Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Využití DNA analýzy pro detekci M. tuberculosis u kosterních pozůstatků Bakalářská práce Vypracovala: Simona Hušková Vedoucí práce: RNDr. Miriam Nývltová - Fišáková, Ph.D. Brno, 2011 2 Prohlášení Prohlašuji, že tato bakalářská práce na téma: Využití DNA analýzy pro detekci M. tuberculosis u kosterních pozůstatků je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Všechny zdroje, prameny a literaturu, ze které jsem čerpala v práci, řádně cituji s uvedením úplného odkazu na příslušný zdroj. Souhlasím se zveřejněním své práce podle zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. 3 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí své bakalářské práce paní RNDr. Miriam Nývltové Fišákové, Ph.D. za odborné vedení. Poděkování patří také paní RNDr. Michaele Račanské, Ph.D. za připomínky a cenné rady poskytnuté při vypracování této práce, panu doc. RNDr. Omarovi Šerému, Ph.D. a Mgr. Lukášovi Častulíkovi za odbornou pomoc při vypracování praktické části bakalářské práce. Dále bych ráda poděkovala Mgr. Pavlovi Mazurovi, Ph.D. za umožnění provedení analýz. Za poskytnutí kosterního materiálu k odběrům děkuji MUDr. Lence Vargové, Ph.D., doc. RNDr. Ladislavě Horáčkové, Ph.D. a Mgr. Kateřině Konášové. V neposlední řadě děkuji také Mgr. Ing. Lubomírovi Prokešovi za poskytnutí zdrojů informací a naměření hmotnostních spekter. 4 Abstrakt Tuberkulóza, jako jedna z nejobávanějších chorob lidstva, se v posledních letech opět dostává do popředí zájmu lékařů, a to vzhledem ke vzniku multirezistentních kmenů Mycobacterium tuberculosis odolávajících známým antibiotikům. Z tohoto důvodu jsou velmi žádané výzkumy zaměřené na studium projevů tuberkulózy na kosterních pozůstatcích dávných populací. Největším problémem při klasické paleopatologické diagnóze tuberkulózy u kosterních pozůstatků je, že může být snadno zaměněna za jiné nemoci s podobnými patologickými projevy, jako je brucelóza, revmatické nemoci, maligní tumor, osteomyelitida, osteoporóza či sarkoidóza. Teprve až aplikace molekulárně genetických metod, především metody polymerázové řetězové reakce (PCR), umožňuje spolehlivě potvrdit přítomnost patogenu v kosterních pozůstatcích a navíc umožňuje průkaz patogenu v kostech bez známek tuberkulózy kostí. Klíčová slova Mycobacterium tuberculosis, tuberkulóza, tuberkulóza kostí, TBC, PCR, RT-PCR, DNA, aDNA Abstract Tuberculosis, as one of the most feared diseases of a mankind, is gaining interest of physicians once again in recent years, due to the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis resistant to known antibiotics. For this reason researches focused on the study of manifestations of tuberculosis on the skeletal remains of ancient populations are in high demand. The biggest problem in classical paleopathological diagnosis of tuberculosis of the skeletal remains is that it can be easily mistaken for other diseases with similar pathological changes, such as brucellosis, rheumatic diseases, malignant tumor, osteomyelitis, osteoporosis, or sarcoidosis. Recently the application of molecular genetic techniques, particularly polymerase chain reaction (PCR), allowed to reliably confirm the presence of the pathogen in the skeletal remains and also made possible to proof the presence of pathogen in bones without any signs of bone tuberculosis. Key words Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, tuberculosis of bones, TB, PCR, RT-PCR, DNA, aDNA 5 Obsah 1. Úvod..............................................................................................................................7 2. Cíle práce ......................................................................................................................7 3. Teoretická část ..............................................................................................................8 3.1. Charakteristika rodu Mycobacterium....................................................................8 3.2 Nemoci způsobené rodem Mycobacterium............................................................9 3.3 Mycobacterium tuberculosis complex a jeho původ............................................10 3.4 Tuberkulóza ........................................................................................................12 3.4.1 Historie tuberkulózy ...................................................................................13 3.4.2 Imunitní reakce provázející infekci M. tuberculosis complex .....................15 3.4.3 Tuberkulóza pohybového aparátu................................................................17 3.5.1.5. Metody molekulární genetiky používané pro identifikaci M. tuberculosis complex................................................................................................19 3.6 Polymerázová řetězová reakce.............................................................................21 3.6.1 Princip PCR .................................................................................................21 3.6.2 Faktory ovlivňující účinnost reakce PCR....................................................22 3.6.2.1. Výběr cílové sekvence........................................................................22 3.6.2.2. Návrh primerů......................................................................................22 3.6.2.3. Extrakce aDNA...................................................................................23 3.6.2.4. Složení reakční směsi..........................................................................23 3.6.2.5. Způsob detekce ...................................................................................23 3.6.2.6. Způsob kontroly a interpretace výsledků............................................24 3.6.3 Výhody a nevýhody PCR ...........................................................................24 3.6.4 Real-Time PCR...........................................................................................24 3.6.5.1 Přístrojové vybavení pro Real-Time PCR ..........................................27 3.6.5.2 Fáze RT-PCR amplifikace a kvantitativní analýza.............................27 3.6.6 EliGene© MTB RT kit ...............................................................................28 4. Praktická část ..............................................................................................................30 4.1 Materiál................................................................................................................30 4.2 Metodika odběru vzorku......................................................................................32 4.3 Ochranná opatření proti kontaminaci cizorodou DNA........................................32 4.4 Izolace a analýza DNA Mycobacterium tuberculosis..........................................33 4.4.1 Příprava vzorků pro DNA analýzu ..............................................................33 6 4.4.2 Fenol-chloroformová extrakce DNA...........................................................33 4.4.3 Analýza Real-Time PCR a přečištění vzorků..............................................34 4.5 Důkaz fenolu........................................................................................................37 5. Diskuze .......................................................................................................................40 6. Závěr ...........................................................................................................................43 7. Literatura.....................................................................................................................44 8. Použité přístroje, kity a chemikálie.............................................................................51 9. Seznam důležitých pojmů...........................................................................................52 10. Seznam zkratek...........................................................................................................54 11. Příloha..........................................................................................................................55 7 1. Úvod Tuberkulóza (TBC) provází lidstvo již od nepaměti. Jedná se o vážné infekční onemocnění způsobené skupinou bakterií Mycobacterium tuberculosis complex (M. tubeculosis complex). Toto onemocnění postihuje především plíce, existují však i formy mimoplicní, které mimo jiné napadají kosti. Právě tuberkulóza kostí slouží ke sledování stop TBC v minulosti, a to z toho důvodu, že kosti či zuby často představují v našich zeměpisných podmínkách jediný dochovaný biologický materiál z archeologických nalezišť. V minulosti se paleopatologický průzkum prováděl především pomocí makroskopického a rentgenologického pozorování patologických změn na kostech. Vzhledem k tomu, že tuberkulóza kostí představuje pouhý zlomek z celkového počtu nakažení (3-5 %), neposkytoval tento vizuální průzkum pravdivý obraz o celkovém počtu onemocnění v dobách minulých. Teprve až aplikace molekulárně genetických metod, především polymerázové řetězové reakce (PCR), umožnila potvrdit či vyvrátit přítomnost patogenu a navíc umožnila průkaz přítomnosti bakterie i u pozůstatků bez známek tuberkulózy kostí. 2. Cíle práce Cíle práce jsou: 1) Provést literární rešerši problematiky daného tématu. 2) Praktická aplikace postupů molekulárně genetických metod, konkrétně aplikace Real-Time PCR, na kosterním materiálu, s cílem prokázat přítomnost patogenu M. tuberculosis v kostech, u kterých se na základě paleopatologické analýzy předpokládalo, že tento patogen obsahují. 8 3. Teoretická část 3.1. Charakteristika rodu Mycobacterium Rod Mycobacterium je řazen do čeledi Mycobacteriaceae, řádu Actinomycetales a kmenu Actinobacteria. Jedná se o rod nepohyblivých a nesporulujících bakterií tyčinkovitého tvaru o délce 1-4 µm a šířce 0,3-0,6 µm. Často tvoří shluky o různé velikosti. Ve vztahu ke kyslíku jsou mykobakterie obligátně aerobní. Některé druhy bakterií rodu Mycobacterium je velmi těžké kultivovat. Mnoho z nich má velmi dlouhý buněčný cyklus. Například jeden buněčný cyklus Mycobacterium leprae může trvat i déle než 20 dní (Vasanthakumari, 2007). Pomalý růst je způsoben jedinečnou strukturou mykobakteriální buněčné stěny, která je velmi hydrofobní, což omezuje její permeabilitu pro živiny z extracelulárního prostředí nutných k růstu (Ryan et al., 2010). Bakterie rodu Mycobacterium jsou řazeny mezi slabě grampozitivní tzv. acidorezistentní bakterie. Jejich buněčná stěna je díky vyššímu obsahu vosků obtížně barvitelná Grammovou metodou. K barvení musí být použity speciální podmínky (teplo, penetrační činidla). Pokud je však bakteriální stěna již jednou obarvena, je nemožné ji odbarvit ani pomocí nejsilnějších dekolorizačních činidel (kyselina či alkohol) (Ryan et al., 2010). Vzhledem k obtížnému barvení dle Gramma se v praxi častěji používá barvení metodou dle Ziehl-Neelsena pomocí barviva karbolfuchsinu (Vasanthakumari, 2007). Všechny bakterie rodu Mycobacterium mají charakteristickou stavbu buněčné stěny, která je hydrofobní s vysokým obsahem vosků bohatých na mykolové kyseliny, podle kterých je celý rod pojmenován. Buněčná stěna (obr. č. 1) rodu Mycobacterium se skládá z hydrofobní vrstvy mykolových kyselin a vrstvy peptidoglykanu. Obě tyto vrstvy jsou drženy pohromadě pomocí polysacharidu arabinogalaktanu a dohromady tak tvoří tzv. mykolyl – arabinogalaktan - peptidoglykanový komplex (MAPc). Právě struktura buněčné stěny (vysoký obsah lipidů) a vyšší obsah párů guanin (G) - cytosin (C) v DNA mykobakterií je příčinou zvýšené odolnosti těchto bakterií vůči nepříznivým vlivům vnějšího prostředí (Hershkowitz et al., 2008). 