhibitor
prokázal 7-DCMA, nicméně při vyšších koncentracích byl nejúčinnější 2'-CMA, který z PS
buněk jako jediný úplně eliminoval replikaci viru. 2'-CMA, 2'-CMG a 2'-CMC výrazněji
inhibovaly virus až v koncentracích vyšších než 12 uM. Také u 2'-CMC došlo k úplné
inhibici viru při 50 uM.
38
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Koncentrace nukleosidu [pM]
Graf 2: Závislost virového titru na koncentraci 4'-azidovaných analogů
Ze 4'-azidovaných nukleosidových analogů antivirovou aktivitu in vitro projevily
pouze látky RO-9187 a R-1479 zbylé dva analogy 4'-azidouridin a Analog 1 neprokázaly
žádné účinky proti VKE. RO-9187 se prokázal jako nej silnější inhibitor virové replikace ze
všech zkoumaných látek v této práci, již při koncentraci 2,5 pM snížil virový titr 103
-krát a při
koncentraci 12 pM virus inhiboval úplně. R-1479 také projevil antivirovou aktivitu snížením
virového titru, zejména v maximální testované koncentraci (50 pM), nicméně ani tehdy
nedosáhl inhibiční aktivity analogu RO-9187.
6.2. Selektované mutantní kmeny
Za účelem selekce rezistentních mutant k daným látkám byl V K E Hypr pasážován v PS
buňkách v přítomnosti postupně se zvyšujících koncentracích příslušného nukleosidového
analogu. Pro selekci mutant rezistentních k metylovaným nukleosidům byl použit 7-DCMA,
jelikož z metylovaných nukleosidu vykázal nej větší aktivitu, pro selekci mutant rezistentních
k 4'-azidovaným analogům pak R-1479 i RO-9187, jelikož se od sebe liší konformací
cukerného kruhu (ribo-konformace u R-1479 a arabino-konfigurace u RO-9187). Pasážování
probíhalo vždy v duplikátech, byly tedy získány dva kmeny rezistentní k 7-DCMA
označovaných Mut7-DCMA-1 a 2 a dva kmeny rezistentní současně k oběma látkám 7D
C M A a R-1479 označovaných jako Mut7-DCMA/R-1479-1 a 2. Nicméně u mutantních
kmenů rezistentních k R-1479 (označen jako MutR-1479) a k 4'-azidoaracytidinu (MutRO-
9187) se podařilo izolovat pouze jeden kmen od každého (virus v jednom z duplikátů během
39
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
pasážování vymizel). Následující Grafy 3-5 ukazují citlivost/rezistenci získaných
rezistentních mutant na příslušné nukleosidové analogy v koncentracích 0-50 uM.
7-deaza-2'-C-methyladenosin (|JM)
Graf 3: Závislost titru rezistentních virových mutant a WT viru na koncentraci 7-DCMA
Zatímco WT virus při zvyšující se koncentraci nukleosidového analogu 7-DCMA
vykazoval na tuto látku vysokou citlivost a při koncentraci 12,5 uM byla jeho replikace
inhibována úplně, na replikaci obou rezistentních mutant neměla zvyšující se koncentrace 7D
C M A téměř žádný účinek (Graf 3). Lze tedy usoudit, že mutanty Mut7-DCMA-1 i 2 jsou
plně rezistentní k této látce.
Jak bylo již uvedeno v metodické části, mutant Mut7-DCMA odpovídá mutantu
S603T, který byl izolován v dřívější práci (Eyer et al., 2017). V této diplomové práci byly
vlastnosti mutanta Mut7-DCMA zhodnoceny také; tento virový kmen byl použit jako
kontrolní a posloužil také pro srovnání mutačních profilů s ostatnými selektovanými mutanty,
které byly v této práci selektovány a analyzovány poprvé. Vlastnosti mutanta Mut7-DCMA
jsou důležité zejména pro srovnání s mutanty Mut7-DCMA/R-1479-1 a 2, u kterých hraje
rezistence na 7-DCMA klíčovou roli spolu s rezistencí k R-1479.
40
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
0 ľ i ě!Š l i š 25 50
4'-azidocytidin ( R - 1 4 7 9 ) ( L J M )
Graf 4: Závislost titru rezistentních virových mutant a WT viru na koncentraci R-4179
U virového mutanta MutR-1479 s očekávanou rezistencí k R-1479 nebyla sledovaná
rezistence zcela kompletní a virový titr při maximální testované koncentraci poklesl pouze o
dva řády (10"2
-krát). Nicméně oproti WT viru, u kterého při koncentraci 50 pM poklesl titr o
šest řádů a byl úplně inhibován, byla citlivost mutanta MutR-1479 ktéto látce výrazně
snížena (Graf 4).
10'n
4'-azidocytidin ( R - 1 4 7 9 ) ( L I M )
Graf 5: Závislost titru rezistentních virových mutant a WT viru na rostoucí koncentraci
R-1479 a konstantní koncentraci 7-DCMA (50 uM)
41
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Mutantní kmeny Mut7-DCMA/R-1479-1 a Mut7-DCMA/R-1479-2 byly pasážovány a
testovány v rostoucí koncentraci R-1479 (0-50 pM) a konstantní koncentraci 7-DCMA (50
pM) s cílem navodit rezistenci k oběma látkám (Graf 5). V přítomnosti této kombinace látek
byla replikace WT viru inhibována již při koncentraci 3,2 pM R-1479 (+50 pM 7-DCMA).
Podobně i mutantní kmeny vykazovaly značnou citlivost k této kombinaci, nicméně ta byla
oproti WT viru výrazně snížena. Nejpatrnější rozdíl byl viditelný právě při koncentraci 3,2
pM R-1479, kdy WT virus byl úplně eliminován z kultury, zatímco titr virových mutant klesl
pouze o jeden řád.
Křivky závislosti titru mutantních kmenů rezistentních kRO-9187 se nepodařilo
získat, což bylo pravděpodobně způsobeno nízkým titrem mutantního viru v zásobní suspenzi
získané z několika posledních pasáží pro tuto metodu. Ze stejného důvodu se u tohoto
mutanta nepodařilo posoudit ani morfologie plaků (viz kapitola 6.3.)
63. Zhodnocení plakové morfologie mutant
Plaková morfologie selektovaných rezistentních mutant byla hodnocena pomocí
plakové titrace na PS buňkách a porovnána s morfologií plak WT virů. U mutantních kmenů
Mut7-DCMA-1 i 2 (Obr. 13) lze sledovat výrazný rozdíl v morfologii plaků oproti
příslušným WT virům. Mutantní kmeny tvoří matné plaky s menším průměrem na rozdíl od
WT virů, které tvoří čiré, kulaté a velké plaky. Cirost plaků je dána rychlostí replikace viru,
pokud se virus replikuje pomalu, buněčná kultura dorůstá, a tvoří tak další vrstvu buněk na
dně destičky pod vznikajícím plakem. Z morfologie plaků lze usoudit, že tento mutant
vykazuje výrazně sníženou replikační fitness (tzn. replikuje se pomaleji) oproti WT viru.
Mut7-DCMA-1 Mut7-DCMA-2 WT
Obrázek 13: Plaková morfologie mutant rezistentních k 7-DCMA a WT viru
42
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Naopak u mutantního kmene MutR-1479 (Obr. 14) jsou plaky oproti WT viru
podobně velké a čiré. To může být dáno i nižší úrovní rezistence než u metylovaných mutant,
což znamená, že replikační fitness MutR-1479 mutanta není postižena v takové míře, nebo
vůbec.
MutR-1479 WT
Obrázek 14: Plaková morfologie mutant rezistentních k R-1479 a WT viru
U virových mutantních kmenů Mut7-DCMA/R-1479-1 a 2 (Obr. 15) rezistentních
současně na 7-DCMA a R-1479, je silně oslabena replikační fitness, plaky jsou malé, matné a
téměř neznatelné. Z toho plyne, že u těchto mutant je replikační fitness v kultuře výrazně
omezena. Oslabení replikačního fitness mutant Mut7-DCMA/R-1479-1 a 2 je podle
morfologie plaků patrně nej výraznější ze všech selektovaných mutant.
Mut7-DCMA-1/R-1479-1 Mut7-DCMA-2/R-1479-2 WT
Obrázek 15: Plaková morfologie mutant rezistentních k 7-DCMA i R-1479 a WT viru
6.4. Zhodnocení tvorby cytopatického efektu mutatními kmeny VKE
Pro vybrané virové rezistentní mutanty byla dále stanovena schopnost inhibice tvorby
cytopatického efektu při kultivaci v přítomnosti nukleosidových analogů (0-50 n.M) in vitro.
Rozsah tvorby CPE byl hodnocen jako míra absorbance při 540 nm po obarvení infikovaných
buněk naftalenovou černí. Vyšší hodnota absorbance znamená, že virus byl v infikovaných
buňkách do jisté míry inhibován nukleosidovým analogem a větší počet PS buněk tedy
zůstalo životaschopnými a barvitelnými naftalenovou černí. Cytopatický efekt (a nízká
43
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
absorbance) tedy udává mina virem infikovaných hostitelských buněk, které po replikaci viru
lyžují, uvolňují se z monovrstvy a nejsou tedy barvitelné.
