MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Optimalizace přípravy rostlinných meiotických chromozomů pro účely zobrazení pomocí rastrovací elektronové mikroskopie Diplomová práce PETR JANÁS Vedoucí práce: RNDr. Terezie Mandáková, Ph.D. Ústav experimentální biologie Obor molekulární biologie a genetika Brno 2021 7 o A O ^ OPTIMALIZACE PŘÍPRAVY ROSTLINNÝCH MEIOTICKÝCH CHROMOZOMŮ PRO ÚČELY ZOBRAZENÍ POMOCÍ RASTROVACÍ ELEKTRONOVÉ MIKROSKOPIE Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Rok: Počet stran: Klíčová slova: Petr Janás Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Optimalizace přípravy rostlinných meiotických chromozomů pro účely zobrazení pomocí rastrovací elektronové mikroskopie Molekulární biologie a genetika Molekulární biologie a genetika RNDr. Terezie Mandáková, Ph.D. 2021 92 rastrovací elektronová mikroskopie, Arabidopsis thaliana, optimalizace, meióza, chromozom OPTIMALIZACE PŘÍPRAVY ROSTLINNÝCH MEIOTICKÝCH CHROMOZOMŮ PRO ÚČELY ZOBRAZENÍ POMOCÍ RASTROVACÍ ELEKTRONOVÉ MIKROSKOPIE Bibliographic record Author: Title of Thesis: Petr Janás Faculty of Science Masaryk University Department of Experimental Biology Optimalization of plant meiotic chromosome preparation for scanning electron microscopy Degree Programme: Molecular biology and genetics Field of Study: Supervisor: Year: Number of Pages: Keywords: Molecular biology and genetics RNDr. Terezie Mandakova, Ph.D. 2021 92 scanning electron microscopy Arabidopsis thaliana, optimalization, meiosis, chromosome OPTIMALIZACE PŘÍPRAVY ROSTLINNÝCH MEIOTICKÝCH CHROMOZOMŮ PRO ÚČELY ZOBRAZENÍ POMOCÍ RASTROVACÍ ELEKTRONOVÉ MIKROSKOPIE Anotace Skenovací elektronový mikroskop je vhodným nástrojem pro studium přesné topologie a ultrastruktury chromozomů. Tak aby bylo možné nahlížet na ultrastrukturu chromozomů, je nejprve potřeba vzorek vhodně připravit. Tato diplomová práce je zaměřena na optimalizaci přípravy rostlinných meiotických chromozomů pro účely zobrazení pomocí skenovací elektronové mikroskopie. Preparáty byly připraveny z mladých prašníků húseničku rolního [Arabidopsis ťhaliana). Příprava preparátů zahrnovala fixaci, kontrastování, dehydrataci, vysoušení a následné nanesení tenké vrstvy kovu pro lepší vodivost vzorku. V rámci diplomové práce byly použily, vzájemně porovnány a kriticky zhodnoceny různé metodické přístupy. Výsledkem je navržení robustního protokolu poskytujícího vysokou kvalitu výsledného zobrazení chromozomů. OPTIMALIZACE PŘÍPRAVY ROSTLINNÝCH MEIOTICKÝCH CHROMOZOMŮ PRO ÚČELY ZOBRAZENÍ POMOCÍ RASTROVACÍ ELEKTRONOVÉ MIKROSKOPIE Abstract The scanning electron microscope is a suitable tool for studying the exact topology and ultrastructure of chromosomes. In order to look at the ultrastructure of chromosomes, it is necessary to prepare the sample appropriately. This diploma thesis is focused on optimizing the preparation of plant meiotic chromosomes for imaging purposes using scanning electron microscopy. The samples were made from young anthers of Arabidopsis thaliana. Preparation of the samples included fixation, contrasting dehydration, drying and subsequent application of a thin layer of metal for better conductivity of the sample. Different methodical approaches were used, compared and critically evaluated. The most appropriate protocol offering the highest possible quality of the resulting chromosome spreads for scanning electron microscopy was selected. MUNI SCI MASARYKOVA UNIVERZITA P R Í R O D O V E D E C K Á FAKULTA KOTLÁŘSKÁ 2, 611 37 BRNO IC: 00216224 D I Ů : CZ00216224 Z A D Á N Í D I P L O M O V É P R Á C E Akademický rok: 2019/2020 Ústav: Ústav experimentální biologie Student: Bc. Petr Janás Program: Molekulární biologie a genetika O b o r Molekulární biologie a genetika Ředitel Ústavu experimentální biologie PřF MU Vám ve smyslu Studijního a zkušebního řádu MU určuje diplomovou práci s názvem: Název práce: Optimalizace přípravy rostlinných meiotických chromozomů pro účely zobrazení pomocí rastrovací elektronové mikroskopie Název práce anglicky: Optimization of plant meiotic chromosome preparation for scanning electron microscopy Oficiální zadání: Předmětem práce je zoptimalizovat přípravu rostlinných meiotických chromozomů pro zobrazovaní s vysokým rozlišením v rastrovacím elektronovém mikroskopu (SEM). Budou porovnány různé způsoby přípravy suspenzí obsahující rostlinné meiotickó chromozomy s ohledem na reprodukovatelnost, kvalitu vstupního materiálu a efektivitu následné přípravy vzorku pro SEM. Dále budou porovnávány různé způsoby zobrazování v SEM za účelem nalezení podmínek, které poskytnou informaci o struktuře chromozomu s co možná nejvyšším rozlišením. Jazyk závěrečné práce: čeština Vedoucí práce: RNDr. Terezie Mandáková, Ph.D. Konzultant: Mgr. Jiří Nováček, Ph.D. Datum zadání práce: 1.10.2019 V Brně d n e : 20.10. 2019 Souhlasím se zadáním (podpis, datum): Bc. Petr Janás student RNDr. Terezie Mandáková, Ph.D. RNDr. Pavel Lízal, Ph.D. vedoucí práce zástupce ředitele Ústavu experimentální biologie pro pedagogické záležitosti Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně pod vedením vedoucího práce s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. V Brně 10. června 2021 Petr Janás Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat své vedoucí diplomové práce RNDr. Terezii Mandákové, Ph.D., Mgr. Jiřímu Nováčkovi, Ph.D. a také Mgr. Martinu Polákovi za cenné rady a pomoc při vypracování této práce. Obsah Úvod 12 1 Chromozomy 13 1.1 Struktura chromozomů 13 1.2 Ultrastruktura 14 1.3 Koheziny a kondenziny 15 2 Buněčný cyklus 18 2.1 Meióza 18 2.1.1 Profáze 1 19 2.1.2 Metafázel 19 2.1.3 Anafázel 20 2.1.4 Telofáze I a cytokineze 20 2.1.5 Meióza II 20 3 Skenovací elektronová mikroskopie 22 3.1 Skenovací elektronový mikroskop 22 3.2 Detekce elektronů a vznik obrazu 23 3.2.1 Neelastický rozptyl 23 3.2.2 Elastický rozptyl 23 4 Cíle diplomové práce 25 5 Materiály a experimentální metody 26 5.1 Materiály 26 5.1.1 Chemikálie 26 5.1.2 Roztoky 26 5.1.3 Přístroje 26 5.2 Biologický materiál 27 5.3 Metody 27 5.3.1 Sběr a fixace materiálu 27 5.3.2 Enzymatické trávení 29 5.3.3 Spread chromozomů a lyže cytoplazmy 29 5.4 Příprava vzorků pro SEM 30 5.4.1 Fixace 30 5.4.2 Kontrastování 30 5.4.3 Dehydratace 31 10 5.4.4 Vysoušení - Critical point drying - CPD 32 5.4.5 Zvýšení povrchové vodivosti vzorku 32 5.5 Výchozí postup 32 5.6 Metody přípravy rostlinných chromozomů 34 5.6.1 Squash technika 34 5.6.2 Drop technika 34 5.6.3 Drop/cryo technika 35 6 Výsledky 36 6.1 Meiotický atlas 36 6.2 Příprava vzorků a optimalizace postupu 37 6.2.1 Postup podle R. Martin et al 38 6.2.2 Základní postup 42 6.2.3 Překrytí krycím sklem 52 6.2.4 Prodloužení působení kyseliny octové 56 6.2.5 Inkubace s kyselinou octovou 59 6.2.6 Fixace před lyží cytoplazmy 70 7 Diskuze 78 7.1 Postup podle R. Martin et al 78 7.2 Základní postup 79 7.3 Překrytí krycím sklem 80 7.4 Prodloužení působení kyseliny octové 80 7.5 Inkubace s kyselinou octovou 80 7.6 Fixace před lyží cytoplazmy 81 8 Závěr 83 9 Zdroje: 84 11 Úvod V dnešní době se pro zobrazování rostlinných chromozomů nejčastěji využívá metod fluorescenční mikroskopie. Ta může poskytovat informace o počtu, tvaru a částečně o struktuře chromozomů. Při studiu přesné topologie a ultrastruktury chromozomů se využívá elektronové mikroskopie. Výhodou elektronové mikroskopie je vysoké rozlišení a vysoká hloubka ostrosti. Při přípravě rostlinných chromozomů pro účely zobrazování pomocí skenovací elektronové mikroskopie je nutno se vyvarovat náhlým změnám prostředí, také je nezbytné se vyhnout jakýmkoliv krokům, které by mohly vést k tomu, že se na povrchu vzorku vytvoří artificiální vrstva překrývající detaily. Detekovány jsou totiž zpětně odražené a sekundární elektrony, které poskytují informace o povrchu vzorku a vznikají nejvýše několik nanometrů pod povrchem vzorku. Optimalizace přípravy rostlinných chromozomů pro účely zobrazování pomocí skenovací elektronové mikroskopie je základním krokem pro vizualizaci jednotlivých stádií kondenzace chromatinu, zkoumání vyšších struktur chromatinu a procesů během meiózy a mitózy. Nutno podotknout, že některé kroky v přípravě se mohou lišit v závislosti na studované čeledi, či rodu rostlin. Ideálním přístupem je potom optimalizace postupu pro jednotlivé druhy rostlin. R. Martin et al. v letech 1994 a 1995 představili postup izolace přípravy rostlinných chromozomů pro účely zobrazování pomocí skenovací elektronové mikroskopie, který se do dnes využívá. Tento postup je však náročný na množství vstupního materiálu a během přípravy může docházet k jeho ztrátám. V mé práci se zabývám optimalizací přípravy rostlinných meiotických chromozomů pro účely zobrazovaní s vysokým rozlišením ve skenovacím elektronovém mikroskopu, s ohledem na efektivitu přípravy vzorku, která přinese co možná nejvyšší rozlišení. 12 1 Chromozomy Chromozomy byly poprvé pozorovány Karlem Wilhelmemvon Nägeli v roce 1842. Strukturu rostlinných mitotických chromozomů popsal v roce 1888 Eduard Strasburger, jejich základní funkci v roce 1902 popsali Theodor Boveri a Walter Sutton. James Watson a Francis Crick v roce 1953 objasnily strukturu dvoušroubovice DNA. F. Thoma et al. v roce 1979 pozoroval elementární lOnm vlákno, Finch a Klug (1976) 30nm solenoidní strukturu a v roce 1991 G. Arents et al. popsali „korálkovitou strukturu" DNA, tedy nukleozomy. 1.1 Struktura chromozomů Průlomem ve zkoumání trojrozměrné struktury chromozomů bylo použití skenovací elektronové mikroskopie (SEM) s vysokým rozlišením (Allen et al, 1986; Sumner a Ross, 1989). Chromozomy j sou složeny přibližně z 1/3 DNA, 1/3 histonových proteinů, 1/3 proteinů nehistonové povahy a asi 10 % RNA (Ball, 2003). Nukleové kyseliny jsou složeny z nukleotidů. Nukleotidy DNA jsou složeny z fosfátové skupiny, 2-deoxyribózy a dusíkaté báze (adenin, guanin, tymin, cytozin). DNA je tvořena dvěma komplementárními řetězci, které jsou propojeny vodíkovými můstky mezi řetězci. Nukleotidy jsou spojeny v řetězec kovalentními vazbami mezi sacharidy a fosfáty, tvoří tak kostru dvoušroubovice DNA (Alberts a Kotyk, 2004; Snustad et al, 2017). Centromery představují tzv. primární konstrikci (zaškrcení) na molekule DNA. Centromery zajišťují rozchod zreplikovaných chromozomů do dceřiných buněk při dělení. Na centromeře se formuje kinetochor, který je na centromerické sekvenci zcela závislý. Kinetochory vznikají během pozdní profáze a zajišťují vazbu na dělící vřeténko (Alberts a Kotyk, 2004). Telomery se nacházejí na obou koncích chromozomů, jedná se o repetitivní sekvence umožňující replikaci konců chromozomů, také brání deoxyribonukleázám, aby odbourávaly konce lineárních molekul DNA a zabraňují fúzi konců s jinými molekulami DNA (Snustad et al, 2017). 