9 Obr. č. 1: Schéma struktury mykobakteriální buněčné stěny (Upraveno podle: Röse, 2004). Dělení rodu Mycobacterium je založeno na způsobu jejich výživy. Většina mykobakterií žije jako nepatogenní saprofyté v půdě či ve vodě (M. smegmatis, M. phlei). Některé druhy patří mezí oportunní patogeny člověka, které nejsou nebezpečné pro zdravé jedince (M. avium, M. kansasii, M. intracellulae). U lidí se sníženou imunitou (např. v důsledku onemocnění AIDS) však mohou vyvolat nemoc s příznaky podobnými tuberkulóze (horečka, únava, úbytek váhy, anémii) (Hettick et al., 2006). Další skupinu tvoří obligátní patogeny člověka: M. tuberculosis způsobující tuberkulózu, M. leprae způsobující malomocenství, M. bovis působící tuberkulózu krčních uzlin a M. africanum způsobující v tropických oblastech plicní chorobu (McClatchey, 2002). 3.2 Nemoci způsobené rodem Mycobacterium Rod Mycobacterium zahrnuje velký počet druhů bakterií patogenních pro člověka i pro zvířata. Některé druhy jako například M. tuberculosis se vyskytují pouze u člověka. Jiné druhy například M. intracellulare mohou nakazit jak člověka, tak zvířectvo a objevují se i volně v prostředí. Nemoci způsobené mykobakteriemi mají většinou pomalý průběh a jsou následovány chronickou fází, která může trvat i desítky let. Infekčnost patogenních druhů mykobakterií je vysoká, avšak virulence pro zdravého člověka je nízká. Nemoc se 10 tedy po infekci patogenem vyvine jen u malého procenta nakažené populace (Ryan et al., 2010). Mezi nejvíce devastující onemocnění způsobené bakteriemi z rodu Mycobacterium patří onemocnění tuberkulózou a leprou. Chaussinand a jeho kolegové (Chaussinand et al., 1953) vypozorovali určitý inverzní vztah mezi pravděpodobností nakažení tuberkulózou a leprou. Nakažení člověka tuberkulózou poskytuje určitou ochranu před nakažením leprou, což mohlo být důvodem praktického vymizení onemocnění leprou v západní Evropě. Tato křížová imunita byla pravděpodobně způsobena soutěživostí mezi druhy bakterií patřících do společného rodu (Chaussinand, 1953). Mykobakterie neprodukují klasické exotoxiny či endotoxiny. Za faktor patogenity je považován tzv. cord factor, což je povrchový glykolipid 6,6'-dimykolát trehalosy obsažený v buněčné stěně těchto bakterií. Cord factor inhibuje sukcinátdehydrogenázu, která katalyzuje přeměnu sukcinátu na fumarát v citrátovém a dýchacím řetězci (Kato, 2004). 3.3 Mycobacterium tuberculosis complex a jeho původ Jeden z původců tuberkulózy, M. tuberculosis, byl objeven roku 1882 Robertem Kochem a dodnes se proto nazývá bacilem Kochovým. Tuberkulóza může být způsobena geneticky velmi příbuznými bakteriemi patřícími do skupiny Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). Tato skupina zahrnuje druhy M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti a M. canetti (Minnikin et al., 2010). Bakterie ze skupiny MTC patří mezi intracelulární patogeny, které mají schopnost vyhnout se smrtícím účinkům profesionálních fagocytů (Ryan et al., 2010). Bakterie MTC jsou velmi odolné vůči vysušení, což jim umožňuje přežít i v nepříznivých podmínkách. Jako u jiných mykobakterií má buněčná stěna bakterií ze skupiny MTC vyšší obsah mykolových kyselin. Antigeny na povrchu buněčné stěny mykobakterií obsahují bílkoviny a polysacharidy, z nichž nejvýznamnější je tuberkulin (Ryan et al., 2010). Purifikovaný tuberkulin je používán pro kožní test zvaný tuberkulínová reakce, který slouží pro laboratorní diagnostiku tuberkulózy v aktivním stavu. Vyhodnocení se provádí 72 hodin po injekční aplikaci tuberkulinu na základě určení velikosti indurance vzniklé kolem místa vpichu (Pokorný et al., 1998). Otázka evoluce bakterií patřících do skupiny Mycobacterium tuberculosis complex (obr. č. 2) zůstávala až do nedávné doby předmětem dohadů. Světlo do této problematiky přineslo až objasnění genomu M. tuberculosis (Cole, 2002) roku 1998 a následně 11 dokončení genomů dalších mykobakterií: M. bovis (Garnier et al., 2003) a M. leprae (Vissa et al., 2001). Donedávna se předpokládalo, že tuberkulóza se na člověka přenesla po domestikaci zvířat, především skotu a koz, prostřednictvím M. bovis a tudíž, že M. bovis je evolučně starší (Cockburn, 1963). To je však v rozporu s poznatky získanými pomocí srovnávací studie DNA sekvencí různých patogenních mykobakterií (Brosch et al., 2002). Srovnávací analýza polymorfismů přítomných u jednotlivých druhů mykobakterií naznačuje, že se kmen mykobakterií napadající člověka, M. tuberculosis, vyvinul ze společného předka všech mykobakterií způsobujících tuberkulózu (Behr et al., 1999). Brosch a kolegové (Brosch et al., 2002) dále předpokládají, že ke vzniku M. tuberculosis a M. bovis došlo ještě před počátkem zemědělství a domestikace. Na základě srovnávací analýzy genomů mykobakterií však nemůžeme usuzovat, kdy přesně došlo k vývoji dalších patogenních kmenů ze společného předchůdce. Tuto otázku můžeme zodpovědět jedině přímou molekulární analýzou různě starých lidských pozůstatků. Molekulární analýza nám navíc také může poskytnout informace o tom, jak časté bylo onemocnění tuberkulózou v minulosti (Nehrlich et al., 2009). Obr. č. 2: Schéma pravděpodobného evolučního vývoje M. tuberculosis complex znázorňující postupnou ztrátu úseků DNA (šedé rámečky). Upraveno podle: Brosch, (2002) 12 3.4 Tuberkulóza Tuberkulóza je jedním z nejstarších a nejvíce devastujících onemocnění v historii lidstva a i dnes zůstává celosvětově 3. nejčastější smrtící infekční chorobou (Ryan et al., 2010). Odhaduje se, že zhruba 1/3 lidstva je tímto onemocněním v současné době nakažena. Avšak pouze asi u 10 % nakažených osob dojde k rozvinutí aktivní formy onemocnění. Právě vysoký počet latentních infekcí naznačuje dlouhou dobu koexistence bakterie jako patogenu a člověka jako jejího hostitele (Hershkowitz et al., 2008). Tuberkulóza se u člověka nejčastěji přenáší pomocí kapénkové infekce z člověka na člověka. Další možností nákazy je inhalace infikovaného prachu zejména v místech s velkým počtem osob a nízkou úrovní hygieny. V neposlední řadě může k nákaze dojít přijímáním infikované potravy, především infikovaného mléka či nedostatečně upraveného masa. K tomuto druhu přenosu docházelo především v minulosti, dnes je tento způsob přenosu díky pasterizaci mléka a dostatečné úpravě potravy téměř vymýcen. K přenosu nemoci může dojít také transplacentárně, tj. přenosem z matky na plod. U onemocnění tuberkulózou můžeme rozlišit dvě fáze, a to primární a sekundární fázi. Primární tuberkulóza představuje počáteční infekci tuberkulózním bacilem a je běžná u dětí neočkovaných proti tuberkulóze. Nejčastěji k nákaze dochází inhalací patogenu. Bacil se v alveolárním makrofágu rozmnoží a vytvoří tzv. Gohnovo ložisko, které společně s lymfatickou uzlinou vytvoří primární komplex. V této fázi dojde nejčastěji k zastavení infekce vytvořením kalcifikované uzliny, která brání dalšímu šíření onemocnění (Bannister, 2006). Kalcifikované uzliny mohou být identifikovány pomocí rentgenového vyšetření. U většiny infikovaných v tomto stádiu nenacházíme žádné projevy onemocnění. Sekundární tuberkulóza neboli post-primární tuberkulóza může nabývat rozmanitých forem a vzniká po reaktivaci latentní infekce či po znovu setkání s patogenem zejména u osob se sníženou imunitou v důsledku nemoci (např. diabetes, AIDS) či špatné životosprávy. Sekundární infekce je nejčastěji lokalizována v horní části plic poblíž klíční kosti, kde je vysoký obsah kyslíku nutného k růstu bakterie (Aufderheide et al., 1998). Nejčastějším příznakem onemocnění je horečka, která se typicky objevuje v pozdních odpoledních hodinách. Dalším příznakem je únava a nechutenství. Mezi symptomy indikujícími postižení respiračního traktu patří především kašel (Pokorný et al., 1998). Tuberkulóza nejčastěji napadá plíce, v tom případě se jedná o plicní tuberkulózu. Postupem času se však mohou vytvořit i mimoplicní formy. Prakticky může být tuberkulózou napaden jakýkoliv orgán v těle, např. mízní uzliny, kosti, klouby, 13 urogenitální trakt (Krauss et al., 2003). 3.4.1 Historie tuberkulózy Rostoucí vliv tuberkulózy jako jedné z hlavních příčin nemocnosti a úmrtnosti lidské populace, i přes objevení účinných antibiotik v 50. letech, podnítilo zájem badatelů studujících původ, evoluci a potažmo i historii patogenu způsobujícího toto onemocnění. (Dixon et al., 2001) Tuberkulóza se zdá být tak stará jako lidstvo samo, o čemž svědčí především kosterní nálezy. Díky vlastnostem mykobakteriální buněčné stěny a vysokému obsahu guaninu a cytosinu v jejich DNA jsou bakterie ze skupiny MTC velmi odolné, což jim umožnilo přežít po velmi dlouhou dobu. Proto jsou mykobakterie ideálním mikroorganismem pro studium tzv. archaické DNA (aDNA). Nejstarším dokladem přítomnosti patogenu pomocí detekce mykolových kyselin je nález pozůstatků bizona v jeskyni Natural Trap Cave nacházející se v Severní Americe (Wyoming, USA). Stáří těchto pozůstatků bylo pomocí radiokarbonové metody určeno na 17 500 ± 460 let BP (nekalib.) a pomocí spoligotypingu bylo zjištěno, že mykobakteriální DNA nalezená v těchto pozůstatcích je evolučně bližší M. tuberculosis než M. bovis, či M. africanum, což potvrdilo domněnku, že bakterie ze skupiny MTC se vyvinuly ze společného předka (Donoghue et al., 2004). Dodnes však zůstává záhadou, jak se patogen dostal na území Severní a Jižní Ameriky. Do nedávné doby se totiž předpokládalo, že bakterie MTC byly do Ameriky zavlečeny Evropany po objevení Ameriky. Salo a jeho kolegové (Salo et al., 1993) však podali nezvratné důkazy o přítomnosti patogenu u předkolumbovské civilizace, a to na základě důkazu přítomnosti M. tuberculosis v plicní lézi mumie dospělé ženy pocházející z konce 1. tisíciletí n. l. z jižního Peru, což je nezvratným důkazem toho, že se zde patogen objevil již mnohem dříve než byl původní předpoklad. Jednou z možností jak mohlo dojít k přenosu nemoci na území Ameriky je přechod nakažených zvířat nebo prvních nomádů přes Beringovu úžinu během Pleistocénu. Nejstarší známý případ nákazy člověka tuberkulózou ve Starém světě (Evropa, Asie, Afrika) pochází ze starověkého Egypta. Jedná se o tuberkulózní kostru chlapce 12-14 let starého pocházející z predynastické hrobky v Adäimě datované na základě nalezené keramiky v hrobce do let 3400-3200 