0
0 3,1 6,3 12,5 25 50
Koncentrace 7-deaza-2'-C-methyladenosinu (MM)
Graf 6: Inhibice cytopatického efektu mutantních kmenů a WT viru 7-DCMA
Mutanty Mut7-DCMA-1 a 2 rezistentní k nukleosidovému analogu 7-DCMA touto
látkou nebyly dostatečně inhibovány, a i v jejich vysokých koncentracích (50 uJVI) viry
úspěšně infikovaly PS buňky a projevily cytopatický efekt (Graf 6). Naopak WT virus citlivý
ke 7-DCMA s vzrůstající koncentrací látky postupně ztrácel schopnost tvořit v kultuře
cytopatický efekt.
1,4
0 3,1 6,3 12,5 25 50
Koncentrace 4'-azidocytidinu (|jM)
Graf 7: Inhibice cytopatického efektu mutantních kmenů a WT viru R-1479
44
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
U MutR-1479 mutantního kmenu projevující částečnou rezistenci bylo možné
cytopatický efekt pozorovat především do koncentrace 12,5 při kultivaci v přítomnosti
nukleosidových analogů (0-50 ^M) in vitro. Rozsah tvorby CPE byl hodnocen jako míra
absorbance při 540 nm po obarvení infikovaných buněk naftalenovou černí. Vyšší hodnota
absorbance znamená, že virus byl vjamkách do jisté míry inhibován nukleosidovým
analogem R-1479, při vyšších koncentracích byl ale také částečně inhibován (Graf 7). Stále
však vykázal menší citlivost k látce než WT virus, který s rostoucí koncentrací látky opět
zásadněji ztrácel schopnost infikovat PS buňky a tvořit cytopatický efekt.
- • - Mut7-DCMA/R-1479-1
Mut7-DCMA/R-1479-1
0 3,1 6,3 12,5 25 50
Koncentrace 4'-azidocytidinu(|jM) při konstantní
koncentraci 7-DCMA 50 (uM)
Graf 8: Inhibice cytopatického efektu mutantních kmenů a WT viru R-1479 a 7-DCMA
Stejně jako MutR-1479 mutant, mutantní kmeny Mut7-DCMA/R-1479-1 a 2
selektováni na rezistencí vůči 7-DCMA i R-1479 vykázaly pouze částečnou rezistenci (Graf
8). V nižších koncentracích R-1479 bylo u těchto kmenů možné sledovat cytopatický efekt,
ale v koncentracích 12,5 uM a více byl tento efekt částečně inhibován a v koncentraci 25 ^iM
byl inhibován úplně. Nicméně WT virus projevil mnohonásobně větší citlivost k těmto látkám
v nižších koncentracích a zcela ztratil schopnost tvorby cytopatického efektu již při
koncentraci 3,1 uM.
Je možné si všimnout, že grafy 6-8 v podstatě odpovídají grafům 3-5. To je dáno tím, že
míra CPE koreluje s hodnotami virového titru v infikované buněčné kultuře. Je tedy vidět, že
obě použité metody je možno využít pro kvantifikaci míry citlivosti/rezistence virů a virových
mutant ke studovaným látkám.
^1,6
3,1,2
o 1
o
f 0,6
J3 0,4
<
0,2
45
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
6.5. Identifikace mutací v genomech rezistentních mutant
Protože mechanismus účinku nukleosidových analogů je zacílen na aktivní místo RdRp
kódovanou genem NS5 VKE, byly mutace asociované s rezistentním fenotypem vyhledávány
právě v tomto genu mutantních kmenů. Gen NS5 byl amplifikován v podobě 4 překrývajících
se fragmentů (viz materiál a metody), úspěšnost amplifikace byla zhodnocena pomocí gelové
elektroforézy (Obr. 14) a dále byl gen Sangerovým sekvenováním.
Obrázek 14: Příklad zhodnocení úspěšnosti izolace segmentu DNA na
elektroforetogramu, hodnocena je úspěšnost amplifikovaného úseku 7 606 - 8 521 bp
v NS5 genu V K E Hypr, zde se nepodařilo izolovat kmen Mut7-DCMA/R-1479-1.
U obou Mut7-DCMA mutant (Tab. 5 a Obr. 15) byla nalezena mutace v pozici 603
NS5 proteinu měnící serinový zbytek za threoninový. Dále se vyskytovaly mutace Y453H,
A582E a Q620L, které byly identifikovány vždy pouze u jednoho ze dvou
získaných mutantních kmenů, pravděpodobně tedy nemají zásadní vliv pro zisk rezistentního
fenotypu. Také mutace G49S, C54T, K74T a R85T se objevily pouze u jednoho z Mut7D
C M A kmenů a nebyly prokázány v antikódujícím řetězci, může se tedy jednat o artefakty
vzniklé při sekvenaci vzorků. Mutace R101K byla identifikována také u jiných kmenů V K E
(např. V K E kmen ChB, accession: MT671302; nebo kmen 253, accession: MN520114), jedná
se zřejmě o alternativní kodon a nemá významný dopad na fenotyp. Podobně u mutace
v pozici G208G došlo sice k nukleotidové záměně, ale ta neměla vliv na změnu identity
aminokyseliny, jedná se tedy o synonymní mutaci bez vlivu na fenotyp.
46
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Tabulka 5: Identifikované mutace u mutant rezistentních na 7-DCMA. NT mutace v Hypr
genomu označuje polohu a typ nukleotidové substituce v genomu V K E Hypr, NT mutace
v genu NS5 polohu a typ nukleotidové substituce v genu NS5 a mutace A M K pak polohu a
typ aminokyselinové (AMK) substituce v genu NS5. Barevně jsou vyznačeny mutace sdílené
mutatními kmeny izolovanými v této práci (Tab. 5-8), šedě pak mutace, které se nepotvrdily
v antikódujícím řetězci.
Mutant
NT mutace
v genomu Hypr
NT mutace
v genu NS5
Mutace AMK
v genu NS5
Mut7-DCMA-1Mut7-DCMA-1
A7886C A221C K74T
Mut7-DCMA-1 G8050C G385C R85TMut7-DCMA-1
T9472A T1807A S603T
Mut7-DCMA-1
A9524T A1859T Q620L
Mut7-DCMA-2Mut7-DCMA-2
G7967A G302A R101K
Mut7-DCMA-2
T8288G T623G G208G
Mut7-DCMA-2
T9022C T1357C Y453H
Mut7-DCMA-2
C9410A C1745A A582E
Mut7-DCMA-2
T9472A T1807A S603T
1.360 1.370 1.380 1.390 1.400
1 G m
Cvs
M W C
H1SC
A A C
Asn
A A A A A
Lvs Are 1 Glu
A A A A A
LVS LVS
^ • G G G H T
p h e C
NS5 i
T-> C
T1357C Y453H
1.710 1.720 1730 1.740 1.750
Thr m\e Met
C A A A A A C A
Gin Lys Ala
T A T
Tyr
C A T
His
C C A A A
Ala Lys Val Val
warne-, c^m
Lys Val
Are
NS5
IP
C-> A
1,780 1,790 1,800 1,810 C1745A A582E ,S 2 0
^ • G G W^M Gwmm A T C A C A A A A • G W^M C A A A • G G •• H G C C A G W^M G M
Gin Are Gly Thr Gly Gin Val Va
NS5 <
n
T1807AS603T
Obrázek 15: Lokalizace nejvýznamnějších mutací v genu NS5 virových mutant
rezistentních na 7-DCMA. Oranžově je vyznačen typ nukleotidové substituce a její pozice
v genu NS5, modře pak typ a pozice příslušné AMK substituce.
47
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Jak bylo uvedeno výše, ačkoliv byl kmen MutR-1479 selektován v duplikátu, druhý
mutantní kmen se nepodařilo vykultivovat. Stejně jako u Mut7-DCMA rezistentních mutant, i
u MutR-1479 mutantního kmene byla identifikována mutace Y453H (Tab. 6 a Obr. 16). Dále
byla nalezena mutace R424G, která se potvrdila i v antikódujícím řetězci. U mutace E398E
byl výsledkem synonymní kodon a nezměnil se tedy smysl výsledné aminokyseliny.
Tabulka 6: Identifikované mutace u mutant rezistentních na R-1479. NT mutace v
genomu Hypr označuje polohu a typ nukleotidové substituce v genomu V K E Hypr, NT
mutace v genu NS5 polohu a typ nukleotidové substituce v genu NS5 a mutace AMK pak
polohu a typ aminokyselinové (AMK) substituce v genu NS5
Mutant
NT mutace v
genomu Hypr
NT mutace
v genu NS5
Mutace AMK
v genu NS5
MutR-1479
G8860A G1195A E398E
MutR-1479 A8935G A1270G R424GMutR-1479
T9022C T1357C Y453H
1,270 1.280 1,290 1,300 1,310
• G G • G • G G H G H I G I G G A T C C i C A
Pro Ala
^ H B G GLC A CH H G B G G H G I
NS5
O
A -> G
A1270G R424G
1,340 1,350 1,360 1,370 1,380
i • G G • G • • A G • G • G 1 • G M G G • G • G • G • G
I v"? Arp ^^^m I
NS5
T->C
T1357C Y453H
Obrázek 16: Lokalizace nejvýznamnějších mutací v genu NS5 virových mutant
rezistentních na R-1479. Oranžově je vyznačen typ nukleotidové substituce a její pozice
v genu NS5, modře pak typ a pozice příslušné AMK substituce.
