Úvod
Genetické varianty mohou být neškodné i škodlivé, přičemž ty
škodlivé často podmiňují závažná lidská onemocnění včetně
primárních imunodeficiencí (PID). Rozpoznání škodlivých variant
není vždy jednoduchou záležitostí, protože řada z nich
neovlivňuje přímo funkční produkt genu (například kódující
sekvenci proteinu), ale spíše nepřímo narušuje regulaci
exprese. Nejčastějším typem takových „regulačních“ defektů
vedoucích k onemocněním člověka jsou poruchy sestřihu pre‑mRNA.
I tyto aberace však zůstávají často nerozpoznané, zřejmě proto,
že regulátory sestřihu mívají velmi degenerované sekvence
vyskytující se po celé délce genu. I v případě, že jsou
varianty vedoucí k poruchám sestřihu rozpoznány, posouzení
jejich vlivu na finální podobu sestřihu a tedy na funkci
produktu genu není triviální.
Tato práce zkoumá prevalenci mutací ovlivňujících sestřih
pre-mRNA u genů spojených se vznikem PID a u několika dalších
genů. Dále prozkoumává možnosti rozpoznání těchto mutací a
odhadu jejich vlivu na výslednou podobu sestřihu. V neposlední
řadě jsou zde navrženy nové mechanizmy aberantního sestřihu.
Metody
Pomocí in silico predikčních nástrojů bylo analyzováno celkem
111 různých genových variant. 64 z nich pak bylo zkoumáno
pomocí in vitro metod s využitím sestřihové minigenové analýzy
a RT‑PCR z RNA pacientů (s ohledem na dostupnost tohoto
materiálu).
Výsledky
Prevalence sestřihových aberací v genech spjatých s rozvojem
PID se ukázala být přibližně 22 %. In silico predikční nástroje
přinesly spolehlivé výsledky ohledně poruch míst sestřihu,
avšak predikce poruch přídatných sestřihových regulačních
elementů se projevily jako málo věrohodné. Přesto se i v této
druhé kategorii našly tři nástroje, které vykázaly slibnou
efektivitu: konkrétně ESRseq, EX-SKIP a Hexplorer. Kromě toho
dva nástroje, konkrétně NNSplice a MaxEnt, ukázaly jistou
schopnost rozlišit kryptická místa sestřihu aktivovaná po
poruše autentických míst od těch inaktivních. Dále byly určeny
specifické hraniční hodnoty, které pomáhají rozlišit varianty v
první pozici exonu ovlivňující sestřih od variant tichých.
Srovnání minigenové analýzy a RT-PCR z RNA pacientů ukázalo
vysokou míru spolehlivosti minigenové analýzy v určování, zda
určitá varianta ovlivní sestřih pre-mRNA. Tím může tato metoda
pomoci při stanovování patogenního potenciálu nových
genetických variant. V neposlední řadě tato práce prokazuje
jeden nový mechanizmus aktivace pseudoexonů a předkládá nový
možný mechanismus poruchy rozpoznání akceptorového místa
sestřihu.
Závěr
Tyto výsledky pomáhají objasnit význam sestřihových mutací u
genů spjatých s rozvojem PID a přispívají k porozumění
mechanismům sestřihových aberací. Zde zahrnutá evaluace různých
in vitro a in silico metod může být přínosná jak pro genetickou
diagnostiku, tak pro vývoj dalších predikčních nástrojů.