př. n. l. Kostra nesla typické známky kyfózy známé jako Pottova nemoc, patřící mezi nejčastější formy kostní tuberkulózy (Crubézy et al., 1998). Ze starověkého Egypta pocházejí také první písemné záznamy popisující klinické 14 aspekty a lékařské ošetření tuberkulózy. Známé jsou také malby a sochy s patrnými známkami tuberkulózy páteře. Ve starověkém Egyptě vzniklo také první sanatorium pro léčbu tuberkulózy (Madkour et al., 2004). Hippokrates (460-361 př. n. l.) považoval tuberkulózu za dědičné a neinfekční onemocnění a označil ji termínem “phthisis” (z egyptského slova znamenajícího chřadnout) (Chadwick et al., 1978). Od doby Galéna (130-200 n. l.), který správně považoval tuberkulózu za infekční onemocnění a také správně poukázal na vliv výživy na rozvoj onemocnění, až do 11. století n. l. nedošlo k žádnému výraznému pokroku v léčbě tuberkulózy. V 11. století Avicenna, perský učenec a autor Kánonu medicíny, který byl považován za vrchol lékařského vědění své doby, popsal a léčil tuberkulózu. Léčba byla založená především na pobytu nemocných na čerstvém vzduchu, vydatné stravě, odpočinku a dostatečném spánku (Al-Amoud, 1993). René Laennec (1781 - 1826) vynalezl roku 1816 stetoskop a definoval fáze plicní tuberkulózy. Poprvé si také všiml tuberkulózních uzlíků přítomných v různých orgánech zasažených tuberkulózou. Přítel Laenneca, Gaspard Laurent Bayle (1774 - 1816), definitivně prokázal, že tuberkulózní uzlík není produktem ani výsledkem, nýbrž samotnou příčinou onemocnění. V této době se také v medicínské literatuře začalo objevovat označení tuberkulóza (Madkour et al., 2004). Bakterie způsobující tuberkulózu byla objevena roku 1882 německým lékařem a zakladatelem bakteriologie Robertem Kochem. Později, roku 1890, na 10. Mezinárodním medicínském kongresu ve Vídni zveřejnil Robert Koch výsledky svého výzkumu prováděném na morčatech. Naznačil, že objevil lék na tuberkulózu a řekl: “Našel jsem látku, která jak ve zkumavce, tak i v živém člověku brání růstu tuberkulózního bacilu.“ Tato zpráva se velmi rychle rozšířila a tisíce pacientů cestovaly z celé Evropy do Berlína s nadějí na uzdravení. Samotná léčba byla založena na injekčním podání tuberkulinu. Po podání tuberkulinu vykazovali tuberkulózní pacienti silnou reakci provázenou horečkou, bolestí kloubů, nevolností a ztuhlostí. Tyto příznaky zpravidla zmizely do 12 h po podání “léku“. Na přelomu roku 1890 a 1891 bylo již zřejmé, že “Kochův tuberkulin“ nemá terapeutické účinky, ale má velký diagnostický potenciál (tuberkulinový test) (Magner, 1992). Během 19. století byla léčba nemocných tuberkulózou soustředěna do sanatorií, a to především z důvodu izolace nemocných, čímž došlo k omezení šíření infekce mezi zdravou populaci. Léčba v sanatoriích však nebyla příliš účinná. Byla založena 15 na odpočinku, lehkém cvičení na čerstvém vzduchu a správné životosprávě. Ke správné diagnóze tuberkulózy přispěl roku 1895 W. K. von Röntgen (1845-1923) objevem rentgenového záření. K velkému pokroku v léčbě tuberkulózy došlo v 50. a 60. letech 20. století objevem antituberkulotik (streptomycin, pyrazinamid, etambutol, thioacetazon a rifampicin), z nichž nejúčinnější je rifampicin, což je širokospektré antibiotikum zavedené do léčby roku 1961. Rifamcipin ovlivňuje syntézu ribonukleové kyseliny mykobakterií (Pokorný et al., 1998). Během 60. až 80. let se nemoc dostala pod kontrolu, ale nikdy nebyla zcela vymýcena. Kolem roku 1985 začalo případů onemocnění TBC opět přibývat (10-30% roční nárůst), a to především díky vzniku multirezistentních kmenů M. tuberculosis complex odolných vůči očkovacím preparátům a antituberkulotikům používaných po několik desetiletí. V současné době se tato nemoc stává osudnou pro více než 30 miliónů lidí ročně. Roku 1992 vyhlásila Světová zdravotnická organizace (WHO) pro onemocnění tuberkulózou tzv. globální stav ohrožení. 3.4.2 Imunitní reakce provázející infekci M. tuberculosis complex Interakce mezi mykobakterií a imunitním systémem je velmi komplexní a zapojuje se do ní jak vrozená, tak i získaná imunita. Bakterie ze skupiny MTC si vyvinuly vlastní strategii s cílem obelstít hostitelskou imunitní odpověď zahrnující několik kroků od počáteční fáze infekce přes období latence až po stádium aktivního onemocnění (Wilbur et al., 2008). Po vdechnutí mykobakterie je v alveolárním sklípku zahájena imunitní reakce, kdy dojde k setkání patogenu s alveolárním makrofágem či s monocytem, např. s dendritickou buňkou (Reddy et al., 1998). Tyto fagocyty nesou na svém povrchu receptory pro navázání infekční částice. Po navázání infekční částice např. na povrch makrofágu pronikají patogeny dovnitř makrofágu za vzniku fagozómu. Mykobakterie zvolily velmi účinnou metodu jak zastavit imunitní reakci. Potlačují totiž snižování pH ve fagozómech a zabraňují tak následnému splývání fagozomu s lysozomem. V další fázi, o několik týdnů později, dochází prostřednictvím T helper lymfocytů (Th1) k aktivaci makrofágů, které začnou vykazovat antimykobakteriální aktivitu a aktivované makrofágy vyvolají tvorbu granulomů obsahujících mykobakterie (obr. č. 3). Aktivace makrofágů pomocí Th1 je kritickým bodem imunitní reakce, neboť neaktivovaný makrofág fagocytuje mykobakterie méně efektivně a poskytuje M. tuberculosis dostatek času k namnožení, které může vyústit v aktivní onemocnění. Pokud nedojde k porušení granulomu, jedná se o latentní onemocnění, kdy je granulom obalen kalcifikovanou tkání. 16 Ve většině případů u osob s dostatečnou imunitou dojde k zastavení průběhu infekce v této fázi. Tito jedinci nevykazují žádné známky onemocnění, přestože jejich organismus stále obsahuje patogen M. tuberculosis uzavřený v granulomu. Pokud však dojde k porušení granulomu v latentní fázi, přejde infekce do progresivní fáze charakterizované nekontrolovatelnou bakteriální replikací a šířením infekce v těle hostitele. Zkapalněním ložiska infekce získá patogen přístup ke kyslíku nutnému k růstu bakterií. Složky zkapalněného ložiska se mohou dostat i do krevního či lymfatického oběhu a mohou tak způsobit infekci dalších tkání (McClane et al, 1999). Ve vztahu k imunitní reakci byl studován i vliv výživy infikovaného jedince. Podvýživa je nejčastější příčinou snížené imunity organismu a je znám také její vliv na průběh tuberkulózní infekce (Chandra, 1996). Wilbur a kolegové (Wilbur et al., 2008) se zabývali vlivem některých složek potravy (železa a bílkovin) na imunokompetenci (obr. č. 3). Zjistili, že nižší obsah bílkovin způsobuje pokles antimikrobiální aktivity makrofága a navíc dojde k zabránění maturace T buněk a omezení Th1 odpovědi ve prospěch odpovědi Th2. Důsledkem je deaktivace makrofágů umožňující volnou replikaci mykobakterií, jež vede k propuknutí aktivní nemoci. Naproti tomu dostatečný obsah železa v organismu hostitele stimuluje replikaci patogenu a snižuje baktericidní účinek makrofágů. Mírný nedostatek železa tak naopak chrání hostitele před vypuknutím aktivního onemocnění. 17 Obr. č. 3.: Zjednodušené schéma lidské imunitní reakce na vdechnutí M. tuberculosis zahrnující účinek nedostatku bílkovin a dostatku železa v hostitelském organismu (Upraveno podle: Wilbur et al., 2008). 3.4.3 Tuberkulóza pohybového aparátu Tuberkulóza kostí a kloubů je jednou z nejčastějších lokalizací mimoplicní tuberkulózy (obr. č. 4). K přenosu mykobakterií dochází skrze krevní řečiště z místa primární nákazy (nejčastěji plic), tudíž teoreticky může být napadena jakákoliv kost v těle. V praxi si však tuberkulózní bacil přednostně vybírá místa o vysoké krevní oběhové aktivitě (např. kostní dřeň), která jsou bohatě zásobena kyslíkem. Kostní tuberkulóza se vyskytuje většinou u jedinců, u kterých došlo k rozvinutí 18 sekundární fáze onemocnění. Častěji se vyskytuje u dětí než dospělých. Projevy nemoci závisí na lokalizaci procesu (Pokorný et al., 1998). Pro tuberkulózu jsou typická osamocená jednostranná ložiska. Mnohočetné postižení kostí je vzácné a obvykle je omezeno na případy tuberkulózního zasažení drobných kostí rukou a nohou (Vargová et al., 2002). Klinicky se tuberkulóza kostí může projevit jako absces nebo osteomyelitida. Nejčastěji bývá postižena páteř (50% případů), koleno a kyčel (Pokorný et al., 1998). Pokud je zasažena páteř, respektive těla obratlů, hovoříme o Pottově chorobě. Z kloubů je nejčastěji zasažen kyčelní a kolenní kloub. Zasažena bývají také žebra, pánev a dlouhé kosti. Nemoc může propuknout buď přímo v kosti, nebo v kloubní nitrobláně (synovium). U osob s dostatečnou imunitou se nemoc projeví nejčastěji zánětem synoviální membrány a má velmi pomalý průběh (Tuli, 2004). Kloubní nitroblána reaguje zánětlivou reakcí s tvorbou granulační tkáně (pannus), která způsobí erozi a postupné zničení kloubní chrupavky a případně i přiléhající kosti, což vede k výrazné demineralizaci. Příznaky kostní tuberkulózy závisí na místě infekce a jsou velmi podobné obvyklým příznakům tuberkulózy plic, jako je horečka, úbytek na váze, nechutenství atd. Postižení kloubů provází nepravidelný otok. Ložiska zánětu se časem opouzdřují vazivovou tkání a časem mohou zvápenatět (Pokorný et al., 1998). Obr. č. 4: Schéma lidské kostry s nejčastěji zasaženými oblastmi tuberkulózou (černě označeno) (Dixon, 2001). 19 3.5.1.5. Metody molekulární genetiky používané pro identifikaci M. tuberculosis complex Aplikace metod molekulární genetiky představuje nadějnou perspektivu pro diagnostiku chorob sužujících naše předky. Metody molekulární genetiky umožňují spolehlivou identifikaci přítomnosti patogenu v kosterních pozůstatcích na základě analýzy specifických sekvencí mykobakteriální DNA, především pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). V současné době se také studuje možnost identifikace M. tuberculosis complex na základě detekce mykolových kyselin pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) nebo hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (Gernaey et al., 2001). Obecnou vlastností nukleových kyselin je jejich postupná degradace. Bakteriální DNA podléhá časem procesu depurinace, který způsobuje štěpení řetězce na kratší úseky (≤ 500bp). Rychlost procesu degradace je různá a závisí především na teplotě a pH okolního prostředí. Takto pozměněná DNA se označuje jako archaická DNA (aDNA) (Rollo et al., 2006). Z důvodu rozpadu nukleových kyselin na kratší řetězce nemůže být pro PCR použito amplifikace dlouhých fragmentů. Při PCR jsou tedy amplifikovány krátké sekvence aDNA typické pro patogenní mykobakterie způsobující tuberkulózu u člověka (Raoult et al., 2008). Při většině výzkumů je amplifikována inzerční sekvence IS6110. Počet jejích kopií v buňce M. tuberculosis je 10-20 kopií a v buňce M. bovis 1-5 kopií. Dalšími biomarkery používanými pro průkaz přítomnosti M. tuberculosis jsou geny mtp40, rpoB, plcD a pseudogen oxyR285 (Taylor et al., 2001). Poprvé byla metoda PCR pro analýzu aDNA použita roku 1985, kdy Pääbo a kolegové (Pääbo et al., 1985) podrobili analýze celkem 23 mumií pocházejících z různých období za účelem studia příbuzenských