Vzhledem k nízkému titru Mut-7-DCMA/R-1479-1 a jeho omezeným růstovým
vlastnostem se nepodařilo izolovat virovou RNA v dostatečném množství, a nebylo tak
možno provést sekvenaci. U Mut7-DCMA/R-1479-2 mutantního kmene rezistentního k 7D
C M A i R-1479 byly podle očekávání identifikovány kombinace mutací objevených u
jednotlivých Mut7-DCMA a MutR-1479 kmenů. Jedná se konkrétně o primární (signaturní)
mutaci S603T a mutaci A582E, které byly nalezeny u Mut7-DCMA mutant, a mutace Y453H
objevující se u všech mutant (Tab. 7 a Obr. 17). Dále byla identifikována mutace D415N nebo
48
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
mutace K74M, A633T a H697P, tyto tři však nebyly potvrzeny v antikódujícím řetězci, a
může se tedy jednat o artefakty při sekvenaci.
Tabulka 7: Identifikované mutace u mutant rezistentních na R-1479 a 7-DCMA. NT
mutace v genomu Hypr označuje polohu a typ nukleotidové substituce v genomu V K E Hypr,
NT mutace v genu NS5 polohu a typ nukleotidové substituce v genu NS5 a mutace AMK pak
polohu a typ aminokyselinové (AMK) substituce v genu NS5
Mutant
NT mutace v
genomu Hypr
NT mutace
v genu NS5
Mutace AMK
v genu NS5
A7886T A221T K74M
G8908A G1243A D415N
Mut7-DCMA/
T9022C T1357C Y453H
R-1479-2
C9410A C1745A A582E
T9472A T1807A S603T
G9562A G1897A A633T
A9755C A2090C H697P
-[4 G
Lys
ľ C A A A C
Ser Asn Ala Ala
• G G G I C l ľ T C A A A I
Ala Trp Ser Asn G\
C A A A A C
Gin Asn -N S 5
•p
G->A
G1243A D415N
1,350 1.360 1.370 1.380 1,390
• • G I G B G B A C A A Q f l G H G G G B A A A . • G • G G • • • • • G G G • G • G I
Lys Arg
•I
T -> C
T1357C Y453H
1,710
O
C->A
C1745A A582E
1,770 1.780 i.790 1.800 1,810
[ H A A A H ^ H G H G G B H G G G • C A T T
Arg Arg Asp Gin Arg • Š H H Thr Gly Gin Val
P
T -> A
T1807A S603T
Obrázek 17: Lokalizace nejvýznamnějších mutací v genu NS5 virových mutant
rezistentních na R-1479 a 7-DCMA. Oranžově je vyznačen typ nukleotidové substituce a její
pozice v genu NS5, modře pak typ a pozice příslušné AMK substituce.
49
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Také u mutanta MutRO-9187 byla identifikována mutace Y453H stejně jako u všech
mutantních kmenů (Tab. 8 a Obr 18). Mutace L611F byla nalezena i v antikódujícím řetězci a
představuje jednu z kandidátních mutací zodpovědnou za rezistenci na RO-9187. Mutace
K283K nemění smysl aminokyseliny, a navíc se zdá, že v tomto kodonu existuje jistá
přirozená variabilita mezi kmeny V K E . Poslední dvě mutace A783S a V817E nebyly
potvrzeny v antikódujících řetězcích a jejich význam pro získání rezistence je tedy nejasný.
Tabulka 8: Identifikované mutace u mutant rezistentních na RO-9187. NT mutace v Hypr
genomu označuje polohu a typ nukleotidové substituce v genomu V K E Hypr, NT mutace
v genu NS5 polohu a typ nukleotidové substituce v genu NS5 a mutace AMK pak polohu a
typ aminokyselinové (AMK) substituce v genu NS5
Mutant
NT mutace v
genomu Hypr
NT mutace
v genu NS5
Mutace AMK
v genu NS5
MutRO-9187
A8514G A849G K283K
MutRO-9187
T9022C T1357C Y453H
MutRO-9187 C9496T C1831T L611FMutRO-9187
G10012T G2347T A783S
MutRO-9187
T10115A T2450A V817E
1,340 1.350 1,360 1,370 1,380
MGMT • • A A A G I G I G G A A A
Arg Cys Ala His Cys Val Hi
Lys Arg mWu Lys
Lys
I NS5 I
T->C
T1357C Y453Y
1,830 1,840 1,850 1.860 1.870
mmmA A C A C C C C A A C A T A A AI G Gm GC A A C T A A T C C A A T A T
Ala Phe Asn Thr Leu Thr Asn
mmm Lys Val
Gin Leu Ile Arg Met Met
NS5
C->T
C1831T L611F
Obrázek 18: Lokalizace nejvýznamnějších mutací v genu NS5 virových mutant
rezistentních na RO-9187. Oranžově je vyznačen typ nukleotidové substituce a její pozice v
genu NS5, modře pak typ a pozice příslušné AMK substituce.
50
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
7. Diskuse
Rostoucí incidence klíšťové encefalitidy s současnosti představuje závažný problém
v různých částech Evropy a Asie (Süss, 2003), a přestože je dostupná vakcína sloužící jako
prevence proti tomuto onemocnění, stále existuje naléhavá potřeba nových možností terapie
této infekce. Velkým potenciál pro vývoj nových léků proti K E se zlepšenou účinností a
specifitou představují nukleosidové analogy. Nevýhodou této možnosti terapie je ovšem
související riziko rozvoje virové rezistence vůči těmto látkám, která komplikující terapii již
schválenými léčivy (Migliaccio a kol., 2003). K prevenci vzniku virové rezistence například
správnou volbou kombinace léčiv je potřeba důkladně porozumět molekulárním interakcím
antivirotik s cílovými virovými proteiny. Tato práce se tyto mechanismy snažila objasnit
pomocí selekce rezistentních virových mutant a identifikace mutací asociovaných s rezistencí.
V této práci byly proti V K E (kmen Hypr) testovány nukleosidové analogy, jejichž
inhibiční účinky byly již dříve důkladně studovány a potvrzeny u H C V (Carrol 2003; Olsen a
kol., 2004; Klumpp a kol., 2006; Klumpp a kol., 2008). Jelikož V K E i H C V patří mezi
flaviriry, existuje vysoká homologie mezi jejich virovými proteiny (včetně RdRp), a dá se
tedy očekávat podobný mechanismus inhibice těmito analogy. Tato práce je pak zaměřena na
dvě třídy nukleosidových analogů; 2'-C-metylované (7-DCMA, 2'-CMA, 2'-CMG, 2'-CMC) a
4'-azidované analogy (R-1479, RO-9187, 4'-azidouridin a Analog 1). Vyjímaje 4'azidouridinu
a Analogu 1, Eyer a kol. (2016b) již dříve prokázali účinnost těchto látek proti
V K E v PS buňkách, a tyto výsledky byly následně potvrzeny i v této práci. Potenciální
cytotoxicita byla studována dříve (Eyer a kol., 2016a); všechny testované látky vykazují
cytotoxicitu > 50 uM. 7-DCMA se v inhibici V K E projevil jako nejúčinnější z 2'-Cmetylovaných
analogů, proto byl vybrán jako jejich zástupce pro selekci rezistentních mutant.
Z 4'-azidovaných látek nejvyšší aktivitu projevil RO-9187, R-1479 nižší a 4'-azidouridin a
Analog 1 neprojevily aktivitu žádnou. Pro selekci pak byly vybrány jako zástupci této třídy
RO-9187 i R-1479 kvůli navzájem se lišící konformaci cukerného kruhu, a tedy potenciálně
rozdílným mechanismům účinku.
K získání rezistentních virových mutant byl V K E pasážován na monovrstvách PS buněk
ve vzrůstajících koncentracích příslušných látek. Oba Mut7-DCMA mutanty vykázaly oproti
WT viru úplnou rezistenci i při nejvyšší testované koncentraci 50 pM 7-DCMA, naopak
mutant MutR-1479 vykázal pouze částečnou rezistenci a při nejvyšší testované koncentraci R-
1479 byl látkou mírně inhibován. To může být následkem nižší inhibiční aktivity látky R-
1479. U mutantních kmenů Mut7-DCMA/R-1479 byl virus při maximální koncentraci obou
51
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
látek 7- D C M A a R-1479 inhibován úplně, nicméně v nižších koncentracích vůči nim stále
projevil sníženou citlivost oproti WT viru. U MutRO-9187 se nepodařilo izolovat infekční
virové částice a ověřit tak fenotyp viru. Podařilo se však izolovat virovou RNA a detekovat
mutace, kterými se mutantní kmen liší od WT. Neschopnost izolovat infekční virus z látkou
ošetřených buněk pravděpodobně spočívá vtom, že RO-9187 je velmi silné antivirotikum,
jeho hodnota EC50 (tzn. účinná koncentrace látky inhibující replikaci viru o 50 %) byla v PS
buňkách až 1 Okřát nižší než u ostatních studovaných nukleosidů (Eyer a kol., 2016b).
Rezistentního mutanta vůči RO-9187 je tedy velmi obtížné vyselektovat (přestože maximální
testovaná koncentrace byla pouze 10 uM oproti 50 uM u ostatních látek). Nicméně silná
inhibiční aktivita RO-9187, a tedy i vysoká genotypová bariéra pro vznik mutací
zodpovědných za rezistenci, svědčí o vysokém potenciálu této látky pro vývoj nového léčiva.
Na druhou stranu v jiných studiích RO-9187 (spolu s R-1479) se ukázalo, že jeho inhibiční
aktivita proti V K E je tedy pravděpodobně limitována pouze na určité buněčné typy, jelikož v
buňkách lidského neuroblastomu (tzv. UKF-NB4) neprojevil žádné účinky (Eyer a kol.,
2018). UKF-NB4 linie totiž zřejmě nedisponuje potřebnými nukleosid kinázami pro aktivaci
(fosforylaci) nukeosidů (Eyer a kol., 2016b), což by se ovšem dalo řešit vývojem proléčiva
s již zavedenými fosfátovými skupinami (Han a Amidon, 2000).