13 1.2 Ultrastruktura Proteiny tvořící chromozomy se dělí do dvou tříd: histony a proteiny nehistonové povahy. Je-li chromatin izolovaný z interfázních buněk zkoumán pomocí elektronové mikroskopie, jeví se jako řada za sebou uspořádaných elipsoidních „korálků" neboli nukleozomů propojených navzájem spojovací D N A (Snustad et al., 2017). Nukleozomy jsou tvořeny komplexem osmi histonů 2x (H2A, H2B, H3 a H4). Histony jsou malé kladně nabité proteiny, kladný náboj umožňuje vazbu na záporně nabitou cukr-fosfátovou kostru DNA. Histony jsou evolučně konzervovány, např. histon H4 se u skotu a hrachu liší pouze ve dvou aminokyselinách. Histonový oktamer tvoří proteinové jádro nukleozomů, kolem kterého je DNA stočena. Omotání DNA kolem histonu zkrátí molekulu DNA přibližně na jednu třetinu její původní délky. Za kondenzaci nukleozomů do 30-ti nm vlákna je zodpovědný histon H l , který spojuje sousední nukleozomy (Alberts a Kotyk, 2004). Struktura vysoce kondenzovaných chromozomů je uspořádána kolem proteinů nehistonové povahy, proteinového lešení. Mezi proteiny nehistonové povahy patří koheziny a kondenziny. Společným rysem kondenzovaných chromozomů j sou 10 a 30nm vlákna (Hanks et al., 1983; Maruyama, 1983; Nagai et al., 1982; Utsumi, 1982, 1985; Wanner a Formanek, 2000). 10-ti nm neboli elementární vlákno představuje první úroveň sbalování DNA vlivem nukleozomů (Olins a Olins, 1974; Woodcock et al., 1976). 30-ti nm vlákno představuje druhou úroveň sbalování DNA/kondenzace chromatinu. Jedná se o solenoidní uspořádání elementárního vlákna (Thoma et al., 1979). Solenoidní vlákno je pozorovatelné zejména během mitózy a meiózy, kdy je uspořádáno do paralelních fibril nebo agregováno do chromomerů, kondenzovaných částí chromozomů. (Iwano et al., 1997; Martin et al., 1996; Reznik et al., 1991; Wanner et al., 1991; Wanner a Formanek, 2000; Zoller et al., 2004b). Třetí úroveň sbalování chromozomů představuje sbalování 30nm vlákna pomocí proteinového lešení. Tato kondenzace zřejmě zahrnuje separaci úseků obřích molekul DNA na nezávislé superspiralizované smyčky. Mechanismus třetí úrovně sbalování dosud není znám (Snustad et al., 2017). Během meiózy I je uspořádání chromozomů, formování heterochromatinových uzlů, vyšší komplexita morfologie chromozomů a tvorba synaptonemáního komplexu rozdílná oproti mitóze (Cuvier a Hirano, 2003; Dawe et al., 1994; Loidl, 2011). Naopak meióza II je považována za shodnou s mitózou, kvůli separaci chromatid a stejné organizaci a mechanismu kondenzace DNA (Zoller et al., 2004a). Meióza I a II sdílí některé ultrastrukturální detaily s detaily v mitóze; organizace do vlákna o průměru 10 nm a 30 nm, to poukazuje na univerzálnost kondenzace chromozomů. Paralelně uspořádaná vlákna se vyskytují ve dvou formách. 30 nm 14 solenoidní vlákna barvitelné platinovou modří a 15-30 nm vlákna, která platinovou modří nejsou barvitelná a pravděpodobně se zapojují do dynamiky kondenzace chromozomů (Wanner a Formanek, 2000; Zoller et al., 2004b). Nicméně existuje rozdíl v ultrastruktuře meiotických a mitotických chromozomů. Paralelní vlákna a chromomery j sou u meiotických chromozomů pozorovány s nižší frekvencí než u mitotických chromozomů, což může být vysvětleno tím, že chromatin během meiózy j e kondenzován asi 2x více než během mitózy a tím j sou tyto struktury zakryty (Zoller et al., 2004a). 1.3 Koheziny a kondenziny Komplexy kohezinů tvoří prstencové struktury. Jsou složeny ze dvou SMC proteinů SMC1 a SMC3 a podjednotek Scc3 a Sccl/Rec8 (Klein et al, 1999). Kondenziny jsou proteinové komplexy, které se podílí na kondenzaci chromozomů do samostatných jednotek. Kondenzinové komplexy se skládají z pěti podjednotek. Dvou SMC proteinů a tří CAP proteinů. U kondenzinu I a II SMC2 a SMC4 dimenzují a tvoří strukturu ve tvaru písmene V. Na druhém konci je tato struktura uzavřena proteiny kleiziny CAP-H nebo CAP-H2 a tvoří tak kruhovou strukturu obklopující chromatin (Nasmyth a Haering, 2005). Kleiziny tvoří lešení pro CAP-G a CAP-D2 v kondenzinu I a CAP-G2 a CAP-D3 v kondenzinu II (Obr. 1) (Hudson et al., 2009; Nasmyth and Haering, 2005). SMC proteiny jsou ATPázy schopné měnit topoligii DNA hydrolýzou ATP (Losada a Hirano, 2005). Koheziny jsou nezbytné pro spojení sesterských chromatid až do prvního meiotického dělení, čímž je zajištěno, že během anafáze I dojde k separaci homologních chromozomů, ne sesterských chromatid. U kukuřice, rýže a Arabidopsis jsou potřebné pro správný průběh časné profáze, rekombinace, zarovnání bivalentů na metafázní desce a udržení správné struktury chromozomů. Komplexy kondenzinu hrají zásadní roli při kontrole sbalování chromatinu a organizaci jednotlivých chromozomů. U rostlin jsou informace o úloze kondenzinu v meióze omezené, ale je známo, že jsou vyžadovány pro úspěšné dokončení reprodukčního vývoje (Mainiero a Pawlowski, 2014). Na začátku meiózy se chromozomy kondenzují a individualizují až do vysoce kondenzovaných metafázních chromozomů. Struktura chromozomů je během časné meiotické profáze spojena s interakcemi mezi chromozomy (Yamada a Ohta, 2013). První fáze remodelace chromatinu nastává v leptotene, DNA kondenzuje do tenkých vláken a sesterské chromatidy jsou pevně drženy prostřednictvím kohezinů (Remeseiro aLosada, 2013). 15 Během této fáze je také zahájena rekombinační cesta, kdy protein SPOl 1 zavádí dvouřetězcové zlomy (DSB) do chromozomální D N A (Keeney, 2008). Na konce D N A sousedící s těmito zlomy jsou později navázány RAD51 a DMC1, které katalyzují invazi volných konců DNA do homologních chromozomů (San Filippo et al, 2008). Na přelomu profáze a zygotene chromatinová vlákna expandují a jejich povrch se stává komplexnějším (Dawe et al, 1994). Během párování homologních chromozomů se laterální elementy propojí prostřednictvím synaptonemálního komplexu (Fraune et al, 2012). Během diplotene pokračuje zkracování chromozomů a synaptonemální komplex se rozpadá, jsou viditelná chiasmata. Modifikace histonů a epigenetické změny během meiózy ovlivňují průběh rekombinace a distribuci CO (Choi et al., 2013; Rosa et al., 2013; She et al., 2013). Synaptonemální komplex ovlivňuje rekombinaci i párování homologních chromozomů (Kerzendorfer et al., 2006; Miao et al., 2013; Schommer et al., 2003; Stronghill et al., 2010). Nicméně nej důležitější jsou vyšší struktury sbalování chromozomů, které jsou zodpovědné za kondenzaci a reorganizaci chromozomů. Za vyšší struktury sbalování jsou zodpovědné koheziny akondenziny. Koheziny jsou klíčové pro organizaci chromatinu a vytvoření struktury meiotického chromozomu, která je předpokladem pro párování rekombinaci a soudržnost sesterských chromatid během meiózy (Bai et al, 1999; Bhatt et al, 1999; Cai et al, 2003; Golubovskaya et al, 2006; Shao et al, 2011). 16 Kondenzin Kohezin I Kohezin II Obr. 1 Struktura komplexů kohezinu a kondenzinu. Každý komplex obsahuje 2 proteiny SMC, které heterodimerizují, vytváří kruh spojením kleisinové podjednotky. Zdroj: Mainiero a Pawlowski, 2014, upraveno 17 2 Buněčný cyklus Jde o uspořádaný sled událostí, během kterého buňka zdvojí svůj obsah a pak se dělí na dvě buňky. Buněčný cyklus zahrnuje fázi G l , kdy dochází krustu a zvýšení metabolismu buňky. Následuje fáze S, kdy dojde k syntéze DNA, duplikaci chromozomů a centrozomů. Centrozomy jsou organizátory svazku mikrotubulů, díky kterým vzniká dělící vřeténko. Během G2 fáze se buňka připravuje na vstup do M fáze, kdy dochází ke kondenzaci chromozomů a samotnému dělení buňky - mitóza/meióza. Období během něhož se buňky nedělí a nelze rozeznat jednotlivé chromozomy, tedy G l - S se nazývá interfáze (Alberts a Kotyk, 2004; Snustad et al., 2017). 2.1 Meióza Meióza neboli redukční dělení je proces, při němž je diploidní stádium buňky redukováno na haploidní. Jde o jednu replikaci DNA, po níž následují dvě buněčná dělení, takže zjedné diploidní buňky vznikají čtyři haploidní (Alberts a Kotyk, 2004). Tento proces je u eukaryotických organismů vysoce konzervován. Před spárováním jsou všechny chromozomy replikovány a vznikají dvě sesterské chromatidy. Úspěšné dokončení meiózy je závislé na párování homologních chromozomů, které po spárování tvoří bivalenty/tetrády a dochází ke crossing-overu. Přesné párování poté zajišťuje rovnoměrnou segregaci homologních chromozomů k opačným pólům buňky během prvního meiotického dělení. Chyby v meiotické segregaci vedou k aneuploidiím (Zhang a Han, 2017). Správná segregace chromozomů je dosažena mnoha komplexními změnami na úrovni DNA, chromozomální struktury a jaderné organizace: replikace DNA, párování homologních chromozomů, tvorba proteinového lešení a crossing-over (Scott L. Page a R. Scott Hawley, 2003). Proces meiózy zahrnuje dvě po sobě následující buněčná dělení, I. a II. meiotické dělení (Obr. 2). Při I. meiotickém dělení se od sebe replikované chromozomy oddělují a rozcházejí se do dvou dceřiných buněk. Sesterské chromatidy zůstávají spojeny po celé dělení a chovají se jako celek, rozchází se až během II. meiotického dělení (Alberts a Kotyk, 2004). Během meiózy I je uspořádání chromozomů, formování heterochromatinových uzlů, vyšší komplexita morfologie chromozomů a tvorba synaptonemáního komplexu rozdílná oproti mitóze (Cuvier a Hirano, 2003; Dawe et al., 1994; Loidl, 2011). Naopak meióza lije považována za shodnou 18 s mitózou, kvůli separaci chromatid, stejné organizaci a mechanismu kondenzace DNA (Zoller et al, 2004a). 2.1.1 Profáze I Během leptotene se duplikované chromozomy kondenzují. V elektronovém mikroskopu lze vidět, že každý chromozom se skládá ze dvou sesterských chromatid. Během zygotene jsou homologické chromozomy navzájem těsně spojeny a tvoří se synaptonemální komplex. Synaptonemální komplex se skládá ze tří proteiny tvořených tyčinkovitých útvarů. Z každé strany je spojen laterálními elementy s jedním z chromozomů, uprostřed je útvar nazýván centrální element. Laterální j sou s centrálními elementy propojeny transverzálními vlákny připomínající žebřík. K laterálním elementům z chromozomů vybíhá řada chromatinových smyček. Úloha synaptonemálního komplexu v procesu párování chromozomů dosud nebyla zcela objasněna. Ve fázi pachytene se chromozomy dále kondenzují. Jsou pozorovatelné bivalenty/tetrády. Během této fáze dochází ke crossing - overu. Vznikají dvouřetězcové zlomy, které jsou opravovány cestou homologní rekombinace (Osman et al., 2011). Během crossing overu dochází k reorganizaci genetické informace každého chromozomu v gametě a napomáhá vzniku jedinců se zcela novým uspořádáním genů. Během diplotene se spárované chromozomy oddělují, s výjimkou chiazmat míst, kde došlo během co. k překřížení. V diakinezi dochází k další kondenzaci chromozomů, rozpadu jaderné membrány, mikrotubuly dělícího vřeténka se napojují na kinetochory a chromozomy se pohybují k ekvatoriální rovině (Alberts a Kotyk, 2004; Snustad et al., 2017). 2.1.2 Metafáze I Spárované chromozomy se nachází v ekvatoriální rovině a jsou orientovány k opačným pólům dělícího vřeténka. To zajistí, že se ke každému pólu buňky dostane právě jeden z párů homologických chromozomů (Snustad et al., 2017). 19 2.1.3 Anafáze I Dochází k oddělení chromozomů neboli chromozómové disjunkci a následuje pohyb chromozomů pomocí dělícího vřeténka a umístění v opačných pólech buňky (Snustad et al., 2017). 