vztahů. Až v roce 1993 Spigelmann a Lemma publikovali první práci zabývající se identifikací M. tuberculosis v kosterních pozůstatcích. Analýza byla provedena na 11 vzorcích kostí pocházejících z Evropy, Turecka a Bornea o stáří 300-1400 let, u kterých byla již v minulosti morfologicky diagnostikována přítomnost TBC. K amplifikaci byla použita inzerční sekvence IS6100 o délce 123 bp. Přítomnost patogenu se podařilo prokázat na kostře dítěte nalezené v Turecku (Spigelmann a Lemma, 1993). Roku 1994 Salo a spolupracovníci publikovali závěry svého výzkumu prokazujícího přítomnost M. tuberculosis u předkolumbovské civilizace (Salo et al., 1994). Od roku 1997 proběhlo několik výzkumů zabývajících se přítomností M. tuberculosis v egyptských mumiích (Nerlich et al., 1997; Crubézy et al. 1998; Zink et al., 2003). Zink a kolegové (Zink et al., 2003) ve své práci z roku 2003 zkoumali celkem 85 egyptských 20 mumií pomocí PCR a spoligotypingu. Zkoumané vzorky pocházely z hrobek v Thébách a Horním Egyptě, které byly používány pro pohřbívání osob z vyšší společenské třídy během období Střední říše (od 2500 př. n. l) až po pozdní období (500 př.n.l.). Z celkového počtu 85 vzorků byla u 25 vzorků prokázána přítomnost M. tuberculosis. Taylor a jeho spolupracovníci (Taylor et al., 2001) se od roku 1996 zabývají prokazováním přítomnosti M. tuberculosis u kosterních pozůstatků pocházejících převážně z území Velké Británie. Na základě amplifikace genomového fragmentu mtp40 a přítomnosti guaninového rezidua na pozici 285 v oxyR pseudogenu prokázali, že infekční kmen přítomný ve zkoumaném vzorku je evolučně bližší M. tuberculosis než M. bovis. Přítomnost M. tuberculosis se kromě u kosterních a mumifikovaných pozůstatků podařilo prokázat také v kalcifikovaných tkáních. Donoghue společně s kolegy (Donoghue et al., 1998) izolovali a identifikovali z kalcifikované pohrudnice 1400 let starých pozůstatků mykobakteriální DNA pocházející z M. tuberculosis complex, což potvrdilo předpokládaný fakt, že mykobakteriální fragmenty aDNA mají dlouhou životnost pravděpodobně díky vlastnostem mykobakteriální buněčné stěny. Dalším vhodným biomarkerem pro molekulární průkaz přítomnosti patogenu jsou mykolové kyseliny typické pro M. tuberculosis complex. V porovnání s DNA jsou mykolové kyseliny stabilnější. Gernaey a kolegové (Gerneay et al., 2001) dokonce považují mykolové kyseliny za vhodnější biomarker než IS 6110, neboť některé části inzerční sekvence IS6110 nejsou specifické jen pro M. tuberculosis complex, ale pro celý rod Mycobacterium. Analýza mykolových kyselin se provádí nejčastěji pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) nebo v posledních letech také pomocí hmotnostní spektrometrie s průletovým analyzátorem a ionizací laserovou desorpcí v přítomnosti matrice (MALDI-TOF). 21 3.6 Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metodou užívanou k amplifikaci vybraných cílových sekvencí nukleových kyselin. Byla vyvinuta roku 1983 americkým vědcem K. Mullisem, který v té době pracoval pro společnost Cetus Corporation. V roce 1993 obdržel K. Mullis za svůj objev Nobelovu cenu za chemii (Bartlett et al., 2003). 3.6.1 Princip PCR Principem PCR je cyklicky se opakující enzymová syntéza komplementárních řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5´→3´ pomocí DNA polymerázy, přičemž produkty jednoho cyklu jsou použity jako templát cyklu následujícího. Dochází tak k exponenciálnímu nárůstu počtu kopií amplifikovaného řetězce. Délka amplifikovaného řetězce by v případě archeologického materiálu neměla přesáhnout 200bp. Pro syntézu primerů je nutná znalost DNA sekvence genomu zkoumaného organismu. Lidský genom i genomy mnoha jiných organismů (např. virů a bakterií) jsou dnes již známy a jsou zveřejněny na stránkách Národního Centra Biotechnologických Informací (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Primerem je označována krátká sekvence DNA (18- 25 nukleotidů), která je komplementární ke koncům amplifikovaných úseků. K provedení reakce se používá termocykler, který umožňuje rychlé a automatické změny teplot. Celkový počet cyklů je obvykle 20-30. Reakci můžeme rozdělit do tří kroků, které se 20 – 30 krát opakují: 1. Denaturace 2. Nasednutí primerů 3. Syntéza chybějícího komplementárního úseku DNA (Mullis, 1987) V prvním kroku dochází k denaturaci molekul dvouřetězcové DNA při 94-95 ºC po dobu 5-10 minut, což vede k rozpojení původní dvoušroubovice (dsDNA) na jednotlivá vlákna (ssDNA). Během druhé fáze dochází k nasednutí tzv. primerů na specifická místa řetězce ssDNA. Po nasednutí primerů je teplota ve třetím kroku zvýšena nejčastěji na 72 ºC a dochází k syntéze komplementárního úseku DNA, kdy dochází k nasednutí jednotlivých deoxynukleotidů (dNTP) komplementárních k amplifikovanému úseku řetězce DNA (Zander, 2008). Syntéza komplementárního řetězce je umožněna přítomností DNA polymerázy, která podle principu komplementarity doplňuje nový řetězec volnými 22 deoxynukleotidy (dNTP). Původně byla pro reakci používána DNA polymeráza získaná z Escherichia coli, která však nebyla dostatečně stabilní vůči vysoké teplotě potřebné k denaturaci DNA, proto musela být před začátkem každého nového cyklu přidána čerstvá dávka DNA polymerázy do reakční směsi. Od roku 1989 se používá termostabilní DNA polymeráza (Taq polymeráza) izolovaná z bakterie Thermophilus aquaticus žijící v horkých pramenech (Bartlett et al., 2003). Celkový počet cyklů je obvykle 20-30 a jako detekční metody amplifikovaných úseků se nejčastěji používá gelové elektroforézy v kombinaci s barvením pomocí ethidium bromidu (Pelt-Verkuil et al., 2008). 3.6.2 Faktory ovlivňující účinnost reakce PCR PCR je vysoce citlivou metodou a její úspěšnost závisí na řadě faktorů, z nichž nejvýznamnější jsou: výběr cílové sekvence, návrh primerů, extrakce aDNA, příprava a složení reakční směsi, způsob detekce, způsob kontroly a interpretace výsledků (Altshuler, 2006) 3.6.2.1. Výběr cílové sekvence Jedním z prvních kroků při optimalizaci metody je výběr cílové sekvence, která by měla být specifická pro zkoumaný organismus. V závislosti na konkrétní aplikaci může být výhodné vybrat buď sekvenci, která je přítomna v celé taxonomické skupině organismů, v tom případě se volí geny kódující 16S rRNA, nebo můžeme vybrat sekvenci specifickou pro jediný organismus (např. inzerční sekvence IS6110 specifická pro M. tuberculosis complex). Jako další cílovou sekvenci je výhodné použít repetitivní či plazmidové sekvence, které poskytují vyšší citlivost stanovení. V případě plazmidové sekvence je však nutné počítat s možností ztráty plazmidu během kultivace, což může způsobit falešně negativní výsledek (Altwegg, 1995). 3.6.2.2. Návrh primerů Sekvence primerů značně ovlivňuje efektivitu a specificitu celé reakce PCR. Návrh primerů je realizován pomocí počítačových programů (např. HZBsimulator, OligoTM , Primer PremierTM ). Důležitý je obsah párů G-C, který by se měl pohybovat mezi 40-60 % (Bartlett, 2003). Délka primerů by se měla pohybovat od 18 do 30 bází. Kratší primery mohou vést k nespecifické PCR amplifikaci a naopak delší primery jsou sice více specifické, ale může u nich dojít k tvorbě sekundárních struktur (např. vlásenka). 23 Specificita primerů je dále silně závislá na teplotě tání Tm. Pro většinu aplikací PCR je optimální teplota tání Tm mezi 55-60 ºC, přičemž oba použité primery by měly mít podobnou hodnotu teploty tání (Dieffenbach et al., 2003) 3.6.2.3. Extrakce aDNA Extrakce DNA představuje jednu z kritických fází analýzy degradované nebo archaické DNA. Při analýze repetitivních sekvencí hraje významnou roli nejen množství ale i kvalita extrahované DNA. Pro extrakci aDNA bylo popsáno několik protokolů, které nejčastěji zahrnují: 0,5M roztok EDTA (pH 8,3), destilovanou vodu, proteinkinasu K (2g/ml), 70% roztok fenol/chloroform/isoamylalkohol (24:25:1), 100% roztok chloroformu, 2M pufr octanu sodného (pH 4,5) a ethanol. Při extrakci aDNA musí být věnována zvýšená pozornost vůči kontaminaci recentní DNA (Bartlett et al., 2003). 3.6.2.4. Složení reakční směsi Koncentrace a čistota jednotlivých složek reakční směsi má důležitou roli pro úspěšnost celé reakce PCR. Aktivita Taq polymerázy je silně závislá na hodnotě pH, proto součástí reakční směsi bývá také pufr Tris-HCl zajišťující optimální pH 7,2 při teplotě 72 ºC. Přídavek KCl (50 mM) stabilizuje DNA a podporuje nasednutí primerů na cílovou sekvenci. Neionogenní detergenty (Triton X-100, Tween 20 nebo NP-40) stabilizují Taq polymerázu a mohou také potlačit tvorbu sekundárních struktur DNA. Všechna výše uvedená aditiva bývají obvykle již součástí komerčně vyráběných Taq polymeráz (Zander et al., 2008). Další důležitou součástí reakčí směsi pro PCR reakci jsou dvojmocné kationty Mg2+ , které působí jako kofaktor Taq polymerázy a spolu s dNTP tvoří rozpustný komplex, který je rozpoznáván Taq polymerázou. Optimální koncentrace hořečnatých iontů se zpravidla stanovuje experimentálně a obvykle se pohybuje od 0,5 do 5 mM (Pelt-Verkuil et al., 2008). 3.6.2.5. Způsob detekce Nejčastěji používanou metodou detekce produktů reakce PCR je elektroforéza na agarovém gelu následována barvením pomocí ethidium bromidu. Tato metoda však není příliš citlivá, neboť vyžaduje přítomnost 1010 kopií amplikonů cílové sekvence. Navíc v přítomnosti nespecifického produktu reakce PCR o přibližně stejné velikosti jakou má amplifikovaná sekvence může tato nespecifická sekvence způsobit falešně pozitivní výsledek. Ke zvýšení citlivosti a specifičnosti byly vyvinuty speciální modifikace PCR (např. Southern blots, Dot blots, ELISA), které k detekci používají radioaktivní či jiné 24 sondy (Altwegg, 1995). 3.6.2.6. Způsob kontroly a interpretace výsledků Každá PCR analýza by měla zahrnovat kontrolu ať již pozitivní či negativní, a to za účelem správné interpretace výsledků. Pozitivní kontrola obsahuje známé množství templátové DNA izolované z kultury zkoumaného organismu. Tato kontrola slouží k přezkoumání, zda všechny složky reakční směsi fungují správně. Negativní kontrola obsahuje všechny složky reakční směsi s výjimkou templátové DNA, jejíž objem je nahrazen alikvotním podílem sterilní vody. Negativní kontroly se používá k vyloučení falešně pozitivních výsledků v důsledku kontaminace vzorku. Dalším typem kontroly je vnitřní kontrola (IAC), jejímž principem je přídavek sekvence DNA do reakční směsi, která je komplementární ke stejnému primeru jako zkoumaný úsek DNA, avšak velikost výsledného kontrolního amplikonu je značně rozdílná od amplikonu cílové sekvence DNA (Sachse et al., 2008). Pomocí této zkoušky se zjišťuje přítomnost inhibitorů, které způsobují inaktivaci DNA polymerázy, degradaci nukleových kyselin nebo mohou interferovat s lyzačními postupy (Walsh et al., 2008). Inhibitory mohou pocházet ze samotného vzorku, dále z izolačního postupu a plastových hmot použitých při přípravě vzorku. Nejvýznamnější inhibitory pocházející ze vzorku jsou: heparin, bílkoviny a hem. Příklady inhibitoru pocházejícího z použitého izolačního postupu jsou fenol, proteasy, detergenty a soli (Logan, 2009). 