U selektovaných mutantních kmenů byly dále analyzovány změny fenotypových
vlastností a replikační fitness. Zhodnocení morfologie plak pomocí plakové titrace pak u
rezistentních kmenů Mut7-DCMA a Mut7-DCMA/R-1479 potvrdilo předpoklad, že
v prostředí silného selekčního tlaku (přítomnosti antivirotik) mutace v genu NS5 sice přinášejí
výhodu ve formě rezistentního fenotypu, zároveň ale snížením aktivity mutantní RdRp nesou
určité náklady na replikační fitness mutant (Tanaka a Valckenborgh, 2011). Tyto rezistentní
kmeny tvořily oproti WT virům menší a matné plaky, což znamená, že u nich došlo ke snížení
rychlosti replikace a schopnosti infekce PS buněk. Naopak u MutR-1479 kmene s fenotypově
neúplnou rezistencí nebyly náklady na fitness tak patrné a plaky byly téměř identické jako u
WT viru.
Dále bylo provedeno in vitro zhodnocení schopnosti nukleosidových analogů inhibovat
cytopatický efekt způsobený rezistentními mutanty. Výsledky získané touto metodou korelují
s výsledky získanými pomocí titr-redukčních testů. V závislosti na selekčním tlaku a míry
rezistence je patrné, že narozdíl od WT jsou mutantní kmeny schopny působit tvorbu CPE i v
látkou ošetřených kulturách. U Mut7-DCMA byla tato schopnost téměř neomezena ve všech
testovaných koncentracích 7-DCMA, kmen MutR-1479 schopnost tvorby CPE lehce ztratil ve
vyšších koncentracích analogu R-1479 a Mut7-DCMA/R-1479 ji v maximální koncentraci
52
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
látek ztratil úplně, nicméně jeho rezistence k oběma látkám byla v nižších koncentracích
dobře patrná.
V další části práce byla provedena genotypová analýza virových rezistentních mutant
V K E za účelem identifikace mutací asociovaných se vznikem rezistence k jednotlivým
nukleosidovým analogům. Ze zásobní suspenze získané pasážováním virů byla vyizolována
RNA, ta byla dále amplifikována pomocí RT-PCR a osekvenována Sangerovou metodou.
U nukleosidových antivirotik s 2'-C-metyl nebo 4'-azido modifikacemi se předpokládá, že
fungují jako neobligátní terminátory replikace V K E zprostředkovanou flavivirovou RdRp
Mechanismus inhibičního účinkuje tedy založen na interakci daného nukleosidového analogu
s aktivním místem této polymerázy V K E (De Clercq a Neyts, 2009). Mutace zodpovědné za
rezistenci tedy očekáváme v genu NS5, který kóduje RdRp protein. Sekvence genu NS5 byla
amplifikována a sekvenována ve formě čtyř překrývajících se fragmentů a po porovnání
mutantních sekvencí se sekvencemi WT virů byly identifikovány kandidátní mutace
asociované s rezistencí.
U mutantních kmenů Mut7-DCMA rezistentních k 7-DCMA byla nej významnější
objevenou mutací S603T, která byla identifikována již v předešlé studii (Eyer a kol., 2017) a
znovu se tak potvrdil její význam jako primární mutace zodpovědné za rezistenci
k nukleosidovým analogům s 2'-C-metyl skupinou. Analogické mutace k S603T mutaci
v NS5 genu V K E zodpovědné za rezistenci ke 2'-C-metylovaným analogům byly nalezeny i v
jiných flavivirirových RdRp genech, konkrétně mutace S282T v genu NS5B u H C V (Klumpp
a kol., 2006), S600T v genu NS5 u viru Dengue (Latour a kol., 2010) a S604T u viru Zika
(Xu a kol., 2015). Mutatní kmeny V K E rezistentní na 2'-C-metylované nukleosidy vykázaly
také výraznou atenuaci (oslabení replikace) v myším infekčním modelu (Eyer a kol., 2017).
V předchozích animálních experimentech se u některých mutant rezistentních k 2'-Cmetylovaným
analogům vyskytovaly také mutace Y453H, A582E a Q620L (Eyer a kol.,
2017). Nicméně tyto tři mutace byly v této práci identifikovány vždy pouze u jednoho
z mutantních kmenů, pravděpodobně tedy nemají zásadní vliv pro zisk rezistentního fenotypu,
ale může se jednat o mutace kompenzační. Mutace R101K je výsledkem alternativního
kodonu a lze vyloučit její vliv na rezistentní fenotyp. Tichá mutace G208G, u které nedošlo ke
změně výsledné aminokyseliny, sice může mít vliv například na rychlost syntézy virové
nukleové kyseliny v závislosti na dostupnosti tRNA v buňce (Harrigan a kol., 2008), ale
pravděpodobně také nemá vliv na rezistenci mutantních virů.
Tichá mutace byla nalezena i v mutantním kmenu MutR-1479, konkrétně mutace E398E,
a její vliv na rezistenci jsme tedy také vyloučili. I u tohoto mutanta byla identifikována
53
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
mutace Y453H, pravděpodobně má tedy vliv na virový fenotyp jako kompenzační mutace,
nemusí však souviset s rezistencí. Spolu s mutací R424G byla tato mutace potvrzena i ve
zmíněných myších modelech (Eyer a kol., 2017). Mutace R424G by mohla představovat
kandidátní mutaci pro rezistentní fenotyp u MutR-1489 kmenů, nicméně nebyla potvrzena ani
u jednoho mutanta Mut7-DCMA/R-1479. Je tedy možné, že u tohoto mutanta na výsledný
fenotyp působí několik mutací s menším aditivním vlivem na rezistenci, a nejedna primární
mutace v aktivním místě RdRp jako mutace S603T u Mut7-DCMA (Croteau a kol. 1997).
Toto tvrzení by podpořil i fakt, že pozorovaná rezistence MutR-1479 mutant u fenotypových
testů byla pouze částečná a replikační fitness tohoto mutantního kmene se příliš neliší od WT
viru.
U mutant Mut7-DCMA/R-1479 rezistentních na 7-DCMA i R-1479 se objevily
kombinace mutací, které byly nalezeny u kmenů rezistentních k jednotlivým látkám. U těchto
mutant za rezistenci na metylové nukleosidy opět zodpovídá mutace S603T, na 4'-azidované
nukleosidy pravděpodobně některé z mutací nalezených u MutR-1479. Jak je uvedeno výše,
tyto mutace spíše každá mírně modulují fentotyp viru, ale žádná není přímo signatumí (přímo
zodpovědná za vysoký stupeň rezistence), na rozdíl od S603T u MUT7-DCMA. Replikační
fitness těchto mutant byla velmi silně redukována, jak bylo potvrzeno i při hodnocení
morfologie plaků. U těchto mutant bylo identifikováno i více potenciálně kompenzačních
mutací (D415N, Y453H a A582E), které by mohly zajišťovat zachování dostatečné replikační
fitness viru v prostředí silné selekce (dva inhibitory) (Tanaka a Valckenborgh, 2011).
Podobný jev byl popsán i např. u viru hepatitídy B (Zhang a kol, 2019). Opět jako v případě
ostatních selektovaných mutant byla nalezena mutace Y453H, což poukazuje na možnou roli
této substituce jako kompenzační mutace. Získání mutantního kmene V K E rezistentního na
dva typy strukturně nepříbuzných nukleosidů nám dovoluje učinit si představu o vlastnostech
virových mutant vznikajících při použití kombinační terapie. I když ke vzniku rezistentních
mutant došlo, jejich infekčnost a replikační fitness jsou natolik nízké, že je jejich průkaz
v infikovaných buňkách do značné míry obtížný. To podporuje myšlenku, že kombinační
terapie je v praxi použitelným přístupem v boji s virovými infekcemi i s antivirovou rezistencí
(Yangakol., 2012).
Jak bylo zmíněno dříve, RO-9187 představuje velmi silné antivirotikum a nepodařilo se
nám vyselektovat infekční virus pro provedení fenotypových testů. Přesto jsme úspěšně ze
zásobní suspenze izolovali dostatek RNA pro sekvenaci a identifikaci mutací asociovaných
s rezistencí. U mutanta MutRO-9187 byla identifikována další tichá mutace K283K se
zanedbatelným vlivem na rezistentní fenotyp mutanta a opět se potvrdila kompenzační mutace
54
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Y453H. Po vyloučení vlivu ostatních mutací jako primárních pro vznik rezistence, zůstala
jediná kandidátní mutace L611F. Nicméně k potvrzení významu této mutace je potřeba
provést další molekulární analýzy, často se využívá reverzně genetický systém (Aubry a kol.,
2014). Při této metodě se pomocí místně řízené mutageneze vnese kandidátní mutace do
rekombinantního kmene VKE, a pokud tento kmen projeví rezistenci k dané látce, můžeme
předpokládat, že se opravdu jedná o primární mutaci zodpovědnou za rezistenci.