2.1.4 Telofáze I a cytokineze Dělící vřeténko se rozpadá, je obnoven jaderný obal a dochází k dekondenzaci chromozomů. Dceřiné buňky jsou odděleny (Snustad et al., 2017). U vyšších rostlin je proces cytokineze zcela odlišný od cytokineze živočišných buněk. Buňky jsou obklopeny buněčnou stěnou a uvnitř buňky vzniká nová buněčná stěna, která rozdělí dceřiné buňky. Růst nově vznikající buněčné stěny, kolem které se také tvoří plazmatická membrána, postupně odděluje buňky na dvě dceřiné. Vznik buněčné stěny je řízen fragmoplastem, který je formován ze zbytků polárních mikrotubulů v ekvatoriální rovině starého dělícího vřeténka (Alberts a Kotyk, 2004). 2.1.5 Meióza II Během II. meiotického dělení nedochází k replikaci DNA ani významné interfázi (Alberts a Kotyk, 2004). Meióza II zahrnuje profázi, metafázi a telofázi II a je ukončena cytokinezí. Z mechanického hlediska meióza II připomíná mitózu s tím rozdílem, že takto vzniklé buňky jsou haploidní a nejsou geneticky identické (Snustad et al., 2017). 20 A D g, * V ^ E • U } f ? '• • > - O o G *> i Obr. 2 Fáze meiózy u žita (Secale cereále). A - leptotene, B - zygotene, C - pachytene, D - diakineze, E metafáze I, F - anafáze I, G - telofaze I, H - profáze II, G - telofaze II. Zdroj: Wanner a Schroeder-Reiter, 2008 21 3 Skenovací elektronová mikroskopie Skenovací neboli rastrovací elektronová mikroskopie umožňuje vizualizaci chromozomů jako strukturních celků. Vizualizace odlišných stádií kondenzace chromatinu s vysokým zvětšením umožňuje zkoumat vyšší struktury chromatinu a procesy během mitózy a meiózy (Wanner a Schroeder-Reiter, 2008). Elektronová mikroskopie umožňuje sledovat podjednotky chromozomů se lOOkrát vyšším rozlišením ve srovnání se světelnou mikroskopií (Wanner a Schroeder-Reiter, 2008). Části chromozomů lze také studovat pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM), nebo transmisní elektronové mikroskopie za kryo-podmínek (kryo-TEM), a to zejména za účelem strukturní charakterizace nukleozomů a strukturních elementů jako jsou solenoidy. Celková charakterizace chromozomů pomocí T E M je omezena jejich velikostí a vyžaduje přípravu tenkých řezů chromozomů s maximální tloušťkou okolo 300 nm (štandartne pak 70 nm) (Ris a Witt, 1981). 3.1 Skenovací elektronový mikroskop Skenovací elektronový mikroskop se skládá z elektronové trysky, jedné až tří kondenzorových čoček, rastrovacích cívek, objektivové čočky, detektoru elektronů deflektorů, které jsou umístěny ve vakuové komoře s pohyblivým stolkem. Optická soustava mikroskopu vytváří zmenšený obraz zdroje, kterým je vzorek skenován. Pro rutinní zobrazování v SEM se používá elektronová tryska s katodou z wolframového vlákna, které je procházejícím proudem zahřáto na více něž 2500 °C, čímž dochází k emisi elektronů. Mezi termoemisní zdroje taktéž patří katoda lanthanum hexaboridu (LaB6), její výhodou je delší životnost. Zdrojem elektronů s nejvyšším jasem a koherencí elektronového svazkuje pak autoemisní tryska (field emission gun - FEG) (Schatten, 2011; Schatten a Pawley, 2008; Vernon-Parry, 2000). Elektronová tryska vytváří proud elektronů, který je následně akcelerován na energie v rozsahu 1 až 30 keV. V komoře rastrovacího elektronového mikroskopu interagují takto urychlené elektrony se vzorkem. V důsledku této interakce mimo jiné dochází ke zpětnému odrazu elektronů nebo vzniku sekundárních elektronů, které tvoří hlavní zdroj signálu v rastrovací elektronové mikroskopii (Khursheed, 2010; Vernon-Parry, 2000). 22 3.2 Detekce elektronů a vznik obrazu Obraz vzniká skenováním vzorku úzkým vysokoenergetickým paprskem elektronů. Interakce svazku elektronů s atomy na povrchu vzorku vytváří signály, které obsahují informace o topografii a charakteristických vlastnostech povrchu. Dopadající elektronový paprsek interagující se vzorkem produkuje emise sekundárních elektronů s nízkou energií (<50 eV), zpětně odražených elektronů (BSE), Augerových elektronů, fotonů a rentgenového záření (Obr. 3) (Schatten, 2012). 3.2.1 Neelastický rozptyl Zahrnuje procesy, které redukují energii paprsku elektronů. Tato energie je předána atomům vzorku. Dochází tak ke vzniku sekundárních elektronů (secondary electrons - SE), charakteristického rentgenového záření a Augerových elektronů. Sekundární elektrony jsou hlavním zdrojem signálu detekovaným v rastrovací elektronové mikroskopii. Kinetická energie SE je nízká, což ovlivňuje hloubku vzorku, ze které mohou uniknout. S uraženou vzdáleností se energie SE snižuje. Detekovatelné SE vznikají na povrchu vzorku, případně několik nanometrů pod povrchem vzorku a nesou primárně informaci o topografii vzorku. (Goldstein et al, 2017). 3.2.2 Elastický rozptyl Elastický rozptyl nastává, když je paprsek elektronů vychýlen. Během elastického rozptylu dochází i ke vzniku zpětně odražených elektronů (back-scattered electrons - BSE). Množství zpětně odražených elektronů závisí na atomovém čísle Z prvků, ze kterých se skládá zkoumaný vzorek a energii elektronů. Detekované BSE tak nesou informaci, jak o chemickém složení vzorku, tak i o jeho topografii (Goldstein et al., 2017). V SEM jsou pro zobrazení chromozomů nejčastěji detekovány zpětně odražené elektrony (BSE) a sekundární elektrony (SE), které poskytují informace o topografii a ultrastruktuře (Wanner a Schroeder-Reiter, 2008). Pro detekci signálů SE se používá Everhart - Thornley detektor, pro detekci BSE scintilační nebo polovodičový detektor. Pro sledování 23 biologických struktur s vysokým rozlišením je optimální nízké napětí, pod 5 kV (Schatten, 2012). Primární elektrony Obr. 3 Schéma znázorňující emisi signálů po interakci primárních elektronů se vzorkem. Zdroj: Schatten, 2012, upraveno 24 4 Cíle diplomové práce (1) Porovnání publikovaných metodických přístupů zaměřených na přípravu rostlinných chromozomů pro účely zobrazovaní s vysokým rozlišením v rastrovacím elektronovém mikroskopu. (2) Jejich zhodnocení a využití relevantních poznatků. (3) Optimalizace přípravy meiotických chromozómových preparátů pro účely zobrazovaní s vysokým rozlišením v rastrovacím elektronovém mikroskopu. (4) Prvotní vhled do struktury meiotických chromozomů v SEM a následné zhodnocení dosažených výsledků v průběhu optimalizace. 25 5 Materiály a experimentální metody 5.1 Materiály 5.1.1 Chemikálie aceton ethanol citronan sodný celuláza pektolyáza cytohelikáza glutaraldehyd kyselina octová trihydrát kakodylátu sodného uranyl acetát platinová modř 5.1.2 Roztoky Carnoyova fixáž (3:1 v/v ethanol:kyselina octová) citrátový pufr (100 mM citronan sodný pH 7,4) enzymatická směs (0.3% pektolyáza "Y-23" (Duchefa Biochemie, cat. no. P8004), 0.3% celuláza "Onozuka R-10" (SERVA, cat. no. 16419.03), 0.3% cytohelikáza (Sigma, cat. no. C8274) v citrátovém pufru) kakodylátový pufr (75mM trihydrát kakodylátu sodného, pH 7,4) fosfátový pufr (PBS) (pH 7,4) fixační roztok (2,5% glutaraldehyd v kakodylátovém pufru/PBS) uranyl acetát/platinová modř (2% roztok) 5.1.3 Přístroje stereolupa optický mikroskop (Carl Zeiss, Axio Lab.Al) 26 fluorescenční mikroskop (Carl Zeiss, Axio Imager Z2) skenovací elektronový mikroskop (FEI, Versa 3D) laboratorní třepačka exikátor inkubátor sputter coater CPD (Quorum Technologies, K850 Critical Point Dryer) heat plate 5.2 Biologický materiál Chromozomy byly izolovány z mladých květenství húseničku rolního {Arabidopsis thaliana, čeleď Brassicaceae). Huseníček rolní má pět párů chromozomů (2n = 10) a génom o velikosti 135 Mb. Obr. 4 Huseníček rolní {Arabidopsis thaliana) Zdroj: https://upload.wikimedia.0rg/wikipedia/commons/6/6f/Arabidopsis_thaliana.jpg 5.3 Metody 5.3.1 Sběr a fixace materiálu Fixace je proces, při kterém jsou zastaveny všechny procesy a metabolické aktivity v buňce. Každá fáze buněčného cyklu je tedy díky fixaci zachycena v okamžiku, kde byla v 27 době fixace. Cílem fixace je zachovat buňku nebo její části v původním stavu, důležitá je schopnost rychlé penetrace a zachování buněčných struktur (Kashtwari et al., 2017). Nej používanější fixáží je 70 - 100% ethanol, který nereaguje s makromolekulami, ale působí jako dehydratační činidlo. Odstraňuje z tkáně molekuly vody, čímž stabilizuje proteiny a tím je činí nerozpustnými. Nerozpustné proteiny poté agregují a tvoří sraženiny, podobně reaguje i s DNA (Fischer, 1899; Kashtwari et al., 2017). Nevýhodou ethanolu je, že tkáň příliš smršťuje a vytvrzuje. Z tohoto důvodu je používán v kombinaci s fixativy, které tyto vlastnosti eliminují, např. s kyselinou octovou (Baker, 1933). Kyselina octová sráží nukleové kyseliny, rozkládá histony, ale nefixuje proteiny (Pischinger, 1937). Navzdory těmto skutečnostem je ideálním fixačním činidlem pro chromozomy, nicméně způsobuje zvětšování buněčných struktur včetně chromozomů, proto se používá v kombinaci s fixativy, které naopak buněčné struktury smršťují, tedy např. s výše zmíněným ethanolem (Kashtwari et al., 2017). Carnoyova fixáž (3:1 ethanol:kyselina octová) je jednoduchý a účinný fixační prostředek pro preparáty zhotovované z jader a mitochondrií buněk. Carnoyova fixáž je jedna z nej starších známých fixačních směsí, která byla poprvé použita J. A. Clarkem a S. Sollym v roce 1851 a její použití poprvé publikoval J. B. Carnoy v roce 1886. Jak je uvedeno výše, samotná kyselina octová nebo ethanol nejsou dobrými fixačními činidly, ale jakmile jsou smíchány ve vhodných poměrech, odstraní se jejich nevýhody. Ethanol způsobuje smršťování tkáně, fixuje cytoplazmu, ale ponechává nukleoproteiny nefixované; kyselina octová způsobuje zvětšování a změkčování buněčných struktur, nefixuje cytoplazmu, ale fixuje nukleoproteiny. Tato vzájemná kombinace dvou fixativ dává této směsi široké uplatnění jak u rostlinných, tak u živočišných vzorků (Kashtwari et al., 2017). Carnoyova fixáž musí být vždy připravená čerstvá, Carnoyova fixáž není stabilní a může docházet k esterifikaci kyseliny octové (Bhat a Wani, 2017; Mandáková a Lysák, 2016). Pro přípravu vzorků byla použita mladá květenství s většinou uzavřených poupat s bílými prašníky, která byla po odebrání z pěstovaných rostlin húseničku rolního vložena do čerstvě připravené Carnoyovy fixáže I. Rostlinný materiál byl fixován při pokojové teplotě nebo při 4 °C (10-14 hodin). Fixáž byla několikrát vyměněna, dokud poupata nezbělala a fixativ zůstal čirý. Následně byl fixativ vyměněn za 70% ethanol a materiál byl skladován při teplotě -20 °C. Takto připravená květenství byla bílá, květy s vyvinutými pylovými zrny byly žluté (Obr. 5). (Mandáková a Lysák, 2016). 28 Obr. 5 Fixovaná květenství húseničku rolního {Arabidopsis thaliana) Zdroj: (Mandáková a Lysák, 2016). 5.3.2 Enzymatické trávení Enzymatické trávení bylo provedeno působením pektolytických enzymů (0,3% pektolyáza, 0,3% celuláza, 0,3% cytohelikáza v citrátovém pufru). Pektolyáza katalyzuje štěpení pektinu. Celuláza katylazuje štěpení celulózy a licheninu. Cytohelikáza taktéž podporuje rozklad buněčné stěny a interaguje s chromatinem, čímž zlepšuje adhezi synaptonemálních komplexů k hydrofobním plastům. Účinkem této směsi je tedy rozložení buněčných stěn. (Baldwin a Pressey, 1989; Elbouami, 2001; Wood a Bhat, 1988). 