3.6.3 Výhody a nevýhody PCR Obecně můžeme říci, že zavedení metody PCR znamenalo přelom v molekulární biologii a její výhody značně převyšují negativa. Mezi hlavní výhody této metody patří: rychlost, citlivost, specifičnost a schopnost detekovat malé množství cílové DNA. Další velkou výhodou je i možnost stanovit nekultivovatelné či těžce kultivovatelné bakterie. Hlavními nevýhodami metody je poměrně drahé vybavení, náchylnost ke kontaminaci vzorku během procesu extrakce a citlivost k přítomnosti inhibitorů ve vzorku pocházejících nejčastěji ze složek reakční směsi. Další nevýhodou je rovněž destrukce zkoumaného archeologického materiálu v důsledku odběru. 3.6.4 Real-Time PCR Metoda Real-Time PCR je založena na principu klasické PCR s tím rozdílem, že reakční směs obsahuje fluorescenční substrát, který umožňuje přímou kvantifikaci produktu již během jednotlivých cyklů reakce. Kdežto u klasické PCR je detekován až konečný produkt. Výstupem analýzy Real-Time PCR je exponenciální křivka, pomocí 25 které můžeme kromě kvantifikace produktu sledovat také kinetiku reakce. U metody RealTime PCR odpadá nutnost vizualizace produktu reakce např. pomocí barvení ethidium bromidem (Logan et al, 2009). Používané fluorescenční substráty můžeme rozdělit do dvou skupin, a to na nespecifické a specifické. Mezi nespecifické patří interkalační a „minor groove binding“ látky, která se váží na DNA, např. SYBR GREEN, ethidium bromid či EVA GREEN. Použití interkalačních barviv je poměrně levné avšak jejich nevýhodou je, že neumožňují odlišit specifické a nespecifické produkty. Specifické substráty (sondy) jsou tvořeny krátkým oligonukleotidovým řetězcem, který hybridizuje s PCR amplikonem. Tyto sondy pracují na tzv. principu FRET (fluorescence resonance energy transfer) mezi fluoroforem a zhášečem. Fluorescenční aktivita sondy se zvyšuje v okamžiku, kdy se od sebe fyzicky vzdaluje flourofor a zhášeč. (rozštěpení sondy díky 5´ → 3´exonukleázové aktivitě DNA polymerázy). Nejčastěji používanými fluorofory jsou FAM (6-karboxyfluorescein), HEX (6-aminohexanol) a PULSAR. Používanými zhášeči jsou BHQ-1, BHQ-2, DABCYL či TAMRA. Mezi tyto specifické substráty řadíme např. TaqMan sondy, molekulární majáky či sondy Scorpions (Pestana et al., 2010). • TaqMan sonda má na 5´konci navázaný fluorofor a na 3´konci zhášeč. Tato sonda se hybridizuje k sekvenci DNA a v důsledku resonančního přenosu energie dochází ke zhášení fluorescence zhášečem. Jakmile polymeráza dorazí k sondě, dojde nejdříve k odštěpení fluoroforu a následně i zbytku sondy, a to způsobí konec zhášení a zvýšení fluorescence. Obr. č. 5: TaqMan technologie (Pfaffl, M. W., 2011). 26 • Molekulární maják je tvořen krátkou oligonukleotidovou sekvencí tvořící vlásenku. Na jednom konci je opět navázán fluorofor a na druhém zhášeč. Po hybridizaci sondy k DNA pak dochází ke vzrůstu fluorescence v důsledku zvětšení vzdálenosti mezi fluoroforem a zhášečem. Obr. č. 6: Molekulární maják (SIGMA-ALDRICH, 2011). • Sondy Scorpions jsou bifunkční molekuly obsahující jak fluorescenční sondu tak primer v jediné molekule. Tato molekula obsahuje na 5´konci fluorofor dále sondu, zhášeč, blokátor a primer, přičemž sonda tvoří vlásenku a dochází tak ke zhášení fluorescence. Při syntéze komplementární sekvence DNA dochází k rozvolnění vlásenky a následné hybridizaci s nově syntetizovaným řetězcem a vzniká fluorescenční záření. (McPherson et al., 2006) Obr. č. 7: Molekulární maják (SIGMA-ALDRICH, 2011). 27 3.6.5.1 Přístrojové vybavení pro Real-Time PCR Stejně jako u klasické PCR i u Real-Time PCR se analýza provádí v přístrojích zvaných termocyklery, které umožňují automatickou regulaci teploty. Součástí přístroje pro Real-Time PCR je i fluorimetr, který slouží k měření změny intenzity fluorescenčního záření. Fluorimetr je tvořen zdrojem excitačního záření, excitačním filtrem nebo monochromátorem, prostorem pro umístění vzorku, emisním filtrem a detektorem. Mezi nejčastěji používané zdroje fluorescenčního záření patří halogenové žárovky, lasery a LED diody. Použité zdroje musí produkovat vysokou intenzitu záření, jelikož fluorescence obecně není příliš účinný proces (Logan et al., 2009). K vymezení vlnové délky záření se používají filtry nebo monochromátory. Filtry se používají pro jednodušší aplikace, kdy je třeba vymezit pouze jeden nebo dva rozsahy vlnových délek. Filtry dělíme na excitační a emisní. Excitační filtr je umístěn mezi zdrojem a vzorkem a emisní filtr pak mezi vzorkem a detektorem záření. K výběru vlnové délky lze také použít mřížky či hranolu, které umožňují kontinuálně měnit vlnovou délku. Jako detektorů se používá nejčastěji fotonásobičů či CCD detektorů (Klouda, 2003) 3.6.5.2 Fáze RT-PCR amplifikace a kvantitativní analýza Křivka signálu amplifikovaného úseku DNA má sigmoidní exponenciální tvar a můžeme na ní rozlišit několik oblastí (obr. č. 8), a to tzv. skrytou fázi, exponenciální fázi, lineární fázi a plató fázi, přičemž data se získávají v exponenciální fázi. Při tzv. skryté fázi probíhající během prvních cyklů reakce nemůže být detekován žádný produkt, neboť fluorescenční signál je pod mezí detekce daného přístroje. Jakmile fluorescenční signál přesáhne limit detekce, nastává exponenciální fáze. Jakmile koncentrace produktu dosáhne řádově koncentrace ng/µl dochází k poklesu účinnosti amplifikace vlivem reasociace amplikonů během 2. fáze PCR reakce, kdy dochází k nasednutí primerů. Tato fáze se nazývá lineární. Poslední fází je tzv. plató fáze, kdy již nedochází k syntéze dalších amplikonů (Logan et al., 2009). 28 Obr. č. 8: Křivka signálu RT-PCR s označením jednotlivých fází (Upraveno podle: Pfaffl, M. W., 2011). Kvantifikace se obvykle provádí v exponenciální fázi, kdy se měří počet cyklů nutných k dosažení prahové hodnoty (CT), kdy fluorescence produktu převyšuje pozadí. Toto číslo je pak nepřímo úměrné počtu templátů přítomných v původní reakční směsi (Logan et al, 2009). 3.6.6 EliGene© MTB RT kit K PCR analýze byl použit komerčně dostupný kit EliGene MTB RT kit (Elisabeth Pharmacon, ČR) (dále označován již jen jako kit). Tento kit slouží pro detekci M. tuberculosis a M. bovis v klinickém materiálu a bakteriálních kulturách. Kit je primárně určen pro analýzu těchto typů vzorků: sputum, bronchoalveolární laváž (BAL), exsudát (extravaskulární výpotek) a moč. Tato souprava je schopná detekovat 10 molekul genomické DNA M. tuberculosis ci M. bovis. Kit není citlivý vúči M. kansasii, M. xenopi, M. avium a M. marinum. Součástí kitu je MTB Mix, Positive Control DNA – PC DNA MTB a Internal Control DNA – IC DNA MTB. Sekvence primerů a sond není v návodu uvedena. Amplifikovanou sekvencí je inzerční sekvence IS6110, která je pro průkaz mykobakterií používána nejčastěji. Kit je určen pro absolutní kvantifikaci a použitou fluorescenční sondou je TaqMan sonda, která pro detekci M. tuberculosis využívá fluorescenčním barvivo Yakima Yellow, jehož absorpční maximum je 525 nm a emisní maximum je 548 29 nm. Pro interní kontrolu je sonda označena fluoresceinem FAM, jehož absorpční maximum je 494 nm a emisní maximum je 518 nm. Kity jsou použitelné pro tyto typy RT-PCR přístrojů: Real-Time Systems 7000, 7300 a 7500 (Applied Biosystems). Pokud při analýze nepozorujeme signál pro fluorescenční barvivo Yakima Yellow ani po 45. cyklu, je vzorek pravděpodobně negativní. Vzhledem k detekčnímu limitu 10 genomických DNA je ale možné, že vzorek obsahuje množství DNA M. tuberculosis nacházející se pod detekčním limitem kitu a v tomto případě bychom obdrželi falešně negativní výsledek. Pokud byl ve vzorku detekován nárůst signálu Yakima Yellow, můžeme vzorek prohlásit jako pozitivní. V případě, že ve vzorku jsou přítomny inhibitory, nedochází k nárůstu signálu pro Yakima Yellow, ani pro fluorescein FAM. Při každé analýze by měla být také provedena negativní a pozitivní kontrola. Pozitivní kontrola je součástí kitu a měli bychom při ní obdržet CT nižší než 27. Pro negativní kontrolu může být použita voda určená pro PCR (EliGene ® MTB RT, 2009). 30 4. Praktická část 4.1 Materiál K DNA analýze bylo vybráno celkem 10 různých kosterních pozůstatků se známkami tuberkulózního procesu (obr č. 9, obr. č. 10, obr. č. 11). Paleopatologická diagnostika kostí byla provedena pomocí makroskopického a rentgenologického vyšetření, na základě kterého byly vytipovány kosti obsahující pravděpodobně tuberkulózní patogen. U vzorku 7A a 16A bylo již dřívější PCR analýzou navíc potvrzeno, že tyto pozůstatky jsou pozitivní na M. tuberculosis (Horáčková et al., 1999). U ostatních vzorků se na základě paleopatologické analýzy předpokládalo, že tento patogen obsahují. Kosterní materiál pocházel ze čtyř různých lokalit a období: - z 18. a 19. století z centrální části městského hřbitova na Malé Nové (dnešní Antonínská ulice v Brně) (Vargová et al., 2009). - z poloviny 5. století z pohřebiště z období stěhování národů na Líbivé u Břeclavi (Horáčková et al., 2010). - z období únětické kultury (1800 – 1500 př. n. l.), lokalita neznámá (Kala et al., 2008). - z doby bronzové (1900 – 800 př. n. l.), lokalita neznámá. Obr. č. 9: Ložisko destrukce nad bází levého bradavčitého výběžku, šipkou označeno místo odběru (pravděpodobně doba bronzová, lokalita neznámá) (Foto: Mgr. Kateřina Konášová). 31 Obr. č. 10: Tuberkulózní zánět velkého trochanteru na pravé stehenní kosti, šipkou označeno místo odběru (konec 18. - 19. století, Hrob. č. A2856, Městský hřbitov na Malé Nové) (Foto: RNDr. Michaela Račanská Ph.D.). Obr. č. 11: Charakteristický tuberkulózní hrb (gibbus) s označením místa odběru (konec 18. – 19. století, Hrob č. A1853, Městský hřbitov na ulici Malá Nová) (Foto: RNDr. Michaela Račanská Ph.D.). 32 4.2 Metodika odběru vzorku Před každým odběrem byla kost fotograficky zdokumentována a po dobu 10 minut vysterilizována z každé strany UV lampou. Následně byl povrch kosti ošetřen roztokem chlornanu sodného a povrch kosti byl osmirkován. Odebírána byla spongióza kosti o hmotnosti 1-2 g, a to z oblasti co nejblíže předpokládanému tuberkulóznímu zánětu. Odběr byl prováděn pomocí nebozezu či vrtáčku. Každý vzorek byl uložen do sterilní zkumavky a označen náhodným číslem (tab. č. 1). V případě vzorku 17B byl odebraný materiál navíc omyt destilovanou vodou, etanolem a do druhého dne vysušen při pokojové teplotě. Dále byly vzorky umístěny na dobu nejméně 10 minut do nádoby s tekutým dusíkem a poté byly vzorky rozetřeny ve sterilním tloučku na jemný prášek a umístěny do falkonek. č. vzorku č. hrobu datace a lokalita místo odběru 1 822A konec 18. století (Antonínská) kost stehenní (femur) 2A 2856A konec 18. století (Antonínská) pravá kost stehenní (femur dx) 5A 842A konec 18. století (Antonínská) pravá pánevní kost (os coxae dx) 7A 844A konec 18. století (Antonínská) kost křížová (os sacrum) 9 1815A konec 18. století (Antonínská) hrb (gibbus) 10A 1853A konec 18. století (Antonínská) hrb (gibbus) 13A 805A konec 18. století (Antonínská) hrb (gibbus) 16A L8 polovina 5. století (Líbivá) pravá kost hlezenní (talus dx) 17B únětická kultura (lokalita neznámá) kost stehenní (femur) 18A - doba bronzová (lokalita neznámá) lebka (cranium) Tab. č 1: Údaje o přiřazeném číslu vzorku, č. hrobu odkud vzorek pochází, jeho dataci a lokalitě nálezu 4.3 Ochranná opatření proti kontaminaci cizorodou DNA Při odběru vzorků byly dodrženy všechny zásady zabezpečující prevenci před křížovou kontaminací vzorků mykobakteriální DNA. Vzorky byly odebírány v osteologické laboratoři Oddělení lékařské antropologie, Anatomického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno. Po každém odběru byla laboratoř dekontaminována pomocí UV lampy po dobu 30 minut. Při odběru byly používány roušky, rukavice a sterilní nástroje. 