Ze získaných výsledků je zřejmé, že mutace Y453H se vyskytuje u všech selektovaných
mutant. Nicméně u mutant rezistentních k metylovaným analogům Mut7-DCMA se vyskytuje
pouze u jednoho z kmenů, což souhlasí i s výsledky studie Eyer a kol. (2017). Proto se zřejmě
nejedná o primární mutaci přímo zodpovědnou za rezistenci. Domníváme se, že se může
jednat o univerzální kompenzační mutaci pro viry rezistentní na strukturně odlišné
nukleosidové analogy, v tomto případě 2'-C-metylované a 4'-azidované analogy. Mutace
Y453H v aktivním místě RdRp byla navíc popsána jako kompenzační i u mutantních
virových kmenů rezistentních k léčivu galidesivir (tzv. BCX4430) (Obr. 19, Eyer a kol.,
2019), který se od zmíněných analogů sice strukturně liší, ale také se řadí mezi nukleosidové
neobligátní terminátory virové replikace (De Clercq, 2016). Zdá se tedy, že tato mutace se
vyskytuje jako reakce aktivního místa flavivirové polymerázy na obecnou strukturu
nukleosidů a k jejímu vytvoření mohou v rámci molekuly nukleosidu vést různé chemické
modifikace cukerného kruhu nebo heterocyklické báze.
1,350 1,360 1,370 1,380 1,390 1,400
— CysC
Val
C A C A A C
Asn
H li M G G G •
Met Met Gly
A A A A
Lys Arg
A MMĚC A A A
Lys Lys mm G G • Phe
G G
Gly
1 N S S
:
P pT->C G->T
T1357C Y453H G1380T E450D
Obrázek 19: Lokalizace nejvýznamnějších mutací v genu NS5 virových mutant rezistentních
na galidesivir (Eyer a kol., 2019). Oranžově je vyznačen typ nukleotidové substituce a její
pozice v genu NS5, modře pak typ a pozice příslušné AMK substituce.
Kromě mutace Y453H však kmeny Mut7-DCMA a MutR-1479 žádné jiné mutace
nesdílely, což potvrzuje předpoklad, že mezi 2'-C-metylovanými a 4'-azidovanými nukleosidy
nedochází ke zkřížené rezistenci (Klumpp a kol., 2006). To bylo nakonec také potvrzeno
v práci Eyer a kol. 2017, že mutatny rezistentní na 2'-C-metylované nukleosidy nejsou
současně rezistentní na 4'-azidované nukleosidy. Lze tedy usoudit, že mechanismus vzniku
rezistence, a tedy i molekulární mechanismus interakce obou typů nukleosidů s aktivním
místem NS5 polymerázy se u těchto tříd analogů výrazně liší. Tento rozdíl je zřejmě určen
přítomností 2'-C-metylové, resp. 4'-C-azidové skupiny (Migliaccio a kol., 2003).
55
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Všechny z testovaných látek 7-DCMA, R-1479 a RO-9187 vykázaly in vitro antivirovou
aktivitu proti V K E a jsou tedy dobrými kandidáty pro vývoj nových terapeutik pro léčbu KE.
Dalším testováním je nutné ověřit, zda si látky zachovávají své inhibiční účinky V K E i in
vivo, na což například poukázala i tkáňová specifita účinku analogů R-1479 a RO-9187
v předchozích studiích (Eyer a kol., 2018). In vivo aktivita proti V K E byla však doposud
potvrzena pouze u látky 7-DCMA na myším modelu (Eyer a kol., 2017). Syntéza 4'azidovaných
nukleosidů je finančně náročná a je obtížné získat tyto látky v dostatečném
množství, aby je bylo možno použít pro animální studie. Eyer a kol. (2016b) také testovali
cytotoxicitu těchto látek, a zatímco přítomnost 7-DCMA (a obecně 2'-C-metylované analogy)
a R-1479 v PS buňkách neměla na životaschopnost buněk téměř žádný vliv, silný analog RO-
9187 vykázal mírnou cytotoxicitu.
Dalším krokem při vývoji léčiv je studium rezistence a identifikace jednotlivých mutací
asociovaných s rezistencí, případně studium zkřížené rezistence s jinými léčivy. V této práci
byla opět potvrzena primární mutace S603T u mutantních kmenů rezistentních
k nukleosidovému analogu 7-DCMA, která zřejmě má za následek konformační změnu
aktivního místa flavivirové RdRp. Tato polymeráza poté není schopna rozpoznat
nukleosidová antivirotika a začlenit je do nascentího řetězce při replikaci virové RNA, čímž
tato antivirotika ztrácí své inhibiční účinky (Migliaccio a kol., 2003). U 4'-azidovaných
analogů je výskyt primárních (signaturních) mutací nejasný. U MutRO-9187 byla však
nalezena jediná kandidátní mutace L611F, její vliv na rezistenci by však měl být prozkoumán
v dalších studiích. Nalezené mutace však musí být v navazujících studiích důsledně testovány
pomocí reverzně-genetických systémů ve smyslu jejich vlivu na rezistentní fenotyp viru. Bez
těchto podrobných analýz není možno učinit závěr, jak se daná mutace na fenotypu viru
podílí.
U většiny selektovaných mutant se nalezl též velký počet mutací, které např. nebyly
prokázány v antikódujícím řetězci, nebo byly pozorovány pouze u jednoho ze dvou získaných
mutantních klonů. Jedná se konkrétně o mutace G49S, C54T, K74T a R85T u Mut7-DCMA,
K74M, A633T a H697P u Mut7-DCMA/R-1479 a mutace A783S a V817E u MutRO-9187.
Tyto mutace je rovněž nutno posoudit v následných studiích a odlišit je od možných
sekvenačních artefaktů.
Závěrem je třeba říci, že studium mutací asociovaných s rezistencí má velký význam také
při popisu mechanismu účinku kandidátních látek pro vývoj potenciálních léčiv. Četný výskyt
bodových mutací v rámci genu pro NS5 protein jednoznačně dokládá, že molekulární
interakce studovaných nukleosidových analogů s proteinem NS5 je více než zřejmá. Nicméně
56
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
rozdíly v mutačních profilech selektovaných mutant naznačují, že pro jednotlivé studované
nukleosidy patrně existují v rámci NS5 proteinu různá klíčová místa nebo strukturní domény
pro interakci. Tato místa pak mohou přímo souviset s velikostí genotypových bariér pro
získání a udržení rezistence i s velikostí fenotypových bariér souvisejících s biologickými
vlastnostmi rezistentních mutant, s jejich replikačním fitness a schopností infikovat hostitele a
šířit se v jeho tkáních.
57
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
8. Souhrn
Předmětem této diplomové práce byla charakterizace mechanismů účinku nukleosidových
inhibitorů viru klíšťové encefalitidy. Osvětlení těchto mechanismů by mohlo napomoci k
vývoji nových terapeutik KE, jelikož v současnosti nejsou dostupná žádná specifická
antivirotika k léčbě této infekce. Navíc tyto poznatky mohou sloužit k porozumění
mechanismů virové rezistence a k omezení jejího vlivu na selhání terapie nukleosidových
analogů.
Prvním cílem práce bylo otestovat antivirovou aktivitu nukleosidových analogů vůči
VKE, konkrétně j sme se zaměřily na 2'-C-methylované a 4'-azidované analogy. Kromě dvou
analogů se většina testovaných látek osvědčila jako účinná při inhibice replikace V K E ,
z těchto látek pak byli vybráni tři zástupci (7-DCMA, R-1479 a RO-9187) pro provedení
dalších analýz.
Pro studium mechanismu účinku těchto látky byly vyselektovaný virové kmeny
rezistentní vůči těmto látkám, a to pasážováním viru V K E postupně rostoucích koncentracích
těchto látek. Zároveň byl selektován kmen rezistentní vůči dvěma nukleosidům současně 7D
C M A i R-1479. Tyto mutantní kmeny byly nadále fenotypově a genotypově
charakterizovány. Na základě těchto testů se hodnotila závislost virového titru a schopnosti
inhibice viru tvořit cytopatický efekt na koncentraci látek. Byl pozorován různý stupeň
rezistence získaných mutant na testované látky. Např. Mut7-DCMA byl zcela rezistentní
v celém koncentračním rozmezí (0-50 pM), zatímco MutR-1479 vykazoval pouze částečnou
rezistenci i při nejvyšších testovaných koncentracích (50 pM). Pomocí zhodnocení plakové
morfologie mutant se u většiny z nich potvrdilo, že zisk rezistentního fenotypu má určité
náklady na replikační fitness mutant a že schopnost mutantních kmenů replikovat se
v hostitelských buňkách oproti WT viru je výrazným způsobem omezena.
Následně byly porovnáním genomů mutantních a wild-type kmenů identifikovány bodové
mutace v genu NS5 asociované s rezistencí na jednotlivé analogy. Gen NS5 byl vybrán,
jelikož kóduje protein RdRp, který je cílem nukleosidových analogů fungujících jako
neobligátní terminátory replikace. U mutant rezistentních na 7-DCMA byla identifikována
mutace S603T, která byla popsána již v předchozích studiích. U mutant rezistentních kR-
1479 nebyla potvrzena žádná primární mutace a předpokládá se vliv více mutací s menším
efektem na fenotyp. U mutant rezistentních k RO-9187 byla nalezena kandidátní mutace
způsobující rezistenci L611F, její dopad na fenotyp se ale musí potvrdit dalšími pokusy. Dále
byla identifikována mutace Y453H, zřejmě kompenzačního charakteru, která se objevovala u
58
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
všech selektovaných mutant. Porovnáním mutačních profilů jednotlivých mutant byla dále
vyloučena zkřížená rezistence mezi zkoumanými analogy, která by mohla v budoucnu
komplikovat léčbu těmito látkami nejen infekcí způsobenými virem klíšťové encefalitidy ale i
jiných flavivirů.