5.3.3 Spread chromozomů a lyže cytoplazmy Pomocí preparačních jehel byla jednotlivá květenství rozsuspendována na podložním skle, následně byly pomocí pinzety odstraněny nerozsuspendované zbytky květenství. Poté byla na preparát nakápnuta kyselina octová a došlo k lyži cytoplazmy buněk. Po lyži byly preparáty fixovány v Carnoyově fixáži. Alternativou pro tvorbu suspenze může být rozrušování buněčných stěn již během působení pektolytických enzymů viz. 5.6.2. 29 5.4 Příprava vzorků pro SEM Kritické kroky pro přípravu vzorků pro SEM jsou fixace, dehydratace a zvýšení vodivosti vzorku. Adekvátní příprava vzorku je kriticky důležitá pro udržení strukturální integrity a získání spolehlivých informací o buněčných složkách a molekulárním složení. Spatná a neadekvátní příprava vzorků nepochybně způsobuje artefakty a může vést k nesprávným výsledkům a interpretaci informací (Schatten, 2012). 5.4.1 Fixace Nejčastěji se biologické vzorky fixují aldehydy, jako je 2% paraformaldehyd, 2% glutaraldehyd v 0,1 M fosfátovém pufru (PBS) (Schatten, 2011). Aldehydy „zesíťují" volné aminoskupiny polypeptidů a amino-lipidů, a také „zesíťují" histony, tvoří s nimi kovalentní vazby, čímž fixují strukturu chromatinu vdané fázi kondenzace. Nejrychleji jsou fixovány histony bohaté na lysin (Johnson, 1985; Chalkley a Hunter, 1975). 5.4.2 Kontrastování Uranyl acetát byl jedním z prvních kontrastních činidel, která byla použita k barvení vzorků pro elektronovou mikroskopii (Watson, 1958). Platinová modř selektivně reaguje s nukleovými kyselinami, zejména s DNA (Kôpf-Maier and Kôpf, 1986; Aggarwal et al., 1975). Ke kontrastování se využívá i osmium tetroxid. Chromozomy ve všech fázích kondenzace obarvené platinovou modří jsou při detekci BSE v SEM kontrastní s pozadím, tedy jasně viditelné i při malém zvětšení (Obr. 6) (Wanner a Formanek, 1995). 30 Obr.6 Srovnání kontrastních činidel. A - bez kontrastování B - osmium tetroxid C - uranyl acetát D - platinová modř Zdroj: Wanner a Formanek, 1995 5.4.3 Dehydratace Dehydratace je nezbytná pro přípravu vzorků a prohlížení ve vakuu. Vzorky se obvykle dehydratují pomocí ethanolu či acetonu. Dehydratační řadou nebo 100% ethanolem / acetonem. Je nezbytné, aby během dehydratace došlo k odstranění veškeré vody. Zbytky vody ve vzorku mohou vyvolat tvorbu artefaktů (Ris, 1985). Dehydratace může být škodlivá pro biologické struktury, protože struktura makromolekuly je stabilizována vodíkovými vazbami s molekulami vody. Narušení těchto interakcí nahrazením vody za jiný solvent může vést ke smrštění nebo potrhání vzorku (Schatten, 2012). Během přípravy nesmí dojít k vyschnutí vzorku. Například při vyschnutí vzorku po fixaci Carnoyovou fixáží se na povrchu vzorku vytvoří tenká vrstva. Která zcela zakryje všechny ultrastrukturální detaily chromozomů (Sumner, 1991). Tato vrstva je pravděpodobně způsobena esterifikací ethanolu a kyseliny octové (Wanner a Schroeder-Reiter, 2008). 31 5.4.4 Vysoušení - Critical point drying - CPD Kritický stav nastává při dané teplotě a tlaku v kritickém bodě, v tomto stavu není rozlišitelný rozdíl mezi kapalným a plynným skupenstvím látky. Povrchové napětí je zredukováno na nulové hodnoty, toho může být využito při vysoušení biologických vzorků. V biologických vzorcích je nej častější výskyt vody, kritický bod vody je ale nevhodný, protože nastává při vysokém tlaku a teplotě. Nejčastěji se pro CPD používá oxid uhličitý, u něhož kritický bod nastává při 31 °C a 7.3773 MPa. CO2 však není mísitelný s vodou, proto se používá přechodné médium (předchází krok dehydratace), obvykle aceton nebo ethanol ("K850 Critical Point Dryer | Quorum Technologies," .). 5.4.5 Zvýšení povrchové vodivosti vzorku Pokovení je při přípravě biologických vzorků zásadní, protože většina biologických struktur má izolační vlastnosti. Pokovení vzorku snižuje efekt nabíjení (Hermann a Muller, 1991). Pro nanesení tenké kovové vrstvy se používají těžké kovy nebo těžké kovové sloučeniny - zlato, zlato / palladium, platina, wolfram, grafit a další (Walther, 2008). Pokovení se provádí odpařováním ve vysokém vakuu nebo naprašováním při nízkém vakuu (sputter coating). Vodivost vzorku může být také zvýšena barvící metodou OTO (osmium, thiokarbohydrazid, osmium) (Malick et al., 1975; Seligman et al., 1966). Coating taktéž zvyšuje kontrast sledovaných struktur (Schatten, 2011). 5.5 Výchozí postup Příprava skel: Skla byla nejprve očištěna pomocí destilované vody a následně ethanolu. Na skla byla poté naprášena 10 nm vrstva uhlíku, pro zvýšení vodivosti vzorku a adhezivity na povrch. Enzymatické trávení: Fixovaná květenství byla umístěna na Petriho misku do přiměřeného množství destilované vody, následně byl pod stereolupou odstraněn přebytečný materiál (poupata se žlutými prašníky obsahující pyl). Poté byla vybraná květenství umístěna do trávící komůrky, dvakrát promyta v destilované vodě a dvakrát v citrátovém pufru na třepačce po dobu 5 minut. Citrát byl nahrazen směsí pektolytických enzymů, jejichž aktivita je nejvyšší při 37 °C, proto byla komůrka překrytá sklíčkem zabraňující odparu enzymů vložena do inkubátoru 32 nastaveném na tuto teplotu po dobu 3 h nebo déle. Po uplynutí této doby byla směs enzymů nahrazena citrátovým pufrem (Mandáková a Lysák, 2016). Spread chromozomů a lyže cytoplazmy: Prostřednictvím Pasteurovy pipety bylo natrávené květenství přeneseno na mikroskopické podložní sklíčko. Následně bylo květenství pod stereolupou pomocí preparační jehly rozrušeno za vzniku suspenze. Do suspenze bylo přidáno předem určené množství 60%/45% kyseliny octové. Sklíčko bylo umístěno na heat plate nastaveném na 50 °C a suspenze byla preparační jehlou krouživým pohybem jemně roztírána po předem stanovenou dobu. Kyselina octová rozpouští proteiny a cytoplazmatické složky. Příliš malý objem kyseliny octové a / nebo příliš krátká doba působení může mít za následek chromozomy a jádra obklopené cytoplazmou (Mandáková a Lysák, 2016). Poté bylo sklíčko umístěno do Petriho misky s Carnoyovou fixáží I. Fixace: Vzorky byly fixovány v 2,5% roztoku glutaraldehydu (15 min). Roztok glutaraldehydu byl ředěn v závislosti na použití kontrastního činidla. V případě použití uranyl acetátu byl roztok ředěn kakodylátovým pufrem, fosfátový pufr v tomto případě není možné použít, jelikož v přítomnosti fosfátových iontů je uranyl acetát precipitován, a je tak zamezena jeho vazba na DNA (Kuo, 2014). Pří kontrastování platinovou modří byl roztok glutaraldehydu ředěn PBS pufrem. Odmývací krok č. 1: Přenos vzorků do kakodylátového pufru/PBS (10 min). Odmývací krok č. 2: Přenos vzorků do deionizované vody (10 min). Kontrastování: V této práci byl ke kontrastování použit 2% vodný roztok uranyl acetátu nebo platinové modře. Kontrastování probíhalo 30 min v tmavém prostředí. Odmývací krok č. 3: Přenos vzorků do deionizované vody (30 s). Odmývací krok č. 4: Přenos vzorků do deionizované vody (10 min). Dehydratace: Vzorky byly dehydratovány nejprve ve směsi ethanolu s acetonem v poměru 1:1 a následně třikrát v acetonu nebo před přenesením do směsi ethanolu s acetonem předcházela dehydratační řada (25, 50, 75, 100% ethanol). Vzorky byly dehydratovány po dobu 10 min v každém z roztoků. Vysoušení/CPD: Pro provedení CPD bylo v této práci využito přístroje Quorum technologies K850. Bylo postupováno podle protokolu doporučeném výrobcem. Coating: Vzorky byly pokoveny 2-3 nm platiny, zlata, či zlata/paladia. 33 5.6 Metody přípravy rostlinných chromozomů V minulosti byly rostlinné preparáty pro sledování pod SEM zhotovovány mnoha technikami. Z coenocytických fází Haemanthus katherinae (Heneen 1981,), z izolovaných protoplastů nebo předem fixovaných chromozomů/jader (Chapman a Cooke, 1983; Hadlaczky et al., 1983) nebo z hluboce zmražených a následně rozdrcených prašníků Solanum tuberosum a Lilium hybrid (Whelan et al. 1974). Nevýhodou těchto metod bylo zejména pozorování jednotlivě oddělených chromozomů a/nebo překrytí zbytky buněčných obalů. Pro spread chromozomů je kritická těkavost fixačního činidla (3:1) a adhezivita na povrch sklíčka během odpařování fixativu a sušení na vzduchu. Nicméně při sušení na vzduchu vzniká tenká artificiální vrstva (několik nanometrů), která kompletně překryje ultrastrukturální detaily chromozomů (Allen et al., 1988; Sumner, 1991). Tato vrstva je pravděpodobně způsobena esterifikací ethanolu a kyseliny octové. Navíc sušení na vzduchu často vede ke zplošťování chromozomů, díky kapilárním silám, což brání studiu 3D struktur (Wanner a Schroeder-Reiter, 2008). 5.6.1 Squash technika Squash technikou se rozumí, kdy po působení pektolytických enzymů na rostlinné buňky, tedy po natrávení buněčné stěny, se materiál přenese na sklíčko, kde se většinou pomocí preparační jehly rozsuspenduje. Tímto způsobem je vytvořena suspenze protoplastů přímo na sklíčku, se kterým se bude dále pokračovat v přípravě preparátu. G. Wanner et al. v letech 1990, 1991 po použití této techniky sledovali rostlinné chromozomy s vysokým rozlišením. Nicméně pozorování kompletních sestav chromozomů bylo opět relativně vzácné. 5.6.2 Drop technika Zavedení nakapávací techniky P. F. Ambrosem et al. v roce 1986 bylo velkým pokrokem pro izolaci chromozomů. Rostlinný materiál je rozrušován již během trávení ve směsi pektolytických enzymů. Následně je pro odstranění nečistot/zbytků buněčných stěn suspenze filtrována, centrifugována a opět resuspendována. Takto připravená suspenze je následně nakapávána na sklíčka (Dillé et al., 1990; Falconi et al, 2006; Kättstrôm a Nilsson, 1992). 34 5.6.3 Drop/cryo technika Průlomem pro SEM chromozomů byla modifikace nakapávací techniky - přidání kroku zmrazení a vynechání veškerého sušení na vzduchu. Jedná se o drop techniku upravenou podle Martin et al. 1994. Pro tuto techniku zůstává zásadní fixace ethanolem/kysehnou octovou. Tato technika byla použitelná pro všechny dosud studované rostliny, záleží ale na kvalitě spreadu chromozomů, množství zbytků nukleoplazmy, druhu rostliny a kondenzaci chromatinu (Luckner a Wanner, 2018; Schroeder-Reiter et al., 2009; Wanner et al., 2015; Wanner a Schroeder-Reiter, 2008; Zoller et al., 2004b). Zdá se, že významným faktorem pro spread chromozomů je jejich velikost. Chromozomy v rozmezí 5-10 nm dispergují velmi dobře. Velmi malé nebo velké (Arabidopsis 1-3 nm nebo Trillium 20 nm) mají tendenci se shlukovat nebo překrývat. Všechny parametry pro tuto techniku proto musí být optimalizovány pro různé druhy. Tuto techniku lze také použít na živočišné chromozomy, ty ale až na několik výjimek vykazují významně větší množství nukleoplazmy než rostliny (Wanner a Schroeder-Reiter, 2008). Tato metoda obchází nevýhody squash a drop techniky jako je vrstva překrývající chromozomy nebo zplošťování struktur vlivem vyschnutí na vzduchu. Naopak nevýhodou je použití velkého množství vstupního materiálu. 