33 4.4 Izolace a analýza DNA Mycobacterium tuberculosis Pro izolaci DNA byl použit protokol, který byl již dříve vyzkoušen pro extrakci DNA z archeologického kosterního materiálu pro studium lidské DNA (Šerý et al., 2009). Před vlastní DNA analýzou bylo nutné provést lýzu buněk a následnou extrakci. Jako extrakční metoda byla použita metoda fenol-chloroformové extrakce. V další fázi byla extrahovaná DNA vysrážena, separována a rozpuštěna v PCR vodě, což je speciálně upravená voda prostá RNáz a DNáz. Získaná DNA tak byla připravena k analýze pomocí metody Real-Time PCR. 4.4.1 Příprava vzorků pro DNA analýzu Prvním krokem fenol-chloroformové extrakce byla enzymatická lýza buněk v přítomnosti EDTA a detergentů, čímž došlo k rozrušení buněčných membrán a uvolnění genetického materiálu do roztoku. EDTA plnila funkci chelatačního činidla pro ionty vápníku, které jsou potřeba jako kofaktor nukleáz. Nukleázy bez vápníku nejsou funkční, takže vychytáním vápníku došlo k zabránění rozkladu čerstvě uvolněné DNA nukleázami, které se z lyzovaných buněk uvolnily. Ke štěpení bílkovin včetně nukleáz a histonů vázaných na molekuly DNA bylo použito proteasy (Chemagen). Jako detergentu bylo použito inogenního 0,5 % N-laurylsarkosinu sodného (Sigma-Aldrich). Postup enzymatické lýze: 1. Ke kostnímu prášku bylo přidáno 4 ml EDTA (0,5 M), 100 µl sarkosylu (0,5 %) a 100 µl proteasy 2. Reakční směs byla krátce rozmíchána na vortexu a přes noc inkubována při 55ºC a 170 rpm. 3. Směs byla centrifugována při 6000g po dobu 10 minut. 4.4.2 Fenol-chloroformová extrakce DNA Fenol-chloroformová extrakce je často používanou metodou pro izolaci DNA a její princip spočívá v několikanásobném protřepávání lyzátu se směsí fenol-chloroformisoamylalkohol v poměru 25:24:1 (Applichem). Protřepáváním dochází k mísení fází, přičemž fenol sráží proteiny přítomné ve vodném lyzátu. Izoamylalkohol zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu, takže po skončení protřepávání přejde fenol do chloroformové fáze (obr. č. 12). Postup fenol-chloroformové extrakce: 1. K objemu lyzátu byl přidán fenol-chloroform v poměru 1:1. 34 2. Po protřepání, které bylo prováděno po dobu 5 minut, byl roztok odstředěn na centrifuze při 6000g po dobu 15 minut. 3. Horní vodná fáze obsahující nukleové kyseliny byla přenesena do nové zkumavky a celý proces fenol-chloroformové extrakce byl opakován celkem ještě dvakrát. 4. K supernatantu byl přidán 3 M octan sodný (ph 5) v poměru 10:1. 5. Směs byla promíchána a byl přidán etanol v poměru 1 : 2,5 (supernatant : etanolu). 6. Inkubace přes noc při -20ºC. 7. Roztok byl centrifugován při 12 000 G po dobu 40 minut. 8. Supernatant byl odsán a k peletu bylo přidáno 1ml 75 % etanolu. 9. Centrifugace při 12 000g po dobu 10 minut. 10. Získaný pelet byl vysušen v digestoři po dobu 1 hodiny. Obr. č. 12: Zkumavky obsahující horní vodou fází a dolní fázi se směsí fenol- chloroform-isoamylalkohol. 4.4.3 Analýza Real-Time PCR a přečištění vzorků K RT-PCR analýzám byl použit komerčně dostupný kit EliGene© MTB RT kit. Komponentami hotového mastermixu, ke kterému byl přidán aDNA templát jsou: 35 • dNTP • MgCl2 • primery • Taq polymeráza • pufr Získaný pelet obsahující aDNA byl rozpuštěn v 1 ml PCR vody. Vzhledem k množství peletu, který pravděpodobně obsahoval vysráženou EDTA a další látky jako jsou polysacharidy, bylo nutné provést přečištění. Postup přečištění pomocí zkumavek VIVASPAN obsahujících filtr: 1. Roztok byl zakoncentrován na centrifuze při 6000g do doby, než byl roztok zahuštěn na 200 µl (v tomto kroku se DNA zachytila na filtru a ostatní látky se promyly do spodní části zkumavky). 2. Koncentráty byly stále příliš zabarvené, proto byly celkem 3 krát promyty 1ml PCR vody a roztok byl poté opět zahuštěn na centrifuze při 6000g na objem 200 µl. 3. Se dvěma vzorky, z nichž jeden byl koncentrovaný a druhý 10 krát zředěný, byla provedena RT-PCR, která ani v jednom případě nefungovala díky přítomnosti inhibitorů. Výskyt inhibitorů v reakční směsi byl určen na základě vnitřní kontroly MTB RT kitu. Vzhledem k přítomnosti inhibitorů bylo na vzorku 16A vyzkoušeno vysrážení DNA pomocí PEG (polyethylenglykol): 1. Vzorek izolované DNA byl rozpuštěn v PEG v poměru 1:1 a směs byla promíchána na vortexu. 2. Vzorek byl temperován na 37 °C po dobu 15 minut. 3. Centrifugace při 20 000g a 20°C. 4. Supernatant byl odsán. 5. Bylo přidáno 200µl 70% etanolu. 6. 10 minut centrifugace při 20 000g a 20°C. 7. Supernatant byl odsán. 8. Pelet byl vysušen v exsikátoru. 9. K peletu bylo přidáno požadované množství PCR vody, ve které byla DNA rozpuštěna. 36 Ani po vysrážení vzorku polyethylenglykolem RT-PCR nefungovala. Na základě vnitřní kontroly bylo potvrzeno, že reakční směs obsahuje inhibitory. Byla vyzkoušena také klasická PCR s detekcí produktu pomocí gelové elektroforézy. Nicméně ani zde se nepodařilo naamplifikovat požadovanou DNA sekvenci. Jako další metody přečištění bylo použito přečištění 2 vzorků přes kolonku: 1. 200 µl vzorku bylo smícháno se 200 µl lyzačního pufru a 200 µl etanolu ( 98 %) a směs byla promíchána na vortexu. 2. Centrifugace přes kolonku při 14 000 rpm po dobu 1 minuty 3. Kolonky byly promyty 500 µl roztoku B3 (etanol/Guanidin, HCl roztok) 4. Kolonky byly promyty 500 µl roztoku B4 (etanol/Tris, NaCl) 5. Byla provedena eluce do 50 µl B5 (10 mM Tris-HCl) Taktéž ani v tomto případě RT-PCR ani klasická PCR neprokázala přítomnost genomové DNA M. tuberculosis (obr č. 13). Obr. č. 13: Agarózový gel (1,5 %) s naneseným standardem DNA (GeneRuler™ DNA Ladder Mix, 100-10,000 bp) a dvěma prečištěnými vzorky. Barveno ethidium bromidem. Na gelu je u obou zkoumaných vzorků na startu jamek zřetelná vyizolovaná DNA. Ani v jednom případě však nebyla detekce amplifikované DNA možná vzhledem k přítomnosti inhibitorů v reakční směsi pro klasickou PCR. 37 Posledním vyzkoušeným typem přečištění bylo přečištění Clean-up protokolem z rostlinného kitu (PowerPlant DNA Isolation Kit, MoBio, USA). Tento kit je speciálně určený pro odstranění inhibitorů ze vzorků jako jsou polyfenolické látky a polysacharidy. Přečištění bylo vyzkoušeno na jednom vzorku již dříve přečištěném přes kolonku a jednom vzorku bez předchozího přečištění přes kolonku. Postup přečištění pomocí PowerPlant DNA Isolation Kit: 1. Polovina objemu vzorku byla doplněna do 150 µl PCR vodou, bylo přidáno 70 µl Bead Solution a roztok byl promíchán převrácením. 2. Bylo přidáno 20 µl PB1. 3. Bylo přidáno 85 µl PB2, roztok byl promíchán a inkubován 5 minut při 4°C 4. Centrifugace při 10 000g po dobu 1 minuty. 5. Supernatant byl přenesen do nové zkumavky a bylo přidáno 70 µl PB7. Roztok byl promíchán. 6. Inkubace 5 minut při 4°C. 7. Centrifugace při 10 000g po dobu 1 minuty. 8. Supernatant byl přenesen do nové zkumavky, bylo přidáno 0,5 ml PB3 a roztok byl promíchán. 9. Inkubace10 minut při pokojové teplotě. 10. Centrifugace při 13 000g po dobu 10 minut. 11. Pelet byl vysušen při pokojové teplotě. 12. Vysušený pelet byl rozpuštěn v 50 µl PB6. Provedená PCR nebyla ani v tomto případě úspěšná. 4.5 Důkaz fenolu Vzhledem k podezření, že izoláty DNA jsou kontaminovány fenolem, který způsobuje denaturaci DNA polymerázy a tím i inhibici PCR reakce, byly provedeny experimenty za účelem prokázat fenol v izolátech. Toto podezření vzniklo na základě neobvykle vysoké koncentrace DNA u čtyř přečištěných vzorků a jednoho nepřečištěného vzorku. Hodnota koncentrace DNA byla vypočítána pomocí změřené absorbance při 260 nm s použitím UV spektrofotometru Specord S 300 UV VIS (Analytik Jena) (tab. č. 2). Spektrum bylo měřeno v rozsahu vlnových délek 210-310 nm. Hodnoty absorbancí naměřené ve studovaném rozsahu vlnových délek jsou uvedeny v příloze (tab č. 3). Koncentrace DNA vypočítáná z absorbancí při 260nm se pohybovala v rozmezí 25 - 3 440 38 µg/ml. Běžně se postupem izolace DNA archeologických vzorků obdrží hodnota kolem 5 µg/ml. Vzniklo tedy podezření, že hodnota koncentrace je navýšena jinou látkou absorbující v oblasti kolem 260 nm. Touto látkou by mohl být právě fenol, jehož absorpční maximum je při 270 nm. V naměřených hodnotách absorbancí nebylo pozorováno očekávané absorpční maximum (270 nm), které by dokazovalo přítomnost fenolu (graf. č. 1). 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Graf č. 1: UV spektra vzorků, fenolu (100 ppm) a standardu DNA (50 µg/ml). Vzorek vzorek (ul) + dH2O (ul) Ředění Abs260 koncentrace (µg/ml)a 1 5µl + 95µl 20x 0,116 116 1P 10µl + 90µl 10x 0,05 25 16A 10µl + 90µl 10x 1,216 608 17B 5µl + 95µl 20x 0,184 184 18A 10µl + 90µl 10x 0,737 369 7A 1µl + 99µl 100x 0,688 3 440 Tab. č. 2: Naměřené hodnoty absorbancí při 260 nm a k nim dopočítané hodnoty koncentrace DNA a výpočet podle vztahu: µg/ml50)260( ⋅⋅= ředěnínmAbsc λ µ 39 Jako konečné potvrzení přítomnosti fenolu bylo u vzorku 7A, u kterého byla vzhledem k vysoké hodnotě koncentrace změřené při 260 nm velká pravděpodobnost, že fenol obsahuje, použito plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MC). Pomocí GC-MS bylo potvrzeno, že tento vzorek byl kontaminován fenolem. Ve spektru (graf č. 2 v příloze) byl pozorován molekulový pík o m/z 94 charakteristický pro fenol. 