Rozdíly v mutačních profilech jednotlivých mutantních kmenů jednoznačně poukazuje na
rozdíly v charakteru molekulárních interakcí studovaných nukleosidových analogů s cílovým
proteinem NS5. Je zřejmé, že jednotlivé nukleosidy mají odlišná klíčová interakční místa
v rámci NS5 (pravděpodobně uvnitř aktivního RdRp místa) a tím se zásadně liší
v mechanismem interakce s tímto virovým proteinem. Selektované mutanty, jejich fenotypové
vlastnosti i identifikované mutace asociované s rezistencí tak přispívají nejen ke studiu
rezistence V K E na potenciální nukleosidová léčiva, ale také k objasnění molekulárního
mechanismu antivirového účinku těchto velice zajímavých látek.
59
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
9. Summary
The subject of this diploma thesis was the characterization of the mechanisms of action of
nucleoside inhibitors of tick-borne encephalitis virus (TBEV). The elucidation of these
mechanisms could help to develop new therapeutics, as no specific antivirals are currently
available to treat this infection. In addition, this knowledge may serve to understand the
mechanisms of viral resistance and to limit its impact on the failure of nucleoside analog
therapy.
The first aim of this work was to test the antiviral activity of nucleoside analogues
against TBEV, specifically we focused on 2'-C-methyl and 4'-azido analogues. Except two
analogues, most of the test substances proved effective at inhibiting TBEV replication, and
three agents (7-DCMA, R-1479 and RO-9187) were selected for further analysis. To this end,
virus strains resistant to these substances were selected by passage of TBEV virus with
gradually increasing concentrations of these substances. In addition, a strain resistant to both
7-DCMA and R-1479 was selected at the same time. These mutant strains continued to be
phenotypically and genotypically characterized. Based on these assays, the dependence of the
viral titer and the ability of the virus to inhibit the cytopathic effect on the concentration of
substances was evaluated. Different degrees of resistance of the obtained mutants to the test
substances were observed. For example, Mut7-DCMA was completely resistant over the
entire concentration range (0-50 uM), while MutR-1479 showed only partial resistance even
at the highest concentrations tested (50 uM). Moreover, by evaluating the plaque morphology
of the mutants, it was confirmed that gaining a resistant phenotype had some cost for the
replicating fitness mutant.
Subsequently, point mutations in the NS5 gene associated with resistance to individual
analogues were identified by comparing the genomes of mutant and wild-type strains. The
NS5 gene was chosen as it encodes the RdRp protein, which is the target of nucleoside
analogues that act as non-obligatory replication terminators. The S603T mutation was
identified in 7-DCMA resistant mutants and had been described in previous studies. No
primary mutation was confirmed in R-1479 resistant mutants, therefore we suspect a smaller
number of mutations with smaller contribution to the resistant phenotype. In mutants resistant
to RO-9187, a candidate mutation L61 IF associated with resistance was found, but its impact
on the phenotype must be confirmed by further experiments. Furthermore, seemingly
compensatory mutation Y453H was found in all types of selected mutants. By comparing the
mutation profiles of individual mutant strains, we ruled out the existence of cross-resistance
60
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
between the studied analogues, which could complicate the treatment only of infections
caused by tick-borne encephalitis virus, but also other flaviviruses. Differences in the
mutation profiles of individual mutant strains clearly indicate differences in the nature of the
molecular interactions of the studied nucleoside analogues with the NS5 target protein. The
individual nucleosides have different key interaction sites within NS5 (probably within the
active RdRp site) and thus differ significantly in the mechanism of interaction with this viral
protein. The selected mutants, their phenotypic characteristics and the identified mutations
associated with resistance thus contribute not only to the study of V K E resistance to potential
nucleoside drugs, but also to the elucidation of the molecular mechanism of the antiviral
effect of these very interesting substances.
61
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
10. Literatura
Adachi T., Ago H., Habuka N., Okuda K., Komatsu M., Ikeda S., Yatsunami K 2002
The essential role of C-terminal residues in regulating the activity of hepatitis C virus
RNA-dependent RNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1601: 38-48.
Ashour J,. Laurent-Rolle M., Shi P.Y., Garcia-Sastre A. 2009. NS5 of dengue virus
mediates STAT2 binding and degradation. J. Virol. 83: 5408-5418.
Aubry F., Nougairede A., de Fabritus L., Querat G., Gould E. A., de Lamballerie X.
2014. Single-stranded positive-sense RNA viruses generated in days using infectious
subgenomic amplicons. J. Gen. Virol. 95: 2462-2467.
Baier A. 2011. Flaviviral infections and potential targets for antiviral therapy. In: Ruzek D.
(ed). Flavivirus Encephalitis. Rijeka, InTech. 89-104.
Beese L.S.; Steitz T.A. 1991. Structural basis for the 3-5' exonuclease activity of
Escherichia coli DNA polymerase I: A two metal ion mechanism. EMBO J. 10: 25-33.
Bogovic P., Strle F. 2015. Tick-borne encephalitis: A review of epidemiology, clinical
characteristics, and management. World J. Clin. Cases. 3(5): 430-41.
Borowski P., Lang M., Niebuhr A., Haag A. Schmitz H., Schulze zur Wiesch J., Choe J.,
Siwecka M. A., Kulikowski T. 2001. Inhibition of the helicase activity of H C V
NTPase/helicase by 1 -beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3 -carboxamide-5" triphosphate
(ribavirin-TP). Acta. Biochim. Pol. 48: 739-744.
Butcher S.J., Grimes J.M., Makeyev E.V., Bamford D.H., Stuart D.I. 2001 A mechanism
for initiating RNA-dependent RNA polymerization. Nature 410, 235-240.
Carroll S. S., Tomassini J. E., Bosserman M., Getty K., Stahlhut M. W., Eldrup A. B.,
Bhat B., Hall, D., Simcoe A. L., LaFemina R., Rutkowski C. A., Wolanski B., Yang
Z., Migliaccio G., De Francesco R., Kuo L. C , MacCoss M., Olsen D. B. 2003
Inhibition of hepatitis C virus RNA replication by 2'-modified nucleoside analogs. The
J. Biol. Chem. 278(14): 11979-11984.
Cerutti H., Casas-Mollano J.A. 2006. On the origin and functions of RNA-mediated
silencing: from protiststo man. Curr. Genet. 50: 81-99.
Chambers T.J., Hahn Ch.S., Galler R., Rice Ch.M. 1990. Flavivirus genome organization,
Annu. Rev. Microbiol. 44: 649-88.
62
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Chen M.S., Suttmann R.T., Wu J.C., Prisbe E.J. 1992. Metabolism of 4'-azidothymidine.
A compound with potent and selective activity against the human im- munodeficiency
vims. J. Biol. Chem. 267: 257-260.
Chen H., Liu L., Jones S.A., Banavali N., Kass J., Li Z., Zhang J., Kramer L.D., Ghosh
A.K., Li H. 2013. Selective inhibition of the West Nile vims methyltransferase by
nucleoside analogs. Antiviral. Res. 97: 232-239.
Chen Y.L., Abdul Ghafar N., Karuna R., Fu Y., Lim S.P., Schul W., Gu F., Herve M.,
Yokohama F., Wang G., Cerny D., Fink K., Blasco F., Shi P.Y. 2014 Activation of
Peripheral Blood Mononuclear Cells by Dengue Vims Infection Depotentiates
Balapiravir. J. Virol. 88(3): 1740-1747.
Chotiyaputta W., Hongthanakorn C,. Oberhelman K., Fontána R.J., Licari T., Lok A.S.
2012. Adherence to nucleos(t)ide analogues for chronic hepatitis B in clinical practice
and correlation with virological breakthroughs. J. Viral. Hepat. 19(3): 205-212.
Croteau G. Doyon L., Thibeault D., McKercher G., Pilote L., Lamarre D. 1997. Impaired
Fitness of Human Immunodeficiency Vims Type 1 Variants with High-Level
Resistance to Protease Inhibitors. J. Virol. 71: 1089-96.
Crotty S., Maag D., Arnold J. J., Zhong W., Lau J.N., Hong Z., Andino R., Cameron
C.E. 2000. The broad-spectmm antiviral ribonucleoside ribavirin is an RNA vims
mutagen. Nat. Med. 6(12): 1375-1379.
De Clercq E. 2005. Recent highlights in the development of new antiviral dmgs. Curr. Opin.
Microbiol. 8: 552-560.
De Clercq E., Neyts J. 2009. Antiviral agents acting as D N A or R N A chain terminators.
Handb. Exp. Pharmacol. 189: 53-84.
De Clercq E. 2016. C-nucleosides to be revisited. J. Med. Chem. 59: 2301-2311.
De Luca A. (2006) The Impact of Resistance on Viral Fitness and Its Clinical Implications.
In: A . M . Geretti (ed.) Antiretroviral Resistance in Clinical Practice. London:
Mediscript, [cit. 9. dubna 2022]. <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2244/>
Deval J., Symons J.A., Beigelman L. 2014. Inhibition of viral RNA polymerases by
nucleoside and nucleotide analogs: therapeutic applications against positive- strand
RNA vimses beyond hepatitis C vims. Curr. Opin. Virol. 9: 1-7.
Dumpis IT., Crook D., Oksi J. 1999. Tick-borne encephalitis. Clin. Infect. Dis. 28: 882-90.
63
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Dutartre H., Bussetta C , Boretto J., Canard B. 2006. General catalytic deficiency of
hepatitis C virus R N A polymerase with an S28T mutation and mutually exclusive
resistance towards 2'-modified nucleotide analogues. Antimicrob. Agents Chemother.
50:4161-4169.