35 6 Výsledky Cílem této práce bylo zoptimalizovat metodu pro přípravu rostlinných meiotických chromozomů pro účely zobrazování s vysokým rozlišením pod skenovacím elektronovým mikroskopem. Kvalita preparátů a lokalizace chromozomů byla nejprve vyhodnocována pod světelným mikroskopem, tedy s nízkým rozlišením. Následně byly preparáty hodnoceny pod SEM. Vysoké rozlišení tedy odpovídalo pozorování jednotlivých vláken chromozomů, respektive chromatid a jejich povrchových struktur. 6.1 Meiotický atlas Při přípravě meiotického atlasu jsem postupoval podle kapitoly 5.5 („fixace" a další kroky byly vynechány). Poté jsem preparáty nafotil pod fázovým kontrastem (Obr 6.1.1). Následně jsem na sklíčka nakápnul přiměřené množství DAPI, přikryl krycím sklíčkem a nafotil pod fluorescenčním mikroskopem (Obr. 6.1.2). Obr. 6.1.1. Fáze meiózy pod fázovým kontrastem. A - H profáze I, A - leptotene, B - zygotene, C - pachytene, D - diplotene, E - diakineze, F - metafáze I, G - anafáze I, H - telofáze I, I - profáze II, J - metafáze II, K anafáze II, L - telofáze II, M - čtyři haploidní jádra (měřítko: 10 um) 36 A J ' " bé. B • v < •f. D E y > F G 1 H * 1 •• J V • K v M Obr. 6.1.2. Fáze meiózy pod fluorescenčním mikroskopem. A - H profáze I, A - leptotene, B - zygotene, C pachytene, D - diplotene, E - diakineze, F - metafáze I, G - anafáze I, H - telofáze I, I - profáze II, J - metafáze II, K - anafáze II, L - telofáze II, M - čtyři haploidní jádra (měřítko: 10 ^im) 6.2 Příprava vzorků a optimalizace postupu V roce 1994 R. Martin et al. přišli s protokolem poskytující relevantní výsledky. Tato metoda je dodnes úspěšně využívána v mnoha studiích. Tato práce vychází z metody popsané v T. Mandáková a M . Lysák (2016). Metoda T. Mandákové a M . Lysáka je určena především pro přípravu rostlinných chromozomů a následnou analýzu pod světelným a fluorescenčním mikroskopem. Šlo by tedy o rozšíření této metody na použití pro SEM s ohledem na využití nižšího množství vstupního materiálu oproti R. Martin et al. (1994). Pro lepší orientaci na sklíčku byly preparáty připravovány na laserem značená skla se souřadnicemi. Příprava probíhala v digestoři při pokojové teplotě. Během přípravy bylo důležité, aby mezi jednotlivými kroky nedošlo k vyschnutí vzorku. Hotové preparáty byly uchovány v exikátoru se silikagelem při tlaku 6 • 10"2 Pa. Důvodem byla snaha vyhnout se absorpci atmosférické vlhkosti vzorkem (Kuo, 2014). Snímky byly pořizovány ve FIB/SEM mikroskopu FEI Verša 3D. Preparáty byly pomocí vodivé lepící pásky připevněny na stolek mikroskopu, následně byla pořízena navigační fotografie pro lepší orientaci na vzorku (Obr. 6.2.1). Po uzavření komory mikroskopu byla 37 vyčerpána na tlak 3 104 Pa. Snímky byly pořizovány při napětí 2 kV a byly detekovány sekundární elektrony (SE). Obr. 6.2.1 Sklíčka připevněná na stolek SEM mikroskopu pomocí vodivé pásky 6.2.1 Postup podle R. Martin et al. Natrávená květenství byla přenesena na sklíčka, kde byla pomocí preparační jehly rozsuspendována. Následně byla na sklíčka nakápnuta Carnoyova fixáž (40 ul), nejprve několik kapek kolem suspenze a poslední do kapky suspenze. Těsně před odparem fixáže byla na sklíčka nakápnuta 45%/60% kyselina octová (40 ul) a vzorek byl překryt krycím sklíčkem. Případné přebytky kyseliny octové byly odsáty papírovým ubrouskem. Po uplynutí předem stanovené doby byly takto připravené preparáty ponořeny do tekutého dusíku. Krycí sklíčko bylo poté odstraněno a vzorek byl ihned přenesen do 2,5% roztoku glutaraldehydu. Dále bylo postupováno od „odmývacího kroku č. 1" uvedeno v kapitole 5.5. Rozdílem oproti R. Martin et al. 1994 bylo použití squash techniky. Suspenze buněk byla tedy vytvořena až na podložním skle. Suspenze také nebyla předem fixována v Carnoyově fixáži. 38 Obr 6.2.1.1 Buňky s částečně odstraněnými buněčnými obaly. Struktury jsou deformovány. Šipky označují buněčný debris/zbytky buněk, které se při tomto postupu vyskytovaly ve velkém množství. Doba působení 45% kyseliny octové: 30 s. (měřítko: 30 um) Obr 6.2.1.2 Šipky označují fixované buňky s částečně odstraněnými buněčnými obaly. Po celém povrchu preparátu se vyskytovalo velké množství zbytků buněk. Doba působení 45% kyseliny octové: 30 s (měřítko: 50 um) 39 Obr. 6.2.1.3 Buňky s částečně odstraněnými buněčnými obaly. Struktury jsou také deformované. Doba působení 45% kyseliny octové: 2 min. (měřítko 20 um) Obr. 6.2.1.6 Šipky označují deformované buňky/zbytky buněk. Doba působení 60% kyseliny octové: 2 min. (měřítko: 40 um) 41 6.2.2 Základní postup Zde bylo postupováno podle kapitoly 5.5. Obr. 6.2.2.2 Buňka překrytá vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 20 \im) 42 Obr. 6.2.2.3 Buňka s pravděpodobně částečně odmytou cytoplazmou. Struktura je zploštěná vyschnutím na vzduchu nebo překrytím vrstvou při kroku lyže a spread cytoplazmy. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 20 um) Obr. 6.2.2.4 Buňka s zčásti odmytou cytoplazmou, z části cytoplazma odmyta nebyla anebo došlo k částečnému prischnutí či překrytí vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 60 s. (měřítko 10 um) 43 Obr. 6.2.2.5 Šipka označuje buňku, u které nedošlo k odmytí cytoplazmy. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 20 um) Obr. 6.2.2.6 Buňka s částečně odmytou cytoplazmou. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 10 um) 44 Obr. 6.2.2.7 Buňka s částečně odmytou cytoplazmou a následné zploštění struktury (u tohoto preparátu nebylo využito CPD). Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 10 um) 45 Obr. 6.2.2.9 Buňky s odmytou cytoplazmou. Šipky označují jádra buněk. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 20 um) Obr. 6.2.2.10 Mitotické chromozomy, profáze. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 5 um) 46 Obr. 6.2.2.11 Anafáze. Zde došlo k odmytí cytoplazmy a následnému překrytí vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 10 ^im) Obr. 6.2.2.13 Anafáze. Zde došlo k odmytí cytoplazmy a následnému překrytí vrstvou. Šipky označují chromozomy v opačných pólech buňky. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 5 Lim) Obr. 6.2.2.14 Profáze I, zygotene/pachytene. Zde došlo k odmytí cytoplazmy, následnému překrytí vrstvou. Doba působení 45% kyseliny octové: 60 s (měřítko 5 Lim) 48 Obr. 6.2.2.15 Profáze I, zygotene/pachytene. Zde došlo k odmytí cytoplazmy a následnému překrytí vrstvou. Doba působení 45% kyseliny octové: 60 s (měřítko 5 ^im) Obr. 6.2.2.16 Profáze I, leptotene/zygotene. Zde došlo k odmytí cytoplazmy a následnému překrytí vrstvou. Doba působení 45% kyseliny octové: 60 s (měřítko 5 ^im) 49 Obr. 6.2.2.17a Profáze I, diplotene. Došlo k odmytí cytoplazmy, struktura je spíše zploštěná vlivem vyschnutí na vzduchu během přípravy. Šipky označují viditelné chromozomy. Doba působení 60% kyseliny octové: 60 s (měřítko 10 um) Obr. 6.2.2.17b Profáze I, diplotene. (měřítko 5 um) 50 Obr. 6.2.2.18a Interfázní jádro premeiotické buňky. Doba působení 60% kyseliny octové: 30 s. (měřítko 10 um) 6.2.3 Překrytí krycím sklem Bylo postupováno podle kapitoly 5.5. S úpravou kroku spread chromozomů a lyže cytoplazmy: suspenze nebyla preparační jehlou krouživým pohybem jemně roztírána. Na místo tohoto kroku bylo na suspenzi buněk nakápnuto 40^1 60% kyseliny octové, preparát byl překryt krycím sklíčkem a umístěn na ploténku při 50 °C nebo byly takto připravené preparáty ponechány při pokojové teplotě po předem stanovenou dobu. Poté bylo sklíčko umístěno do Petriho misky s Carnoyovou fixáží I, kde bylo krycí sklíčko odstraněno. Dále bylo postupováno od „fixace" uvedeno v kapitole 5.5. Obr. 6.2.3.1 Deformované buňky. Plazmatická membrána/cytoplazma je „srolovaná". Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min při pokojové teplotě, (měřítko 40 um) 52 Obr. 6.2.3.2 Šipky označují „srolované" buněčné obaly/obsah buněk. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min při 50 °C. (měřítko 30 um) Obr. 6.2.3.3 „Srolované" zbytky obsahu buněk. Doba působení 60% kyseliny octové: 10 min při pokojové teplotě, (měřítko 20 um) 53 Obr. 6.2.3.4 „Srolované" zbytky cytoplazmy. Šipky označují jádra buněk. Doba působení 60% kyseliny octové: 10 min při 50 °C. (měřítko 20 um) Obr. 6.2.3.5 Mitóza, profáze. Doba působení 60% kyseliny octové: 10 min při 50 °C. (měřítko 4 um) 54 Obr. 6.2.3.6 Anafáze. Doba působení 60% kyseliny octové: 10 min při 50 °C. (měřítko 3 um) 55 6.2.4 Prodloužení působení kyseliny octové Bylo postupováno podle kapitoly 5.5. S úpravou kroku spread chromozomů a lyže cytoplazmy: suspenze byla preparační jehlou krouživým pohybem jemně roztírána ve dvojnásobném množství kyseliny octové, resp. po delší dobu při 50 °C. Poté bylo sklíčko umístěno do Petriho misky s Carnoyovou fixáží I. Dále bylo postupováno od „fixace" uvedeno v kapitole 5.5. Obr. 6.2.4.1 Rozdílně viditelné buňky: 1,2 - pod vrstvou, 3 - fixace na povrchu preparátu. Doba působení 60% kyseliny octové: 2 min (měřítko 30 ^im) 56 Obr. 6.2.4.2 Fixované buňky pod vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 2 min. (měřítko 40 Lim) Obr. 6.2.4.4 Interfázní jádro. Doba působení 60% kyseliny octové: 2 min. (měřítko 10 jun) 6.2.5 Inkubace s kyselinou octovou Spread chromozomů a lyže cytoplazmy: Kapka suspenze buněk s kyselinou octovou (60 ul) byla ponechána inkubovat po danou dobu. Nebo byla po této inkubaci aktivita kyseliny octové podpořena rychlým roztěrem preparační jehlou 10 s při 50 °C. Nebo byla suspenze preparační jehlou krouživým pohybem jemně roztírána za pokojové teploty po předem stanovenou dobu vždy po 1 min působení kyseliny octové. Poté bylo sklíčko umístěno do Petriho misky s Carnoyovou fixáží I. Dále bylo postupováno od „fixace" uvedeno v kapitole 5.5. Obr. 6.2.5.1 Profáze I, pachytene. Zde došlo k odmytí cytoplazmy a následnému překrytí vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min a následný roztěr preparační jehlou při 50 °C (měřítko 5 um) 59 Obr. 6.2.5.2 Profáze I, zygotene/pachytene. Zde došlo k odmytí cytoplazmy a následnému překrytí vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min a následný roztěr preparační jehlou při 50 °C (měřítko 5 Lim) Obr. 6.2.5.3b Profáze I, leptotene/zygotene (měřítko 2 um) Obr. 6.2.5.4a Profáze I, pachytene. Jasně viditelné chromozomy. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min a následný roztěr preparační jehlou při 50 °C. (měřítko 5 um) 61 Obr. 6.2.5.4d Profáze I, pachytene. Šipka označuje příčná spojení chromozomů, (měřítko 1 Lim) Obr. 6.2.5.5 Profáze II. Cytoplazma byla řádně odmyta a následně byla struktura překryta vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 4 min. (měřítko 10 um) 63 Obr. 6.2.5.6a Metafáze I. Jádro překryto zbytky cytoplazmy. Doba působení 60% kyseliny octové: 4 min. (měřítko 20 um) Obr. 6.2.5.7 Anafáze. Chromozomy zploštěné a překryté zbytky cytoplazmy. Mezi chromozomy c opačných pólech buňky je viditelné dělící vřeténko. Doba působení 60% kyseliny octové: 4 min. (měřítko 5 um) Obr. 6.2.5.8 Profáze I, leptotene/zygotene. Čtyři meiotická jádra překrytá zbytky cytoplazmy. Doba působení 60% kyseliny octové: 4 min. (měřítko 20 um) 65 Obr. 6.2.5.9 Profáze I, leptotene/zygotene. Chromozomy částečně zploštěné a překryté zbytky cytoplazmy. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min. (měřítko 5 um) Obr. 6.2.5.11 Cytokineze/diády. V jádrech jsou viditelná jadérka. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min. (měřítko 5 um) Obr. 6.2.5.12 Rozhraní kapky, kde bylo fixováno nejvíce buněk. Jejich struktura byla plochá a překrytá vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 7 min. (měřítko 100 um) 67 68 Obr. 6.2.5.14 Srovnání SEM (vlevo) a fázového kontrastu. Meiotická jádra (profáze I) nejsou díky překrytí struktur pod SEM viditelná (měřítko A, C 50 um, B 20 um) 69 6.2.6 Fixace před lyží cytoplazmy Spread chromozomů a lyže cytoplazmy: Natrávená květenství byla přenesena na sklíčka, kde byla pomocí preparační jehly rozsuspendována. Následně byla na sklíčka nakápnuta Carnoyova fixáž (20-50 ul), nejprve několik kapek kolem suspenze a poslední do kapky suspenze. Těsně před odparem fixáže byla na sklíčka nakápnuta 45%/60% kyselina octová, tak aby byla většina sklíčka kapkou překryta. Následoval roztěr kapky jako v kapitole „základní postup" nebo byla kapka kyseliny octové ponechána na buňky působit jako v kapitole „inkubace s kyselinou octovou". Poté byl vzorek ihned přenesen do 2,5% roztoku glutaraldehydu. Dále bylo postupováno od „odmývacího kroku č. 1" uvedeno v kapitole 5.5. Obr. 6.2.6.1 Buňka fixovaná pod vrstvou. Doba působení 60% kyseliny octové: 2 min (měřítko 20 um) 70 Obr. 6.2.6.2 Profáze I. Chromozomy jsou pod vrstvou a silně zploštěné. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min. (měřítko 10 um) Obr. 6.2.6.3 Cytokineze II, čtyři haploidní jádra překryty cytoplazmou. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min (měřítko 10 um) 71 Obr. 6.2.6.4 Buňka bez odmyté cytoplazmy. Doba působení 60% kyseliny octové: 5 min (měřítko 20 um) Obr. 6.2.6.5b Diády, v jádrech jsou viditelná jadérka. (měřítko 5 um) Obr. 6.2.6.6b Jadérko. Doba působení 60% kyseliny octové: 2 min (měřítko 2 um) Obr. 6.2.6.7 Anafaze. Mezi chromozomy v opačných pólech je jasně viditelné dělící vřeténko. Doba působení 60% kyseliny octové: 2 min. (měřítko 5 um) 74 Obr. 6.2.6.8a Interfázní jádro s počátkem kondenzace chromatinu. Doba působení 60% kyseliny octové: 2 min. (měřítko 20 um) 6.2.6.8b Kondenzace chromatinu. (měřítko 5 um) 75 6.2.6.8c Jsou viditelná příčná spojení mezi chromozomy, (měřítko 2 um) 76 Obr. 6.2.6.9 Srovnání SEM (vlevo) a fázového kontrastu. A - obr. 6.2.6.3, B - obr. 6.2.6.5, C - obr. 6.2.6.8 (měřítko A, 10 um, B 30 um, C 20 um) 77 7 Diskuze Během optimalizace se ukázalo, že nejproblematičtějšími kroky jsou ty, během kterých dochází k překrytí pozorovaných struktur vrstvou. Pouze několika nanometrová vrstva může znemožnit pozorování struktur pod SEM. Pro vznikání vrstev jsou nej kritičtější kroky, během kterých dochází k nechtěnému vyschnutí, respektive chtěnému (během fixace) v kroku spread a lyže cytoplazmy. Při vysychání vzorků na vzduchu také dochází ke zploštění sledovaných struktur (Sugiyama et al., 2004; Wanner a Schroeder-Reiter, 2008). Proto jsem v popisu jednotlivých obrázků v kapitole výsledky zdůrazňoval detaily týkající se tohoto kroku. Zjistil jsem, že takto mohou vznikat dva až tři typy vrstev. První a druhý typ vzniká při odparu fixačního činidla, kyseliny octové nebo Carnoyovy fixáže. Třetím typem jsou nedokonale odstraněné buněčné obaly (Allen et al., 1988; Sumner, 1991). U všech zvolených postupů docházelo ke vzniku alespoň jednoho typu z těchto vrstev. Při sledování pod SEM bylo často obtížné určit, o který typ vrstvy se jedná. I když se během lyže cytoplazmy lišil čas působení kyseliny octové, zdá se, že pro některé buňky byla dostatečná doba 30 s, u některých buněk nedošlo k lyži cytoplazmy ani po 5 min. Delší působení na strukturu chromozomů pravděpodobně nemělo vliv, nicméně se tak zvyšovala pravděpodobnost vzniku vrstvy/vrstev. Z počátku práce na diplomové práci se mi nedařilo připravit preparáty s fixovanými meiotickými buňkami, nebyly pozorovány ani pod fázovým kontrastem. Problémem bylo krátké působení pektolytických enzymů při trávení buněčných stěn (3 h). Suspenze z takto připravených květenství sice vznikala, ale pravděpodobně pouze ze zbytků květních obalů. Pro trávení buněčných stěn prašníků, tak aby z nich vznikala suspenze, bylo potřeba tento krok prodloužit (3,5-5 h). Při delším trávení (7-8 h) docházelo ke ztrátám materiálu. Dlouhé působení pektolytických enzymů pravděpodobně narušuje integritu chromozomů. 7.1 Postup podle R. Martin et al. Nejprve jsem se pokusil zopakovat ověřený postup podle R. Martin et al. (1994). Tento postup neposkytuje přesné informace pro jeho reprodukci u důležitých kroků jako je lyže cytoplazmy, resp. délka působení kyseliny octové na vzorek. Nicméně pro zjednodušení jsem během tohoto postupu nepoužil drop techniku, ale squash techniku, suspenze tak nebyla předem fixována vCarnoyově fixáži. I přes rozdílnou dobu působení kyseliny octové nedocházelo k úplnému odstranění buněčných obalů a struktury se zdály být deformované (Obr. 6.2.1.1- 78 6.2.1.3). K deformacím docházelo při odstranění krycího sklíčka. Na preparátech se také fixovalo mnohem větší množství zbytků buněk/debris, než během jiných postupů (Obr. 6.2.1.2, 6.2.1.5, 6.2.1.6). Toto mohlo být způsobeno tím, že se fixací za mrazu dusíkem fixuje větší množství materiálu. Docházelo také ke tvorbě vrstvy překrývající buňky (Obr. 6.2.1.4 a 6.2.1.5). Ta se ale nacházela spíše v okrajových oblastech plochy, která byla překryta krycím sklíčkem. Vrstva tedy pravděpodobně vznikla vyschnutím fixačního činidla, či kyseliny octové ještě před ponořením preparátu do tekutého dusíku. 7.2 Základní postup Během tohoto postupu byly struktury často překryly vrstvou. Ta vzniká při roztěru suspenze krouživým pohybem preparační jehlou při 50 °C. Každým pohybem/kroužkem tak potenciálně může vznikat nová vrstva (Obr. 6.2.2.1). Viditelnost struktur nacházejících se pod vrstvou tak závisí na její tloušťce, resp. počtu vrstev (Obr. 7.1). Na obrázku 6.2.2.2 je viditelný pouze obrys buňky, nachází se tedy pod více vrstvami než buňka na obrázku 6.2.2.3. Je také možné pozorovat struktury, které jsou z části trojrozměrné a z části zploštěné, tedy pod vrstvou fixačního činidla či nedokonale odstraněné cytoplazmy (Obr. 6.2.2.4). Na preparátech byly pozorovány buňky s různým stupněm odmytí cytoplazmy (Obr. 6.2.2.5-6.2.2.9). Na obrázku 6.2.2.10 je viditelné mitotické jádro s řádně odmytou cytoplazmou. U některých figur je zřejmé, že došlo nejprve kradnému odmytí cytoplazmy a následnému překrytí vrstvou, což vedlo ke zploštění a zhoršené viditelnosti struktury chromozomů (Obr. 6.2.2.11 a 6.2.2.12). U jiných je obtížně určitelné, zda se jedná o zbytky buněčných obalů, či o překrytí artificiální vrstvou (Obr. 6.2.2.13-6.2.2.16). Na obrázku 6.2.2.17 je potom viditelné meiotické jádro (diplotene), kde jsou buněčné obaly odstraněny, nicméně struktura je spíše zploštěná, pravděpodobně krátkým přischnutím na vzduchu. Nej lepším výsledkem tohoto postupu je interfázní jádro s kompletně odstraněnými buněčnými obaly. Je viditelná struktura chromatinu. Chromatinová vlákna mají nepravidelnou tloušťku s globulárními strukturami, kde došlo k vyššímu stupni kondenzace chromatinu (Obr. 6.2.2.18) (Iwano etal, 1997). 79 7.3 Překrytí krycím sklem Překrytím krycím sklem mělo předcházet tvorbě vrstvy přisycháním kyseliny octové, nicméně může docházet ke ztrátám materiálu, dochází totiž k fixaci buněk i na krycí sklo. Odstranění krycího skla také vedlo k deformaci pozorovaných struktur, podtlak vznikající při odstranění krycího sklíčka vede k vytažení buněk a „srolování" jejich obalů (Obr. 6.2.3.1- 6.2.3.4). Kyselina octová totiž změkčuje, k vytvrzení fixovaných struktur dochází až při fixaci Carnoyovou fixáží. Ta ale před odstraněním krycího skla ke vzorku proniknout nemohla, jelikož přischlá kyselina octová vytváří na okrajích krycího sklíčka bariéru. Buňky, které nebyly zdeformované měly řádně odmyté buněčné obaly. Chromozomy tak byly dobře viditelné (Obr. 6.2.3.5 a 6.2.3.6). 7.4 Prodloužení působení kyseliny octové V předchozích postupech se často fixovaly buňky, které měly buněčné obaly odstraněné jen z části anebo vůbec (Obr. 6.2.2.5 - 6.2.2.8.). Tento problém jsem se pokusil odstranit delším působením kyseliny octové na suspenzi buněk. Tato skutečnost ale vedla pouze ke vznikání většího počtu vrstev (Obr. 6.2.4.1 - 6.2.4.3.). Celková kvalita preparátu byla špatná a nalezení buněk nenacházejících se pod vrstvou bylo vzácné (Obr. 6.2.4.4). 7.5 Inkubace s kyselinou octovou Při podpoření aktivity k. octové (50 °C) se zvyšuje pravděpodobnost překrytí chromozomů vrstvou. Takto nevznikala vrstva po celém povrchu preparátu. Většina buněk se takto fixovala na okraji kapky (Obr. 6.2.5.12). Nejlepší výsledek poskytly preparáty, které byly nejprve inkubovány s kyselinou octovou a následoval rychlý roztěr při 50 °C. Fotky pořízené z jednoho preparátu (Obr. 6.2.5.1 - 6.2.5.4) vykazují různý stupeň odmytí cytoplazmy, překrytí a zploštění, nicméně většina buněk nebyla fixována na okraji kapky kyseliny octové. K fixaci těchto buněk došlo pravděpodobně až při rychlém roztěru při 50 °C, to zároveň způsobilo rozdílný stupeň viditelnosti/překrytí sledovaných struktur. Na obrázku 6.2.5.5 je částečně viditelná profáze II, zde došlo nejprve k odmytí cytoplazmy a následnému překrytí vrstvou a zploštění. Narozdíl od obrázků 6.2.5.6 - 6.2.5.10, kde nedošlo k úplnému odstranění 80 cytoplazmy. Na obrázku 6.2.5.11 jsou viditelné diády s řádně odstraněnými buněčnými obaly, došlo ale ke zploštění struktur vlivem vyschnutí na vzduchu během fixace, v jádrech jsou také viditelná jadérka. Srovnání snímků pořízených na fázovém kontrastu a SEM poukazují na to, že často pozorovatelná meiotická jádra pod fázovým kontrastem nejsou vůbec viditelná pod SEM (Obr.6.2.5.14). Důvodem je opět překrytí vrstvou. J.F. Zoller et al., (2004b) pozorovali ve fázi zygotene/pachytene příčná spojení homologních chromozomů jako na obrázku 6.2.5.4 . 