40 5. Diskuze Vzhledem k přítomnosti inhibitorů v reakční směsi pro RT – PCR nebylo možné prokázat přítomnost patogenu M. tuberculosis v kostech, u kterých se na základě paleopatologické analýzy předpokládalo, že tento patogen obsahují, nebo u kterých byla přítomnost M. tuberculosis prokázána při dřívější analýze DNA (Horáčková et al., 1999). Dle vnitřní kontroly bylo zjištěno, že izoláty DNA obsahují inhibitory. K odstranění inhibitorů bylo vyzkoušeno celkem čtyř postupů přečištění. Ani jeden z těchto postupů však nebyl úspěšný. Inhibitory PCR mohly pocházet buď ze vzorku samotného, nebo mohly být do vzorku zaneseny samotným procesem izolace DNA. Vzhledem k tomu, že odběr materiálu pro analýzu byl proveden podle osvědčeného postupu (Hošek et al., 2006), k zanesení inhibitorů pravděpodobně došlo při procesu extrakce DNA. Další otázkou je vhodnost použité izolační metody DNA. Tato metoda byla již dříve úspěšně aplikována na archeologický kosterní materiál při studiu lidské DNA, nicméně tento postup pro extrakci DNA M. tuberculosis nebyl v Laboratoři DNA diagnostiky PřF MU dříve použit. Podle dostupné literatury je pro izolaci DNA M. tuberculosis běžnější postup využívající izolaci DNA pomocí silikátové extrakce (Rohland et al., 2007). Optimalizace použitého procesu izolace DNA, či vyzkoušení jiného typu izolace však již nebyla možná, neboť všech 10 vzorků bylo analyzováno najednou a další vzorky již nebyly k dispozici. Otázkou zůstává, jaké látky způsobily inhibici. Mezi známé inhibitory PCR patří např. škrobový pudr nebo talek používaný k vysypávání vnitřku ochranných pracovních latexových rukavic (Lomas et al., 2003). V našem případě však inhibice nemohla být tímto způsobena, neboť byly použity tzv. powder-free rukavice. Jednou z teorií bylo, že inhibice byla způsobena formaldehydem, jehož vodný roztok se běžně používá pro konzervaci biologického kosterního materiálu. Formaldehyd působí na DNA degradačně. Avšak vzorky, které jsme k analýzám použili, ve formaldehydu naloženy nebyly. Mezi známé inhibitory DNA polymerázy patří také polysacharidy pocházející z analyzovaného kosterního materiálu (Wilson, 1997). K odstranění polysacharidů bylo použito kitu speciálně určeného pro odstranění těchto látek. Účinnost kitu však mohla být ovlivněna tím, že kit byl použit na již vysráženou DNA. 41 Další možností je, že při extrakci DNA fenol-chloroformem došlo k znečištění vzorku fenolem, který působí na RT-PCR inhibičně (fenol způsobuje denaturaci DNA polymerázy). Pro tuto domněnku hovoří skutečnost, že absorpční maximum fenolu je při 270 nm, což je hodnota velmi blízká absorpčnímu maximu nukleových kyselin (260 nm). Tímto by se vysvětlila i abnormálně vysoká koncentrace nukleových kyselin (25 – 3 440 µg/ml) zjištěná změřením absorbance při 260 nm. Fenol - chloroformovou extrakci je doporučeno provádět pomocí stabilizovaného fenol – chloroformu. V našem případě byl použit nestabilizovaný fenol – chloroform. Rozdíl mezi těmito formami fenolu je v tom, že stabilizace fenolu se provádí 0.1 % 8hydroxychinolinem, který brání oxidaci fenolu a zvyšuje tak stabilitu fenol-chloroformu o 3 měsíce, oproti nestabilizovanému fenol-chloroformu, jehož stabilita je podle výrobce 6 měsíců. V případě, že použitý nestabilizovaný fenol-chloroform byl vyroben před více než 6 měsíci nebo byl nevhodně skladován, mohlo u něj dojít k oxidaci fenolu na chinoliny, které poškuzují DNA. Avšak vzhledem k tomu, že k extrakci byl použit fenol – chloroform doručený přímo od výrobce jen několik dnů před provedením analýz, je tato možnost nepravděpodobná. V dostupné literatuře se uvádí, že po provedení extrakce směsí fenol-chloroformisoamylalkohol je vhodné vodnou fázi nejméně ještě jednou extrahovat jen směsí chloroform-isoamylalkohol (24:1), aby byly dokonale odstraněny stopy fenolu, které by mohly narušit funkčnost DNA polymerázy v následné PCR reakci (Raclavský, 2003). Tento krok však v našem případě nebyl aplikován. K ověření, zda inhibice byla skutečně způsobena fenolem, bylo použito několika postupů. V první fázi byla naměřena absorpční UV spektra vzorků v rozmezí 210 - 310 nm, u kterých však nebyla pozorována maximální absorbance při vlnové délce 270 nm, která by indikovala přítomnost fenolu. Avšak vzhledem ke zjištěným hodnotám koncentrací DNA (25 - 3 440 µg/ml) vypočítaných na základě absorbance při 260 nm bylo zřejmé, že na absorbanci se podílí i jiná látka než jen samotná DNA. Ke konečnému potvrzení přítomnosti fenolu byla použita GC – MS analýza nepřečištěného vzorku 7A, pomocí které bylo zjištěno, že tento vzorek skutečně obsahuje fenol. Důvodem proč RT – PCR nefungovala ani po přečištění vzorků, při kterém došlo k odstranění stop fenolu je pravděpodobně skutečnost, že přečištění bylo provedeno až po vysrážení vzorku ethanolem. Odstranění inhibitorů pomocí přečištění je vždy velmi složité a nejisté a obecně se v tomto případě doporučuje provést novou extrakci. To však v našem případě nebylo možné, neboť další vzorky již nebyly k dispozici. Další možností je, že 42 vzorky neobsahovaly pouze fenol, ale také další látky způsobující inhibici (např. polysacharidy), které se nepodařilo odstranit ani několikanásobným přečištěním. 43 6. Závěr Cílem této práce bylo dokázat přítomnost genomové DNA M. tuberculosis v archeologických kosterních pozůstatcích pomocí metody Real-Time PCR. Za tímto účelem bylo odebráno celkem 10 vzorků z archeologického kosterního materiálu, u kterého se na základě paleopatologické analýzy předpokládalo, že tento patogen obsahují. Cíl bakalářské práce se nepodařilo splnit. Na základě vnitřní kontroly RT-PCR bylo zjištěno, že reakční směs pro PCR obsahovala inhibitory. Možnými inhibitory byl fenol pocházející z procesu extrakce DNA, jehož přítomnost se podařilo prokázat na základě GC-MS analýzy. Dalším možným inhibitorem byly polysacharidy z buněčné stěny zkoumaného kosterního materiálu. K odstranění inhibitorů z reakční směsi bylo použito celkem čtyř typů přečištění, avšak ani jeden způsob nebyl úspěšný. Důvodem, proč přečištění nebylo úspěšné, je pravděpodobně skutečnost, že přečistění bylo provedeno až po vysrážení DNA, což mohlo značně omezit účinnost jednotlivých typů přečištění či stabilitu analyzované mykobakteriální DNA. Závěrem lze říci, že s přihlédnutím k dostupné literatuře je metoda RT-PCR pro detekci M. tuberculosis v archeologickém kosterním materiálu použitelná (Donoghue et al., 2004). V našem případě by však bylo nutné provést optimalizaci metody izolace DNA na zkušebních vzorcích. Jako alternativu k použití RT-PCR lze doporučit analýzu mykolových kyselin pomocí MALDI-TOF, která také byla podle publikované literatury již dříve úspěšně použita pro danou oblast výzkumu (Minnikin et al., 2010). 44 7. Literatura Al-Amoud, M.: The history of tuberculosis, Saudi Med, 1993. Altshuler, M. L.: PCR troubleshooting: the essential guide, Caister Academic Press, UK, 2006. Altwegg, M.: General problems associated with diagnostic applications of amplification methods, Journal of Microbiological Methods 23, 1995. Aufderheide, A.C.; Rodríguez-Martín, C.; Langsjoen, O.: The Cambridge encyclopedia of human paleopathology, Cambridge University Press, UK, 1998. Bannister, B. A.: Infection:microbiology and management, Blackwell Publishing Ltd, USA, 2006. Bartlett, J. M. S.; Stirling, D.: PCR Protocols, Second Edition, Humana Press, USA, 2003. Behr, M. A. et al.: Comparative genomics of BCG vaccines by wholegenome DNA microarray, Science, 1999. Brosch, R. et al.: A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex, PNAS, 2002. Cockburn, A.: The Evolution and Eradicaton of InfectiousDisease, Johns Hopkins Press, Baltimore, USA, 1963. Cole, S.T.: Comparative and functional genomics of the Mycobacterium tuberculosis complex, Microbiology, 2002. Dieffenbach, C. W.; Dveksler, G.S.: PCR primer: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 2003. 45 Dixon, R. A.; Roberts, C. A.: Modern and Ancient Scourges: the Application of Ancient DNA to the Analysis of Tuberculosis and Leprosy from Archaeologically derived Human Remains, Ancient Biomolecules, Volume 3, OPA, 2001. Donoghue, H. D. et al.: Tuberculosis: from prehistory to Robert Koch, as revealed by ancient DNA, The Lancet Infectious Diseases, Volume 4, 2004. EliGene ® MTB RT: Manual of procedures on MTB preparation [online]. 2009 [cit. 2011-04-25]. Dostupné z WWW: . Chadwick, J.; Mann, W. N.: Hippocratic writings, In: Chadwick J, Mann WN, Harmondsworth: Penguin, 1978. Chandra, R. K.: Nutrition, immunity and infection: From basic knowledge of dietary manipulation of immune responses to practical application of ameliorating suffering and improving survival, Processing of the National Academy of Sciences, USA, 1996. Garnier, T. et al.: The complete genome sequence of Mycobacterium bovis, Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 100, no.13, 2003. Gerneay, et al.:Mycolic acids and ancient DNA confirm an osteological diagnosis of tuberculosis, Tuberculosis, Harcourt Publishers Ltd., 2001. Hershkowitz , I. et. al.: Detection and Molecular Characterization of 9000-YearOld Mycobacterium tuberculosis from a Neolithic Settlement in the Eastern Mediterranean, Plos One, 2008. Hettick, J. M. et al.: Discrimination of intact mycobacteria at the strain level: A combined MALDI-TOF MS and biostatistical analysis, Proteomics, 2006. Hošek, J.; Švástová, P.; Morávková, M.; Pavlík, I.; Bartoš, M.: Methods of mycobacterial DNA isolation from different biological material: a review, Veterinarni Medicina, 51, 2006. 46 Horáčková, L.; Vargová, L.; Horváth, R.; Bartoš, M.: Morphological, roentgenological and molecular analyses in bone specimens attributed to tuberculosis, Moravia (Czech Republic), In Tuberculosis, Past and Present. 1. vyd. Hungary : Golden Book Publischer Ltd., TB Fundation, 1999. Horáčková, L.; Vargová, L.; Macháček, J.: MEDICAL-ANTHROPOLOGICAL ANALYSIS OF BONE REMAINS FROM THE 5th CENTURY (LÍBIVÁ, CZECH REPUBLIC), In 18th European meeting of the Paleopathology Association, 2010. Chaussinand, R.: Tuberculosis and leprosy: mutually antagonistic diseases, Lepr. Rev, PubMed, 1953. Kala, J.; Konášová, K.; Smrčka, V.: Pohřby ze zásobních jam na okraji únětického pohřebiště v Brně-Tuřanech, In Acta Archaeologica Opaviensia, Ústav historických věd FPF Slezské Univerzity v Opavě, Opava, 2008. Kato, M.: Site II-specific inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation by trehalose-6,6′-dimycolate (cord factor) of Mycobacterium tuberculosis, Archives ob Biochemistry and Biophysics, Elsevier, Volume 140, 2004. Klouda, P.: Moderní analytické metody, nakladatelsvtí Pavel Klouda, Ostrava, 2003. Krauss, H. et al.: Zoonoses: Infectious diseases transmissible from animals to humans, ASM Press, 2003. Logan, J.; Edwards, K.; Saunders, N.: Real-time PCR: current technology and applications, Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2009. Lomas, J. G.; Sunzeri, F. J.; Busch, M. P.: False-negative results by polymerase chain reaction due to contamination by glove powder, Transfusion, Volume 32, Issue 1, 2003. Madkour, M. M. et al.: Tuberculosis, Springer Verlag, USA, 2004. 47 Magner, L. N.: A History of Medicine, Marcel Dekker Inc., USA 1992. McClane, B. A.; Mietzner, T. A.: Microbial pathogenesis: a principles-oriented approach, Port City Press, USA, 1999. McClatchey, K. D. et al.: Clinical laboratory medicine, Lippincott Williams & Wilkins, USA, 2002. McPherson, M. J.; Moller, S. G.: PCR, Taylor & Francis Group, UK, 2006. Minnikin, D. E. et al.: Essentails in the use of mycolic acid biomarkers for tuberculosis detection response to “High-throughput mass spectrometric analysis of 1400years-old mycolic acid as biomarkers for ancient tuberculosis infection” by Mark et al., 2010, Elsevier, 2010. Mullis, K. B.; Faloona, F.: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction, METHODS ENZYMOL. 