Eldrup A.B., Allerson C.R., Bennett C.F., Bera S., Bhat B., Bhat N., Bosserman M.R.,
Brooks J., Burlein C , Carroll S.S., Cook P.D., Getty K.L., MacCoss M.,
McMasters D.R., Olsen D.B., Prakash T.P., Prhavc M., Song Q.L., Tomassini J.E.,
Xia J. 2004. Structure-activity relationship of purine ribonucleosides for inhibition of
hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase. J. Med. Chem. 47: 2283-2295.
Eyer L., Nencka R., Huvarová I., Palus M., Joao Alves M., Gould E.A., De Clercq E.,
Růžek D. 2016a. Nucleoside inhibitors of Zika virus. J. Infect. Dis. 214: 707-711.
Eyer L., Šmídková M., Nencka R., Neča J., Kastl T., Paulus M., De Clercq E., Růžek D.
2016b. Structure-activity relationships of nucleoside analogues of tick-borne
encephalitis virus. Antivir. Res. 133: 119-129.
Eyer L., Kondo H., Zouharova D., Hirano M., Valdes J.J., Muto M., Kastl T., Kobayashi
S., Haviernik J., Igarashi M., Kariwa H., Vaculovicova M., Cerny J., Kizek R.,
Kroger A., Lienenklaus S., Dej mek M., Nencka R., Palus M., Salat J., De Clercq
E., Yoshii K , Ruzek D. 2017. Escape of tick-borne flavivirus from 2'-C-methylated
nucleoside antivirals is mediated by a single conservative mutation in NS5 that has a
dramatic effect on viral fitness. J. Virol. 91: 1-20.
Eyer L., Nencka R., De Clercq E., Seley-Radtke K , Růžek D. 2018. Nucleoside analogs as
a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antivir.
Chem. Chemother. 26: 1-28.
Eyer L., Nougairěde A., Uhlířová M., Driouich J.S., Zouharová D, Valdés JJ, Haviernik
J, Gould EA, De Clercq E, de Lamballerie X, Ruzek D 2019 An E460D
Substitution in the NS5 Protein of Tick-Borne Encephalitis Virus Confers Resistance to
the Inhibitor Galidesivir (BCX4430) and Also Attenuates the Virus for Mice. J. Virol.
93(16): e00367-19. doi: 10.1128/JVI.00367-19.
Frost S. D., McLean A.R. 1994. Quasispecies dynamics and the emergence of drug
resistance during zidovudine therapy of HIV infection. AIDS. 8(3): 323-332.
64
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Fiizik T., Formanova P., Růžek D., Yoshii K., Niedrig M., Plevka P. 2018 Structure of
tick-borne encephalitis virus and its neutralization by a monoclonal antibody. Nat.
Commun. 9 (1): 436, doi: 10.1038/s41467-018-02882-0.
Gong P., Peersen O.B. 2010. Structural basis for active site closure by the poliovirus RNAdependent
R N A polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 22505-22510,
doi: 10.1073/pnas. 1007626107.
Gotte M. 2012. The Distinct Contributions of Fitness and Genetic Barrier to the Development
of Antiviral Drug Resistance. Curr. Opin. Virol. 2(5): 644-650.
Gritsenko D., Hughes G. 2015. Ledipasvir/Sofosbuvir (harvoni): improving options for
hepatitis C virus infection. P.T. 40(4): 256-276.
Gritsun T.S., Frolova T.V., Zhankov A.L Armesto M., Turner S.L., Frolova M.P.,
Podina V.V., Lashkevich V.A., Gould E.A. 2003a. Characterization of a Siberian virus
isolated from a patient with progressive chronic tick-borne encephalitis. J. Virol. 77(1):
25-36.
Gritsun T. S., Lashkevich V. A., Gould E. A. 2003b. Tick-borne encephalitis. Antivir. Res.
57 (1): 129-146.
Haglund M., Gunther G. 2003 Tick-borne encephalitis-pathogenesis, clinical course and
long-term follow-up. Vaccine. 21(Suppl. 1): 11-18.
Han H.K., Amidon G.L. 2000. Targeted prodrug design to optimize drug delivery. AAPS
PharmSci. 2:48-58.
Harrigan P.R., Sheen C.W., Gill V.S. Harrigan P.R., Sheen C.W., Gill V.S., Wynhoven
B., Hudson E., Lima V.D., Lecocq P., Aguirre R., Poon A.F., Sluis-Cremer N. 2008.
Silent mutations are selected in HIV-1 reverse transcriptase and affect enzymatic
efficiency. AIDS. 22(18): 2501-2508.
Jordheim L. P., Durantel D., Zoulim F., Dumontet Ch. 2013. Advances in the
development of nucleoside and nucleotide analogues for cancer and viral diseases. Nat.
Rev. Drug Discov. 12: 447-464.
Khudyakov Y. 2010. Coevolution and HBV Drug Resistance. Antivir. Ther. 15: 505-15.
Klumpp K., Lévéque V., Le Pogam S., Ma H., Jiang W.R., Kang H., Granycome C ,
Singer M., Laxton C , Hang J.Q., Sarma K., Smith D.B., Heindl D., Hobbs C.J.,
Merrett J.H., Symons J., Cammack N., Martin J.A., Devos R., Nájera I. 2006. The
65
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
novel nucleoside analog R1479 (4'-azidocytidine) is a potent inhibitor of NS5Bdependent
RNA synthesis and hepatitis C virus replication in cell culture. J. Biol. Chem.
281: 3793-3799.
Klumpp K , Kalayanov G., Ma H., Le Pogam S., Leveque V., Jiang W.R., Inocencio N.,
De Witte A., Rajyaguru S., Tai E., Chanda S., Irwin M.R., Sund C , Winqist A.,
Maltseva T., Eriksson S., Usova E., Smith M., Alker A., Najera I., Cammack N.,
Martin J.A., Johansson N.G., Smith D.B. 2008. 2'-Deoxy-4'- azido nucleoside
analogs are highly potent inhibitors of hepatitis C virus replication despite the lack of
2'-alpha-hydroxyl groups. J. Biol. Chem. 283: 2167-2175.
Klumpp K , Smith D.B. 2011. Discovery and Clinical Evaluation of the Nucleoside Analog
Balapiravir (R1626) for the Treatment of H C V Infection. In: Kazmierski W.M.
Antiviral Drugs: from basic discovery through clinical trials. New York: John Wiley.
287-304.
Koonin E.V., Dolja V.V. 1993. Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses—
implications of comparative analysis of amino acid sequences. Crit. Rev. Biochem.
Mol. Biol. 28:3 75-430.
Kozuch O., Mayer V. 1975. Pig kidney epithelial (PS) cells - perfect tool for study of
Flaviviruses and some other arboviruses. Acta. Virol. 19: 498.
Latour D.R., Jekle A., Javanbakht H., Henningsen R., Gee P., Lee I., Tran P., Ren S.,
Kutach A.K, Harris S.F., Wang S.M., Lok S.J., Shaw D., Li J., Heilek G., Klumpp
K , Swinney D.C., Deval J. 2010. Biochemical characterization of the inhibition of the
dengue virus R N A polymerase by beta-d-2'-ethynyl-7-deaza-adenosine
triphosphate. Antiviral Res. 87: 213-222.
Lim S.P., Sonntag L.S., Noble C., Nilar S.H., Ng R.H., Zou G., Monaghan P., Chung
KY., Dong H., Liu B., Bodenreider C , Lee G., Ding M., Chan W.L., Wang G.,
Jian Y.L., Chao A. T., Lescar J., Yin Z., Vedananda T.R., Keller T.H., Shi P.Y.
2010. Small molecule inhibitors that selectively block dengue virus methyltransferase.
J. Med. Chem. 286(8): 6233- 6240.
Lindquist L., Vapalahti O. 2008. Tick-borne encephalitis. Lancet. 371: 1861-71.
Liu M.C., Luo M.Z., Mozdziesz D.E., Lin T.S., Dutschman G.E., Gullen E.A., Cheng
Y.C., Sartorelli A.C. 2001. Synthesis of halogen-substituted 3-deazaadenosine and 3-
66
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
deazaguanosine analogues as potential antitumor/antiviral agents. Nucleos Nucleot
Nucleic Acids. 20(12): 1975-2000.
Luňáčková J., Chmelík V., Šípová L, Žampachová E., Bečvářova J. 2003.
Epidemiological monitoring of tick-borne encephalitis in Rimov in Southern Bohemia.
Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 52: 25-58.
Maag FL, Rydzewski R.M., McRoberts M.J., Crawford-Ruth D., Verheyden J.P., Prisbe
E.J. 1992. Synthesis and anti-HIV activity of 4'-azido- and 4'-methoxynucleosides. J.
Med. Chem. 35: 1440-1451.
Malet FL, Masse N., Selisko B., Romette J. L., Alvarez K., Guillemot J. C , Tolou FL, Yap
T. L., Vasudevan S., Lescar J., Canard B. 2008. The flavivirus polymerase as a target
for drug discovery. Antivir. Res. 80: 23-35.
Mandl C. W., Heinz F. X., Stock! E., Kunz C. 1989. Genome sequence of tick-borne
encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins
with other flaviviruses. Virology. 173: 291-301.
Mansfield ICL., Johnson N., Phipps L.P., Stephenson J.R., Fooks A.R., Solomon T. 2009.
Tick-borne encephalitis virus: a review of an emerging zoonosis. J. Gen. Virol. 90 (8):
1781-1794.
Martens P. 1999. Climate change impacts on vector-borne disease transmission in Europe.
In: Climate change and human health (ed. Haines A., McMichael A.J.) London: The
Royal Society. 45-54.