7.6 Fixace před lyží cytoplazmy Zde byla snaha buňky nejprve zafixovat a až poté odstranit cytoplazmu. Tímto jsem částečně vyřešil problém s fixací buněk pouze na okraji kapky. Carnoyovu fixáž při fixaci buněk jsem nechal částečně odpařit, kyselinu octovou jsem na preparát nanesl ještě před přisycháním fixáže, nicméně během tohoto postupu vznikala vrstva rozdílná od předešlých postupů (Obr. 7.2). Tato vrstva vznikala pravděpodobně esterifikací kyseliny octové (Obr. 6.2.6.1 a 6.2.6.2) (Wanner a Schroeder-Reiter, 2008). Jako u předchozích postupů také u některých buněk nebyla odmyta cytoplazma (Obr. 6.2.6.3 a 6.2.6.4). Většinou ale byly buňky fixovány na povrchu preparátu (Obr. 6.2.6.5 - 6.2.6.8). V jádrech diád na obrázcích 6.2.6.5 a 6.2.6.6 j sou jasně viditelná j adérka. Na obrázku 6.2.6.8 je viditelné interfázní jádro s počátkem kondenzace chromatinu, opět jsou viditelná příčná spojení chromozomů (Zoller et al., 2004b). V anafázním jádře na obrázku 6.2.6.7 je podobně jako na obrázku 6.2.5.7 viditelné dělící vřeténko. Kyselina octová na struktury dělícího vřeténka nepůsobí nebo působí méně. Během mé práce jsem si často kladl otázky, proč u jiných prací nemají jejich autoři problém s úplným překrytím chromozomů vrstvami (Wanner et al., 2015; Zoller et al., 2004a, 2004b). Rozdílem je často práce s rostlinami, které mají mnohem větší genom/chromozomy než Arabidopis thaliana. Větší plocha chromozomu by tak mohla mít vyšší pravděpodobnost adheze na povrch sklíčka během fixace. Dále překrytí vrstvou nemusí v tak velké míře jako u malých chromozomů způsobit horší pozorovatelnost. Dále se mi podařilo zachytit meiotické buňky zejména v profázi I. Profáze I trvá z celého meiotického cyklu nej delší dobu, proto bylo pravděpodobné, že se buňky budou nacházet nejčastěji v této fázi. Vzorky pro SEM jsem pro srovnání také fotil pod fázovým kontrastem (Obr. 6.2.5.13, 6.2.5.14, a 6.2.6.9). Dále jsem chtěl preparáty nafotit pod fluorescenčním mikroskopem. To ale 81 nebylo možné, jelikož se DAPI na chromozomy nenavázala. Neschopnost vazby DAPI může být způsobena tenkou vrstvou kovu, přes kterou DAPI ke vzorku nepronikne anebo vyblokováním stejného vazebného místa při kontrastování vzorků. DAPI i platinová modř se vážou na AT bohatá místa. Barvení chromozomů DAPI je tedy nekompatibilní s jinými technikami, používající kontrastování chromozomů (Sartsanga et al., 2021). Obr. 7.1 Schéma zobrazující fixaci buněk pod přischlými vrstvami kyseliny octové Přisychání kyseliny octové Vrstva esterifikace Obr. 7.2 Schéma zobrazující vrstvu esterifikace Carnoyovy fixáže. Většina buněk se udržuje na povrchu kapky kyseliny octové, které na jejím okraji přisychají. Jako další postup navrhuji využití nižších koncentrací kyseliny octové, a tím pádem delší působení na vzorek. S. Sugiyama et al., (2004) testovali efekt kyseliny octové na struktury rostlinných chromozomů. Využili při tom koncentrace 45, 30, a 15 %. Nejlepší výsledky poskytovala koncentrace 30 % u vyšší koncentrace docházelo k poškození chromozomů, u nižších nedocházelo k řádnému odstranění cytozolu. Nicméně vzorky s kyselinou octovou byly inkubovány přes noc, což by značně prodloužilo daný postup. Dále využití rostlinných druhů, které mají větší chromozomy (Hordeum vulgare, Secale cereale,...) by mohlo vést k lepším výsledkům. 82 8 Závěr Nepodařilo se zoptimalizovat postup a připravit vzorky s konzistentními výsledky. Nej kritičtějšími kroky byly lyže cytoplazmy a fixace Carnoyovou fixáží, během kterých byly struktury překryty vrstvou. Je zajímavé, že i při rozdílných postupech jsem zachytil chromozomy alespoň částečně viditelné. Jindy zase docházelo i při použití totožného postupu k rozdílným výsledkům. Existuje tedy tenká hranice, kdy jsou buňky fixovány, zároveň mají odstraněné buněčné obaly a chromozomy nejsou překryty vrstvou. Většina použitých postupů má tedy potenciál pro zlepšení a větší konzistentnost výsledků. Další optimalizace by tak mohla vést ke kýženým výsledkům a pozorování chromozomů s vysokým rozlišením i u rostlin s malými chromozomy jako je Arabidopsis thaliana. 83 9 Zdroje: Aggarwal, S.K., Wagner, R.W., McAllister, P.K., Rosenberg, B., 1975. Cell-SurfaceAssociated Nucleic Acid in Tumorigenic Cells Made Visible with Platinum-Pyrimidine Complexes by Electron Microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 928. doi: 10.1073/pnas.72.3.928 Alberts, B., Kotyk, A., 2004. Základy buněčné biologie: úvod do molekulární biologie buňky, 2. vyd. ed. Espero Publishing. Allen, T.D., Jack, E.M., Harrison, C.J., Claugher, D., 1988. The three dimensional structure of human metaphase chromosomes determined by scanning electron microscopy. Chromosom. Chromatin 2, 51-72. Allen, T.D., Jack, E.M., Harrison, C.J., Claugher, D., 1986. Scanning electron microscopy of human metaphase chromosomes. Scan. Electron Microsc. 301-308. Ambros, P. F., Matzke, M . A., Matzke, A. J. M., 1986 Detection of a 17 kb unique sequence (T-DNA) in plant chromosomes by in situ hybridization. Chromosoma 94, 11-18. doi: 10.1007/BF00293525 Arents, G., Burlingame, R.W., Wang, B.C., Love, W.E., Moudrianakis, E.N., 1991. The nucleosomal core histone octamer at 3.1 A resolution: a tripartite protein assembly and a left-handed superhelix. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10148-10152. doi: 10.1073/pnas.88.22.10148 Bai, X., Peirson, B.N., Dong, F., Xue, C , Makaroff, C.A., 1999. Isolation and Characterization of SYN1, a RAD21-like Gene Essential for Meiosis in Arabidopsis. Plant Cell 11,417— 430. doi: 10.1105/tpc. 11.3.417 Baker, J.R., 1933. Cytological Technique. Cytol. Tech. Methuen. Baldwin, E.A., Pressey, R., 1989. Pectic enzymes in pectolyase: separation, characterization, and induction of ethylene in fruits. Plant Physiol. 90,191-196. doi: 10.1104/pp.90.1.191 Ball, P., 2003. Portrait of a molecule. Nature 421, 421-422. doi: 10.1038/nature01404 Bhat, T.A., Wani, A.A., 2017. Chromosome Structure and Aberrations, [online], Springer eBooks. Springer India. Bhatt, A.M., Lister, C , Page, T., Fransz, P., Findlay, K., Jones, G.H., Dickinson, H.G., Dean, C , 1999. The DIF1 gene of Arabidopsis is required for meiotic chromosome 84 segregation and belongs to the REC8/RAD21 cohesin gene family. Plant J. Cell Mol. Biol. 19, 463-472. doi: 10.1046/j. 1365-313x. 1999.00548.x Elbouami F., 2001. Isolation and regeneration of protoplasts from mycelium of Fusarium solani. Afr. Crop Sei. J., 9, 351-358. doi: 10.4314/acsj.v9i2.27605 Boveri, T., 1902. Über mehrpolige Mitosen als Mittel zur analyse des zellkerns. Verh. d. phys.med. Ges. Würzburg N. F. 35, 67-90 Cai, X., Dong, F., Edelmann, R.E., Makaroff, C A . , 2003. The Arabidopsis SYN1 cohesin protein is required for sister chromatid arm cohesion and homologous chromosome pairing. J. Cell Sei. 116, 2999-3007. doi: 10.1242/jcs.00601 Carnoy, J.B., 1886 La cvtodiere se de l'oeuf. Cellule 3, 1-92. Chalkley, R., Hunter, C , 1975. Histone-Histone Propinquity by Aldehyde Fixation of Chromatin. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 72, 1304-1308. doi: 10.1073/pnas.72.4.1304 Chapman, G.P., Cooke, S.A., 1983. A technique for optical and electron microscopy of isolated plant chromosomes. Protoplasma 116, 198-200. doi: 10.1007/BF01279838 Choi, K., Zhao, X., Kelly, K.A., Venn, O., Higgins, J.D., Yelina, N.E., Hardcastle, T.J., Ziolkowski, P.A., Copenhaver, G.P., Franklin, F.C.H., McVean, G , Henderson, I.R., 2013. Arabidopsis meiotic crossover hotspots overlap with H2A.Z nucleosomes at gene promoters. Nat. Genet. 45. doi: 10.1038/ng.2766 Clarke, J.A.L., Solly, S., 1851. XXVI. Researches into the structure of the spinal chord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 141, 607-621. doi: 10.1098/rstl. 1851.0029 Cuvier, O., Hirano, T., 2003. A role of topoisomerase II in linking DNA replication to chromosome condensation. J. Cell Biol. 160, 645-655. doi: 10.1083/jcb.200209023 Dawe, R.K., Sedat, J.W., Agard, D.A., Cande, W.Z., 1994. Meiotic chromosome pairing in maize is associated with a novel chromatin organization. Cell 76, 901-912. doi: 10.1016/0092-8674(94)90364-6 Dille, J.E., Bittel, D.C., Ross, K., Gustafson, J.P., 1990. Preparing plant chromosomes for scanning electron microscopy. Genome. 33, 333-339. doi: 10.1139/g90-052 Falconi, M . , Teti, G , Lanciotti, C , Galanzi, A., Mazzotti, G , 2006. High resolution morphological analysis of in situ human chromosomes. Micron 37, 146-153. doi:10.1016/j.micron.2005.08.008 85 Finch, J.T., Klug, A., 1976. Solenoidal model for superstructure in chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 73, 1897-1901. doi: 10.1073/pnas.73.6.1897 Fischer, A., 1899. Fixirung, Färbung und Bau des Protoplasmas: kritische Untersuchungen über Technik und Theorie in der neueren Zellforschung. Fischer. Fraune, J., Schramm, S., Alsheimer, M., Benavente, R., 2012. The mammalian synaptonemal complex: protein components, assembly and role in meiotic recombination. Exp. Cell Res. 318, 1340-1346. doi: 10.1016/j.yexcr.2012.02.018 Goldstein, J.I., Newbury, D.E., Michael, J.R., Ritchie, N.W.M., Scott, J.H.J., Joy, D.C., 2017. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. Springer. Golubovskaya, I.N., Hamant, O., Timofejeva, L., Wang, C.-J.R., Braun, D., Meeley, R., Cande, W.Z., 2006. Alleles of afdl dissect REC8 functions during meiotic prophase I. J. Cell Sci. 119, 3306-3315. doi: 10.1242/jcs.03054 Hadlaczky, G., Bisztray, G., Praznovszky, T., Dudits, D., 1983. Mass isolation of plant chromosomes and nuclei. Planta 157, 278-285. doi: 10.1007/BF00405195 Hanks, S., Gollin, S., Rao, P., Wray, W., Hittelman, W., 1983. Cell cycle-specific changes in the ultrastructural organization of prematurely condensed chromosomes. Chromosoma 88, 333-342. doi: 10.1007/BF00285856 Hermann, R., Muller, M . , 1991. Prerequisites of High-Resolution Scanning ElectronMicroscopy. Scanning Microsc. 5, 653-664. Hudson, D.F., Marshall, K.M., Earnshaw, W.C., 2009. Condensin: Architect of mitotic chromosomes. Chromosome Res. 17, 131-144. doi: 10.1007/s 10577-008-9009-7 Iwano, M., Fukui, K , Takaichi, S., Isogai, A., 1997. Globular and Fibrous Structure in Barley Chromosomes Revealed by High-Resolution Scanning Electron Microscopy. Chromosome Res. 5, 341-349. doi: 10.1023/B:CHRO.0000038766.53836.c3 Johnson, T.J.A., 1985. Aldehyde fixatives: Quantification of acid-producing reactions. J. Electron Microsc. Tech. 2, 129-138. doi: 10.1002/jemt. 1060020204 K850 Critical Point Dryer Quorum Technologies, URL https://www.quorumtech.com/quorumproduct/k850-critical-point-dryer (cit. 12.16.19). 86 Kashtwari, M., Zargar, S.A., & Wani, A.A., 2017. Laboratory Techniques of Studying Plant Chromosomes. In Chromosome Structure and Aberrations. Springer, New Delhi, doi: 10.1007/978-81 -322-3673-3_4 Kättström, P.O., Nilsson, B.O., 1992. Preparation of Human Chromosomes for High Resolution Scanning Electron Microscopy. Arch. Histol. Cytol. 55, 53-56. doi:10.1679/aohc.55.Suppl_53 Keeney, S., 2008. Spol 1 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn. Stab. 2, 81-123.doi: 10.1007/7050_2007_026 Kerzendorfer, C , Vignard, J., Pedrosa-Harand, A., Siwiec, T., Akimcheva, S., Jolivet, S., Sablowski, R., Armstrong, S., Schweizer, D., Mercier, R., Schlögelhofer, P., 2006. The Arabidopsis thalianaMNDl homologue plays a key role in meiotic homologous pairing, synapsis and recombination. J. Cell Sei. 119, 2486-2496. doi: 10.1242/jcs.02967 Khursheed, A., 2011. Scanning electron microscope optics and spectrometers. World scientific, doi: 10.1142/7094. Klein, F., Mahr, P., Galova, M., Buonomo, S.B., Michaelis, C , Nairz, K , Nasmyth, K , 1999. A central role for cohesins in sister chromatid cohesion, formation of axial elements, and recombination during yeast meiosis. Cell 98, 91-103. doi: 10.1016/S0092- 8674(00)80609-1 Köpf-Maier, P., Köpf, H., 1986. Cytostatische Platin-Komplexe: eine unerwartete Entdeckung mit weitreichenden Konsequenzen. Naturwissenschaften 73, 239. doi: 10.1007/BF00367775 Kuo, J., 2014. Electron Microscopy: Methods and Protocols, 3rd ed, Methods in Molecular Biology. Humana Press, doi: 10.1007/978-1-62703-776-1 Loidl, J., 2011. Synaptonemal complex spreading in Allium. II. Tetraploid A. vineale. Can. J. Genet. Cytol. doi: 10.1139/g86-106 Losada, A., Hirano, T., 2005. Dynamic molecular linkers of the genome: the first decade of SMC proteins. Genes Dev. 19, 1269-1287. doi: 10.1101/gad. 1320505 Luckner, M., Wanner, G., 2018. From Light Microscopy to Analytical Scanning Electron Microscopy (SEM) and Focused Ion Beam (FIB)/SEM in Biology: Fixed Coordinates, Flat Embedding, Absolute References. Microsc. Microanal. Off. J. Microsc. Soc. Am. Microbeam Anal. Soc. Microsc. Soc. Can. 24, 526-544. doi: 10.1017/S1431927618015015 87 Mainiero, S., Pawlowski, W.P., 2014. Meiotic chromosome structure and function in plants. Cytogenet. Genome Res. 143, 6-17. doi: 10.1159/000365260 Malick, L.E., Wilson, R.B., Stetson, D., 1975. Modified Thiocarbohydrazide Procedure for Scanning Electron Microscopy: Routine use for Normal, Pathological, or Experimental Tissues. Stain Technol. 