155, 1987. Nehrlich, A. G et al.: Paleopathology of Human Tuberculosis and the Potential Role of Climate, Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, 2009. Pelt-Verkuil, E.; Belkun, A.; Hays, J. P.: Principles and technical aspocts of PCR amplifiation, Springer Science + Business Media B.V., USA, 2008. Pestana, E. A. et al.: Early, Rapid and Sensitive Veterinary Molecular Diagnostics Real Time PCR, Springer Science, Germany, 2010. Pfaffl, M. W.: Gene Quantification & real-time PCR dyes and chemistries [online], 2002 - 2011 [cit. 2011-04-25], Gene Quantification, Dostupné z WWW: . Raclavský, V.: Metody molekulární genetiky [online], 2003 [cit. 2011-04-25], Dostupné z WWW: . 48 Raoult, D.; Drancourt, M.: Paleomicrobiology: Past Human Infections, SpringerVerlag, 2008. Real Time PCR Research: Real Time PCR Research [online]. 2004 - 2010 [cit. 2011-04-25]. Dostupné z WWW: . Reddy, V. M.; Anderson, B. R.: Immunology of tuberculosis. In Mycobacteria I. Basic aspects, Chapman and Hall., New York, 1998. Rohland, N.; Hofreiter, M.: Ancient DNA extraction from bones and teeth, Nature Protocols 2, 2007 Röse, L.: Role of Undecaprenyl Phosphokinase in mycobacteria: impact on biofilm formation, growth properties, persistence, and virulence, Disertační práce, Universität zu Berlin, 2004. Ryan, K. J.; Ray, C. G.; Ahmad, N.: Sherris medical mikrobiology, Fifth edition, McGraw-Hill Medical, USA, 2010. Sachse, K.; Frey, J.: PCR detection of microbial pathogens, Humana Press Inc., USA, 2008. Salo, W. L. et al.: Identification of Mycobacterium tuberculosis DNA in a preColumbian Peruvian mummy, Proceedings of the National Academy of Science, Volume 91, 1994. SIGMA-ALDRICH: Molecular Beacons | Custom DNA Probes | Custom Oligos [online], 2011 [cit. 2011-04-25], Dostupné z WWW: . SIGMA-ALDRICH: Scorpions™ Probes | Custom DNA Probes | Custom Oligos [online], 2011 [cit. 2011-04-25], Dostupné z WWW: . 49 Šerý, O.; Nývltová-Fišáková, M.; Oliva, M.: Genetická analýza tří koster z neolitické těžní šachty v Krumlovském lese. In 15. Kvartér 2009. První vydání. Brno : Ústav geologických věd, Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita, Brno, 2009. Taylor, G. M.; Mays, S.; Legge, A. J.; Ho, T. B. L.; Young, D. B.: Genetic Analysis of Tuberculosis in Human Remains, Ancient Biomolecules, Vol. 3, OPA, 2001. Tuli, S. M.: Tuberculosis of the Skeletal System: Bones, Joints, Spine and Bursal Sheaths, Jaypee Brothers Medical Publishers Ltd, India, 2004. Vargová, L.; Horáčková, L.: A medical and anthropological analysis of skeletal remains from the cemetery at Antonínská Street in Brno (dated 1785-1883), In Vth International Anthropological Congress of Aleš Hrdlička, Czech Republic, 2009. Vargová, L.; Horáčková, L.; Langová, L.: Možnosti diagnostiky tuberkulózy v paleopatologických výzkumech, In Ve službách archeologie IV. Sborník k 75. narozeninám Prof. PhDr. V. Nekudy, DrSc., Muzejní a Vlastivědná společnost v Brně, Brno, 2002. Vasanthakumari, R.: Textbook of Microbiology, BI Publications Pvt Ltd, New Delhi, 2007. Vissa, V. D.; Brennan, P. J.: The genome of Mycobacterium leprae: a minimal mycobacterial gene set, Genome biology, Issue 8, Volume 2, 2001. Walsh, P. J. et al.: Oceans and human Health: risks and remedies from the seas, Elsevier, USA, 2008. Wilbur, A. K. et al.: Diet, Tuberculosis, and the Paleopathological Record, Current anthropology, Volume 49, 2008. Wilson, I. G.: Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, American Society for Microbiology, 1997 50 Zink, A. R. et al.: Characterization of Mycobacterium tuberculosis Complex DNAs from Egyptian Mummies by Spoligotyping, Journal of Clinical Microbiology, Volume 41, 2003. 51 8. Použité přístroje, kity a chemikálie Chemikálie: EDTA (0,5 M) etanol (75%, 70%) fenol-chloroform-isoamylalkohol fenol (1%) DNA standard (50 µg/ml) lyzační pufr N-laurylsarkosin sodného (0,5 %) octan sodný (3M, ph 5) PCR voda PEG proteasa roztok B3 (etanol/Guanidin, HCl roztok) roztok B4 (etanol/Tris, NaCl) roztok B5 (10 mM Tris-HCl) Kity: MTB RT kit PowerPlant DNA Isolation Kit Přístroje: Centrifuga 5804 R (Eppendorf) GCMS-QP 2010 (Shimadzu) Real-Time PCR System ABI 7300 (Applied Biosystems) Specord S 300 UV VIS (Analytik Jena) 52 9. Seznam důležitých pojmů Ankylóza - ztuhlost kloubu následkem poranění nebo kloubního onemocnění. Archaická DNA - DNA izolovaná z archeologických nálezů. Obsahuje velký počet mutací, jejichž množství narůstá se stářím vzorku. Brucelóza - infekční bakteriální onemocnění zvířat přenosné na člověka. Cord factor - toxický glykolipid, který je součástí mykobakteriální buněčné stěny. Způsobuje alteraci mitochondriální membrány, a tím i inhibici respirace a fosforylace. Dot blot - hybridizace na pevném nosiči. Při této metodě není na rozdíl od southern blotu nutné provádět chromatografii k oddělení jednotlivých fází. Na membránu je nanesena přímo směs látek obsahující zkoumanou molekulu a detekce se poté provádí pomocí protilátek. ELISA - imunologická metoda sloužící k detekci protilátek. Metoda funguje na bázi imunoenzymatické reakce a lze s ní rovněž detekovat i antigen. Fagocyt - jakákoliv buňka schopná fagocytózy, tedy pohlcování velkých pevných částic z okolního prostředí přes membránu. K profesionálním fagocytům v lidském těle patří především monocyt, makrofág, neutrofilní granulocyt, dendritická buňka a žírná buňka. Makrofág - buňka usazená v tkáni, specializovaná na pohlcování cizorodých částic, např. odumřelých buněk. Maligní tumor - zhoubný nádor šířící se do okolní tkáně, případně jiných částí těla. Osteomyelitida - zánět kostní dřeně vyvolaný bakteriemi či mykobakteriemi. Při tomto onemocnění dochází k ucpávání cév v kosti krevními sraženinami a následnému odumírání kostní tkáně. Osteopenia - ubývání kostní tkáně. Polyethylenglykoly – makromolekulární látky vznikající zahříváním ethylenglykolu za katalýzy jodu. Pottova nemoc - chronická tuberkulózní infekce se zánětem obratlů, obvykle v dolní hrudní páteři. Patří mezi nejčastější formu kostní tuberkulózy a jejím projevem tzv. hrb (gibbus) Saprofyt - organismus živící se výměšky jiného organismu nebo rozkládajícím se živočišným nebo rostlinným tělem nebo jeho částí. Sarkoidóza - multisystémové granulomatózní onemocnění nejistého původu. Významně převažuje postižení dýchacího systému, konkrétně postižení plic a nitrohrudních 53 lymfatických uzlin. Typická je tvorba granulomů, což jsou ložiska v tkáni, v nichž dochází ke shluku buněk imunitního systému reagujících na dosud neznámý podnět. Southern blot - hybridizační metoda využívaná při práci s DNA. Umožňuje přenos fragmentů DNA z agarového gelu, v němž probíhala elektroforéza, na nitrocelulózový nebo nylonový materiál. Následně může být vzorek zvýrazněn pomocí radioaktivních nebo jiných sond. Spoligotyping - metoda založená na PCR reakci a detekci polymorfismů přímých repetic v genomu M. tuberculosis. Synovium - kloubní nitroblána. Th1 lymfocyty - vyhledají a stimulují k aktivaci makrofágy nakažené vnitrobuněčnou infekcí, pomocí interferonu γ. Th2 lymfocyty - vyhledávají B-lymfocyty a stimulují je ke tvorbě protilátek, produkují protizánětlivé cytokiny (IL-4 aj.). Tuberkulin - látka získaná z kultur tuberkulózních bacilů, používaná k diagnóze tuberkulózy. Virulence - individuální vlastnost patogenu, která vyjadřuje stupeň patogenity určitého mikrobiálního kmene ve srovnání s ostatními kmeny daného druhu. Virulence se určuje například podle schopnosti mikroba vyvolat onemocnění či v rámci něho usmrtit hostitele. 54 10. Seznam zkratek aDNA - archaická DNA AIDS - Acquired Immune Deficiency Syndrome Bp - pár bází CCD - charge-coupled device DNA - deoxyribonukleová kyselina dNTP - deoxyribonukleotid trifosfát FAM - 6-karboxyfluorescein EDTA - ethylendiamintetraoctová kyselina FRET - fluorescence resonance energy transfer GC-MS – plynová chromatografie s hmotnostní detekcí HEX - 6-aminohexanol HPLC - vysokoúčinná kapalinová chromatografie IAC - Internal amplification control LED - Light-Emitting Diode MAPc - mykolyl- arabinogalaktan -peptidoglykanový komplex MTC - Mycobacterium tuberculosis complex MALDI-TOF- Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight PCR - polymerázová řetězová reakce PEG -polyethylenglykol RT-PCR - polymerázová řetězová reakce v reálném čase TBC - tuberkulóza Tris - 2-amino-2-hydroxymethylpropan-1,3-diol UV - ultraviolet 55 11. Příloha Absorbance λ (nm) 1 1P 16A 17B 18A 7A 100ppm fenol λ DNA (c=50µg/ml) 250 0,117 0,036 0,558 0,169 0,769 0,751 0,207 0,9 251 0,118 0,036 0,554 0,172 0,765 0,746 0,239 0,921 252 0,118 0,036 0,550 0,174 0,762 0,739 0,276 0,94 253 0,118 0,037 0,546 0,176 0,76 0,733 0,317 0,957 254 0,118 0,038 0,542 0,178 0,757 0,727 0,362 0,97 255 0,119 0,04 0,539 0,18 0,754 0,722 0,412 0,981 256 0,119 0,042 0,535 0,181 0,751 0,715 0,465 0,988 257 0,119 0,044 0,531 0,182 0,748 0,707 0,521 0,992 258 0,118 0,046 0,527 0,183 0,745 0,701 0,581 0,992 259 0,117 0,048 0,523 0,183 0,741 0,695 0,644 0,987 260 0,116 0,05 0,519 0,184 0,737 0,689 0,711 0,98 261 0,115 0,053 0,514 0,183 0,734 0,681 0,78 0,97 262 0,114 0,056 0,510 0,183 0,732 0,674 0,849 0,957 263 0,113 0,059 0,505 0,183 0,73 0,667 0,917 0,94 264 0,111 0,061 0,499 0,182 0,726 0,659 0,98 0,921 265 0,109 0,064 0,493 0,18 0,721 0,651 1,035 0,898 266 0,107 0,067 0,486 0,178 0,717 0,642 1,085 0,875 267 0,105 0,069 0,481 0,176 0,714 0,634 1,133 0,853 268 0,103 0,072 0,475 0,175 0,711 0,627 1,171 0,829 269 0,101 0,074 0,469 0,172 0,707 0,621 1,187 0,805 270 0,099 0,076 0,462 0,169 0,703 0,615 1,181 0,78 271 0,097 0,077 0,455 0,167 0,698 0,608 1,158 0,754 272 0,094 0,078 0,448 0,164 0,694 0,601 1,123 0,729 273 0,092 0,079 0,441 0,161 0,689 0,593 1,081 0,703 274 0,089 0,079 0,433 0,157 0,684 0,587 1,033 0,676 275 0,087 0,079 0,426 0,153 0,679 0,580 0,975 0,648 276 0,084 0,077 0,418 0,149 0,673 0,574 0,9 0,62 277 0,082 0,076 0,411 0,144 0,666 0,567 0,799 0,592 278 0,079 0,074 0,403 0,14 0,657 0,560 0,677 0,564 279 0,077 0,071 0,396 0,136 0,648 0,554 0,546 0,536 280 0,074 0,068 0,388 0,131 0,64 0,547 0,418 0,507 281 0,071 0,064 0,381 0,126 0,63 0,541 0,304 0,478 282 0,068 0,059 0,373 0,121 0,618 0,534 0,209 0,447 283 0,065 0,053 0,365 0,115 0,604 0,527 0,133 0,417 284 0,062 0,047 0,358 0,11 0,59 0,521 0,075 0,386 285 0,059 0,04 0,351 0,105 0,577 0,514 0,033 0,355 286 0,056 0,034 0,344 0,1 0,561 0,504 0,003 0,324 287 0,053 0,029 0,336 0,094 0,545 0,493 -0,017 0,294 288 0,05 0,025 0,328 0,089 0,532 0,485 -0,03 0,265 289 0,047 0,021 0,322 0,084 0,523 0,480 -0,039 0,237 290 0,044 0,017 0,316 0,079 0,514 0,475 -0,045 0,21 291 0,041 0,014 0,308 0,074 0,503 0,467 -0,049 0,184 292 0,039 0,011 0,301 0,07 0,492 0,459 -0,051 0,159 293 0,037 0,009 0,295 0,066 0,483 0,451 -0,052 0,136 294 0,035 0,008 0,289 0,062 0,474 0,443 -0,052 0,114 295 0,032 0,006 0,282 0,057 0,464 0,435 -0,053 0,094 296 0,03 0,005 0,275 0,053 0,455 0,428 -0,053 0,077 297 0,028 0,003 0,269 0,05 0,447 0,422 -0,054 0,063 298 0,027 0,002 0,264 0,048 0,439 0,416 -0,054 0,05 299 0,025 0,001 0,258 0,045 0,431 0,409 -0,054 0,039 300 0,024 0,001 0,252 0,042 0,424 0,402 -0,054 0,031 Tab č. 3: Změřené hodnoty absorbancí vzorků v rozmezí vlnových délek 250-300 nm. 56 57