McCarty R.M., Bandarian V. 2008. Deciphering deazapurine biosynthesis: pathway for
pyrrolopyrimidine nucleosides toyocamycin and sangivamycin. Chem. Biol. 15(8): 790-
798.
Migliaccio G., Tomassini J.E., Caroll S.S., Tomei L., Altamura S., Bhat B., Bartholomew
L., Bosserman M.R., Ceccacci A., Colwell L.F., Cortese R., De Francesco R.,
Eldrup A.B., Getty K L . , Hou X.S., LaFemina R.L., Ludmerer S.W., MacCoss M.,
McMasters D.R., Stahlhut M.W., Olsen D.B., Hazuda D.J., Flores O.A. 2003
Characterization of resistance to non-obligate chain-terminating ribonucleoside analogs
that inhibit hepatitis C virus replication in vitro. J. Biol. Chem. 278: 49164-49170.
Olsen D.B., Eldrup A.B., Bartholomew L., Bhat B., Bosserman M.R., Ceccacci A.,
Colwell L.F., Fay J.F., Flores O.A., Getty K.L., Grobler J.A., LaFemina R.L.,
Markel E.J., Migliaccio G., Prhavc M., Stahlhut M.W., Tomassini J.E., MacCoss
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
M., Hazuda D.J., Carroll S. S. 2004. A 7-deaza-adenosine analog is a potent and
selective inhibitor of hepatitis C virus replication with excellent pharmacokinetic
properties. Antimicrob. Agents Chemother. 48(10): 3944-3953.
Picarazzi F., Vicenti L, Saladini F., Zazzi M., Mori M 2020 Targeting the RdRp of
Emerging RNA Viruses: The Structure-Based Drug Design
Challenge. Molecules. 25(23): 5695. doi: 10.3390/molecules25235695.
Pockros P.J., Nelson D., Godofsky E., Rodriguez-Torres M., Everson G.T., Fried M.W.,
Ghalib R., Harrison S., Nyberg L., Shiffman M.L., Najera I., Chan A., Hill G
2008. R1626 plus peginterferon Alfa-2a provides potent suppression of hepatitis C virus
RNA and significant antiviral synergy in combination with ribavirin. Hepatology. 48:
385-397.
Pulkkinen L., Butcher S. J., Anastasina M. 2018. Tick-Borne Encephalitis Virus: A
Structural View. Viruses. 10(7): 350.
Richman D.D. 2000. The impact of drug resistence on the effectiveness of chemotherapy for
chronic hepatitis B. Hepatology. 32: 866-867.
Růžek D., Gritsun T.S., Forrester N.L., Gould E.A., Kopecký J., Golovchenko M.,
Rudenko N., Grubhoffer L. 2008. Mutations in the NS2B and NS3 genes affect mouse
neuroinvasiveness of a Western European field strain of tick-borne encephalitis virus.
Virology. 374: 249-255.
Růžek D. 2005. Genetická variabilita viru klíšťové encefalitidy. Magisterská diplomová
práce. Biologická fakulta Jihočeské Univerzity v Českých Budějovicích. Vedoucí práce:
Libor Grubhoffer.
Růžek D., Avšič Župane T., Borde J., Chrdle A. Eyer L., Karganova G., Kholodilov I.,
Knap N., Kozlovskaya L., Matveev A. 2019. Tick-borne encephalitis in Europe and
Russia: Review of pathogenesis, clinical features, therapy, and vaccines. Antivir. Res.
164: 23-51.
Seley-Radtke K. L., Yates M. K. 2018. The evolution of nucleoside analogue antivirals: A
review for chemists and non-chemists. Part 1: Early structural modifications to the
nucleoside scaffold. Antiviral Res. 154:66-86.
Shafer R.W., Vuitton D.A. 1999. Highly active antiretroviral therapy (HAART) for the
treatment of infection with human immunodeficiency virus type 1. Biomed.
Pharmacother. 53(2): 73-86.
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Simmonds P. 2004. Genetic Diversity and Evolution of Hepatitis C Virus - 15 Years on. J.
Gen. Virol. 85: 3173-88.
Smith D.B., Martin J.A., Klumpp K., Baker S.J., Blomgren P.A., Devos R., Granycome
C., Hang J., Hobbs C.J., Jiang W.R., Laxton C., Le Pogam S., Leveque V., Ma H.,
Maile G., Merrett J.H., Pichota A., Sarma K., Smith M., Swallow S., Symons J.,
Vesey D., Najera I., Cammack N. 2007. Design, synthesis, and antiviral properties of
4'-substituted ribonucleosides as inhibitors of hepatitis C virus replication: the
discovery R1479. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17(9): 2570-2576.
Steffen R. 2016. Epidemiology of tick-borne encephalitis (TBE) in international travellers to
Western/Central Europe and conclusions on vaccination recommendations. J. Trav.
Med. 23 (4): 1-10.
Studahl M., Lindquist L., Eriksson B., Günther G., Bengner M., Franzen-Röhl E.,
Fohlman J., Bergström T., Aurelius E. 2013. Acute viral infections of the central
nervous system in immunocompetent adults: diagnosis and management. Drugs. 73(2):
131-158.
Süss J. 2003. Epidemiology and ecology of TBE relevant to the production of effective
vaccines Vaccine 21 (Suppl. 1): 19-35.
Süss J. 2008. Tick-borne encephalitis in Europe and beyond: the epidemiological situation as
of 2007. Euro Survei. 13 (26): 189116. doi: 10.2807/ese. 13.26.18916-en.
Tanaka M. M., Valckenborgh F. 2011. Escaping an Evolutionary Lobster Trap: Drug
Resistance and Compensatory Mutation in a Fluctuating Environment. Evolution. 65(5):
1376-1387.
Vechtova P., Fussy Z., Cegan R, Sterba J., Erhart J., Benes V., Grubhoffer L 2020
Catalogue of stage-specific transcripts in Ixodes ricinus and their potential functions
during the tick life-cycle. Parasites & vectors, 13(1): 1-19.
Wang M., Ng K.K., Cherney M.M., Chan L., Yannopoulos CG., Bedard J., Morin N.,
Nguyen-Ba N., Alaoui-Ismaili M.H., Bethell R.C., James M.N. 2003 Nonnucleoside
analogue inhibitors bind to an allosteric site on H C V NS5B polymerase.
Crystal structures and mechanism of inhibition. J. Biol. Chem. 278(11): 9489-9495.
Wu J., Liu W., Gong P. 2015. A Structural Overview of RNA-Dependent RNA Polymerases
from the Flaviviridae Family. Int. J. Mol. Sei. 16(6): 12943-12957.
69
MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERIZACE ANTIVIROVÉHO ÚČINKU INHIBITORŮ VIRU KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY
Xu H.T., Colby-Germinario S.P., Hassounah S., Quashie P. K , Han Y., Oliveira M.,
Stranix B. R., Wainberg M. A. 2015. Identification of a pyridoxine-derived smallmolecule
inhibitor targeting dengue virus RNA-dependent R N A
polymerase. Antimicrob. Agents Chemother. 60: 600-8.
Yamamoto J., Takahata C , Kuraoka I., Hirota K , Iwai S. 2016. Chemical Incorporation
of Chain-Terminating Nucleoside Analogs as 3'-Blocking D N A Damage and Their
Removal by Human ERCC1-XPF Endonuclease. Molecules. 21(6): 766.
Yang H. J., Lee J. H., Kim Y. J., Yoon J. H., Lee H. S. 2012. Antiviral efficacy of
combination therapy with entecavir and adefovir for entecavir/lamivudine-resistant
hepatitis B virus with or without adefovir resistance. J. Med. Virol. 84(3): 424-430.
Yin Z., Chen Y.L., Schul W., Wang Q.Y., Gu F., Duraiswamy J., Kondreddi R.R.,
Niyomrattanakit P., Lakshminarayana S.B., Goh A., Xu H.Y., Liu W., Liu B., Lim
J.Y., Ng C.Y., Qing M., Lim C.C., Yip A., Wang G., Chan W.L., Tan H.P., Lin K ,
Zhang B., Zou G., Bernard K.A., Garrett C , Beltz K , Dong M., Weaver M., He
H., Pichota A., Dartois V., Keller T.H., Shi P.Y. 2009. An adenosine nucleoside
inhibitor of dengue virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106: 20435-20439.
Zajac Z., Bartosik K , Kulisz J., Wozniak A. 2022. Incidence of Tick-Borne Encephalitis
during the COVID-19 Pandemic in Selected European Countries. J Clin Med. 11(3):
803.
Zavadska D., Anca I., Andre F., Bakir M., Chlibek R., Cizman M., Ivaskeviciene I.,
Mangarov A., Meszner Z., Pokorn M., Prymula R., Richter D., Salman N.,
Simurka P., Tamm E., Tesovic G., Urbancikova I., Usonis V. 2013.
Recommendations for tick-bome encephalitis vaccination from the Central European
Vaccination Awareness Group (CEVAG). Hum. Vaccin. Immunother. 9:362-374.
Zhang Y., Zhang H., Zhang J., Zhang J., Guo H. 2019. Naturally occurring core protein
mutations compensate for the reduced replication fitness of a lamivudine-resistant HBV
isolate. Antivir. Res. 165: 47-54.
Zmurko J., Marques R.E., Schols D., Verbeken E., Kaptein S.J., Neyts J. 2016. The viral
polymerase inhibitor 7-deaza-2'-C-methyladenosine is a potent inhibitor of in vitro Zika
virus replication and delays disease progression in a robust mouse infection model.
PLoSNegl. Trop. Dis. 10:e0004695. doi: 10.1371/journal.pntd.0004695.
70