50, 265-269. doi: 10.3109/10520297509117069 Mandakova, T., Lysak, M . , 2016. Chromosome Preparation for Cytogenetic Analyses in Arabidopsis. Curr. Protoc. Plant Biol. 1, 43-51. doi: 10.1002/cppb.20009 Martin, R., Busch, W., Herrmann, R.G., Wanner, G., 1996. Changes in chromosomal ultrastructure during the cell cycle. Chromosome Res. 4, 288-294. doi: 10.1007/BF02263679 Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., and Wanner, G., 1995. In situ hybridization and signal detection by high resolution scanning electron microscopy. Kew Chromosome Conference IV, 159-166, Royal Botanic Gardens, Kew. Martin, R., Busch, W., Herrmann, R.G., Wanner, G., 1994. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2, 411-415. doi: 10.1007/BFO1552801 Maruyama, K , 1983. Stereoscopic scanning electron microscopy of the chromosomes in Vicia faba (broad beans). J. Ultrasructure Res. 82, 322-326. doi: 10.1016/s0022- 5320(83)80019-7 Miao, C , Tang, D., Zhang, H., Wang, M., Li, Y., Tang, S., Yu, H., Gu, M., Cheng, Z., 2013. Central region component1, a novel synaptonemal complex component, is essential for meiotic recombination initiation in rice. Plant Cell 25, 2998-3009. doi: 10.1105/tpcl 13.113175 Heneen, W.K., 1981 Mitosis as discerned in the scanning electron microscope. J. Cell Biol. 2, 242-7. Nagai, S., Inoue, T., lino, A., 1982. Fibrous structure of human chromosomes observed by scanning electron microscopy. Cytobios 34, 35-44. Nasmyth, K , Haering, C.H., 2005. The Structure and Function of Smc and Kleisin Complexes. Annu. Rev. Biochem. 74, 595-648. doi: 10.1146/annurev.biochem.74.082803.133219 Olins, A.L., Olins, D.E., 1974. Spheroid Chromatin Units (v Bodies). Science 183, 330-332. doi: 10.1126/science. 183.4122.330 88 Osman, K., Higgins, J.D., Sanchez-Moran, E., Armstrong, S.J., Franklin, F.C.H., 2011. Pathways to meiotic recombination in Arabidopsis thaliana. New Phytol. 190, 523-544. doi: 10.HH/j.1469-8137.2011.03665.x Pischinger, A., 1937. Untersuchungen über die Kernstruktur, Besonders über die Beziehungen zwischen Struktur im Leben und nach Fixierung. Z. Für Zellforsch. Mikrosk. Anat. 26, 249-280. doi: 10.1007/BF00375464 Remeseiro, S., Losada, A., 2013. Cohesin, a chromatin engagement ring. Curr. Opin. Cell Biol. 25, 63-71. doi: 10.1016/j.ceb.2012.10.013 Reznik, N.A., Yampol, G.P., Kiseleva, E.V., Khristolyubova, N.B., Gruzdev, A.D., 1991. Functional and structural units in the chromomere. Genetica 83, 293-299. doi: 10.1007/BF00126235 Ris, H., 1985. The cytoplasmic filament system in critical point-dried whole mounts and plasticembedded sections. J. Cell Biol. 100, 1474-1487. doi: 10.1083/jcb. 100.5.1474 Ris, H., Witt, P.L., 1981. Structure of the mammalian kinetochore. Chromosoma 82, 153-170. doi: 10.1007/BF00286101 Rosa, M . , Von Harder, M., Cigliano, R.A., Schlogelhofer, P., Mittelsten Scheid, O., 2013. The Arabidopsis SWR1 chromatin-remodeling complex is important for DNA repair, somatic recombination, and meiosis. Plant Cell 25, 1990-2001. doi: 10.1105/tpc. 112.104067 San Filippo, J., Sung, P., Klein, H., 2008. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257. doi: 10.1146/annurev.biochem.77.061306.125255 Sartsanga, C , Phengchat, R., Fukui, K , Wako, T., Ohmido, N., 2021. Surface structures consisting of chromatin fibers in isolated barley (Hordeum vulgare) chromosomes revealed by helium ion microscopy. Chromosome Res. 29, 81-94. doi: 10.1007/s 10577- 021-09649-2 Schatten, H., 2012. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences, Advances in Microscopy and Microanalysis. Cambridge University Press, Cambridge. Schatten, H., 2011. Low voltage high-resolution SEM (LVHRSEM) for biological structural and molecular analysis. Micron 42, 175-185. doi: 10.1016/j.micron.2010.08.008 Schatten, H., Pawley, J.B., 2008. High-Resolution, Low Voltage, Field-Emission Scanning Electron Microscopy (HRLVFESEM) Applications for Cell Biology and Specimen 89 Preparation Protocols. In Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Springer, New York, NY. Schommer, C , Beven, A., Lawrenson, T., Shaw, P., Sablowski, R., 2003. AHP2 is required for bivalent formation and for segregation of homologous chromosomes in Arabidopsis meiosis. Plant J. Cell Mol. Biol. 36, 1-11. doi: 10.1046/j.l365-313x.2003.01850.x Schroeder-Reiter, E., Pérez-Willard, F., Zeile, U., Wanner, G., 2009. Focused ion beam (FIB) combined with high resolution scanning electron microscopy: A promising tool for 3D analysis of chromosome architecture. J. Struct. Biol. 165, 97-106. doi: 10.1016/j.jsb.2008.10.002 Scott L. Page, R. Scott Hawley, 2003. Chromosome Choreography: TheMeiotic Ballet. Science 301, 785. doi: 10.1126/science. 1086605 Seligman, A.M., Wasserkrug, H.L., Hanker, J.S., 1966. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid containing membranes and droplets in osmium tetroxide fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). J. Cell Biol. 30, 424-432. doi: 10.1083/jcb.30.2.424 Shao, T., Tang, D., Wang, K., Wang, M., Che, L., Qin, B., Yu, H , Li, M., Gu, M., Cheng, Z., 2011. OsREC8 is essential for chromatid cohesion and metaphase I monopolar orientation in rice meiosis. Plant Physiol. 156, 1386-1396. doi: 10.1104/pp.l 11.177428 She, W., Grimanelli, D., Rutowicz, K., Whitehead, M.W.J., Puzio, M . , Kotlinski, M . , Jerzmanowski, A., Baroux, C , 2013. Chromatin reprogramming during the somatic-toreproductive cell fate transition in plants. Dev. Camb. Engl. 140, 4008-4019. doi: 10.1242/dev.095034 Snustad, D.P., Simmons, M.J., Relichová, J., 2017. Genetika, Druhé, aktualizované vydání, ed. Masarykova univerzita. Strasburger, E., 1888. Uber Kern-und Zelltheilung im Pflanzenbereich, nebst einem Anhang uber Befruchtung. Stronghill, P., Pathan, N., Ha, H , Supijono, E., Hasenkampf, C , 2010. Ahp2 (Hop2) function in Arabidopsis thaliana (Ler) is required for stabilization of close alignment and synaptonemal complex formation except for the two short arms that contain nucleolus organizer regions. Chromosoma 119, 443-458. doi: 10.1007/s00412-010-0270-0 Sugiyama, S., Yoshino, T., Kanahara, H , Shichiri, M., Fukushi, D., Ohtani, T., 2004. Effects of acetic acid treatment on plant chromosome structures analyzed by atomic force microscopy. Anal. Biochem. 324, 39-44. doi: 10.1016/j.ab.2003.09.026 90 Sumner, A.T., 1991. Scanning electron microscopy of mammalian chromosomes from prophase to telophase. Chromosoma 100, 410-418. doi: 10.1007/BF00337519 Sumner, A.T., Ross, A., 1989. Factors affecting preparation of chromosomes for scanning electron microscopy using osmium impregnation. Scanning Microsc. 3, 87-97. Thoma, F., Koller, T., Klug, A., 1979. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin. J. Cell Biol. 83, 403-427. doi: 10.1083/jcb.83.2.403 Utsumi, K.R., 1982. Scanning electron microscopy of giemsa-stained chromosomes and surface-spread chromosomes. Chromosoma 86, 683-702. doi: 10.1007/BF00285611 Utsumi, K.R., 1985. A scanning electron microscopic study of chromosomes and nuclei. Scan. Electron Microsc. 1121-1132. Vernon-Parry, K.D., 2000. Scanning electron microscopy: an introduction. III-Vs Rev. 13, 40- 44. doi: 10.1016/S0961-1290(00)80006-X Walther, P., 2008. High-Resolution Cryoscanning Electron Microscopy of Biological Samples, in: Schatten, H., Pawley, J.B. (Eds.), Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Springer New York, New York, NY. doi: 10.1007/978-0-387-72972-5_10 Wanner, G., Formanek, H., 2000. A New Chromosome Model. J. Struct. Biol. 132, 147-161. doi: 10.1006/jsbi.2000.4310 Wanner, G., Formanek, H., 1995. Imaging of DNA in human and plant chromosomes by highresolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 3, 368-374. doi: 10.1007/BF00710018 Wanner, G., Formanek, H., Herrmann, R. G., 1990. Ultrastructure of plant chromosomes by high-resolution scanning electron microscopy. Plant Mol Biol Rep 8, 224-236. doi: 10.1007/BF02668760 Wanner, G., Formanek, H., Martin, R., Herrmann, R.G., 1991. High resolution scanning electron microscopy of plant chromosomes. Chromosoma 100, 103-109. doi: 10.1007/BF00418243 Wanner, G., Schroeder-Reiter, E., 2008. Chapter 23 Scanning Electron Microscopy of Chromosomes. Methods Cell Biol. 88, 451-474. doi: 10.1016/S0091-679X(08)00423- 8 91 Wanner, G., Schroeder-Reiter, E., Ma, W., Houben, A., Schubert, V., 2015. The ultrastructure of mono- and holocentric plant centromeres: an immunological investigation by structured illumination microscopy and scanning electron microscopy. Chromosoma 124, 503-517. doi: 10.1007/s00412-015-0521-l Watson, J.D., Crick, F., 1953. A structure for deoxyribose nucleic acid. University of Chicago Press. Watson, M.L., 1958. Staining of Tissue Sections for Electron Microscopy with Heavy Metals. J. Biophys. Biochem. Cytol. 4, 475-478.doi: 10.1083/jcb.4.4.475 Whelan, E.D.P, Haggis, G.H., Ford, E.J., Dronzek, B., 1974. Scanning electron microscopy of meiotic chromosomes of plants in situ. Can. J. Bot 52, 1438-1440. doi: 10.1139/b74- 188 Wood, T.M., Bhat, K.M., 1988. Methods for measuring cellulase activities, in: Methods in Enzymology, Biomass Part A: Cellulose and Hemicellulose. Academic Press, doi: 10.1016/0076-6879(88)60109-1 Woodcock, C.L.F., Safer, J.P., Stanchfield, J.E., 1976. Structural repeating units in chromatin. I. Evidence for their general occurrence. Exp. Cell Res. 97, 101-110. doi: 10.1016/0014-4827(76)90659-5 Yamada, T., Ohta, K., 2013. Initiation of meiotic recombination in chromatin structure. J. Biochem. (Tokyo) 154, 107-114. doi: 10.1093/jb/mvt054 Zhang, J., Han, F., 2017. Centromere pairing precedes meiotic chromosome pairing in plants. Sei. China Life Sei. 60, 1197-1202. doi: 10.1007/sll427-017-9109-y Zoller, J.F., Herrmann, R.G, Wanner, G , 2004a. Chromosome condensation in mitosis and meiosis of rye (Secale cereale L.). Cytogenet. Genome Res. 105, 134-144. doi: 10.1159/000078020 Zoller, J.F., Hohmann, U., Herrmann, R . G , Wanner, G , 2004b. Ultrastructural analysis of chromatin in meiosis I + II of rye (Secale cereale L.). Cytogenet. Genome Res. 105, 145-156. doi: 10.1159/000078021 92