IP (MlI MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Molekulární a proteomická analýza lyzogenizováných kmenů Staphylococcus aureus Diplomová práce Tereza Vavrdová Vedoucí práce: doc. RNDr. Vladislava Růžičková, CSc. Odborný konzultant: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. Brno 2016 Bibliografický záznam Autorka: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Akademický rok: Počet stran: Klíčová slova: Tereza Vavrdová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Molekulární a proteomická analýza lyzogenizovaných kmenů Staphylococcus aureus Experimentální biologie Molekulární biologie a genetika doc. RNDr. Vladislava Růžičková, CSc. 2015/2016 70 Staphylococcus aureus, ETA-konvertuj ící bakteriofágy, lyzogenní konverze, sekrétom, proteomika Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Tereza Vavrdová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Molecular and proteomic analysis of lysogenized Staphylococcus aureus strains Degree programme: Experimental Biology Field of Study: Molecular Biology and Genetics Supervisor: doc. RNDr. Vladislava Růžičková, CSc. Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: Keywords: 70 Staphylococcus aureus, ETA-converting bacteriophages, lysogenic conversion, secretome, proteomics Abstrakt Staphylococcus aureus zaujímá vůči svému teplokrevnému hostiteli různé role - může být neškodným komenzálem i nebezpečným patogenem. Příčinou je velký genetický rezervoár, kterým S. aureus disponuje, a jehož důležitou součást tvoří mobilní genetické elementy. Mezi ně se řadí i profágy, které vznikají začleněním genomu mírného bakteriofága do bakteriálního chromozomu v procesu označovaném jako lyzogenní konverze. Zisk genetické informace je doprovázen změnami v genotypu, které se promítají ve fenotypu. Konkrétně při lyzogenizaci ETA-konvertujícími bakteriofágy získá lyzogen schopnost tvořit exfoliatin A , toxin způsobující tvorbu puchýřů a odlupování pokožky. V této práci byla provedena analýza genotypových a fenotypových změn u meticilin rezistentních kmenů S. aureus lyzogenizovaných ETA-konvertujícími bakteriofágy. Byly porovnány různé metody (RPLA, M A L D I - T O F profilování, SDS-PAGE, L C - M S / M S ) podle jejich schopnosti rozlišení fenotypu původních kmenů a lyzogenů. Tato práce přispívá jednak ke zdokonalení metodiky pro studium sekretomu S. aureus, a zároveň k objasnění vlivu profágů na virulenci a životaschopnost bakterií. Abstract Staphylococcus aureus assumes various roles towards its endothermic host - it can be harmless commensal or dangerous pathogen. This is caused by a vast genetic pool of S. aureus, which is so extensive thanks to mobile genetic elements. One of them - prophages - arise in an event called lysogenic conversion when genome of temperate bacteriophage integrates into bacterial chromosome. The gain of genetic information is followed by changes in genotype, which are projected into phenotype. Specifically, after lysogenization by E T A converting bacteriophages, the lysogen acquires the ability to produce exfoliative toxin A , a causative agent of blister formation and peeling of skin. In this thesis, I analyzed changes in genotype and phenotype caused by lysogenisation of methicillin-resistant strains of S. aureus by ETA-converting bacteriophages. Several methods (RPLA, M A L D I - T O F profiling, SDS-PAGE, L C - M S / M S ) were compared according to their ability to differentiate between the original strains and lysogens. This thesis contributes to the improvement of methods used for studying secretome of S. aureus, and to clarification of the impact of prophages on bacterial virulence and fitness. Masarykova univerzita Prírodovedecká fakulta oJ6R S/j, ? fife lie ; ' E H l i ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE Studení: Bc. Tereza Vavrdová Studijní program: Experimentální biologie Studijní obor: Molekulární biologie a genetika Študijní směr; Molekulární biologie a genetika Ředitel Ústavu experimentální biologie PřF M U Vám ve smyslu Studijního a zkušebního řádu MU určuje diplomovou prácí s tématem: Molekulární a proteomická analýza lyzogenizovaných kmenů Staphylococcus aureus Molecular and proteomic analysis of lysogenized Staphylococcus aureus strains Oficiální zadání: Cílem diplomové práce bude provést analýzu genotypových a zejména fenotypových změn u kmenů S. aureus lyzogenizovaných vybranými konvertujícími bakteriofágy, s využitím metod mol. biologie a hmotnostní spektrometrie, a zhodnotit možnosti použití metod k identifikaci a posouzení rozsahu změn u konvertovaných kmenů S. aureus. Literatura: aktuální odborná k zadanému tématu Jazyk závěrečné práce: český Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Vladislava Růžičková, CSc Podpis vedoucího práce: Konzultant: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, PhD Datum zadání diplomové práce: 6. listopadu 2014 V Brně dne 6. listopadu 2014 Zadání diplomové práce převzal dne: 6. listopadu 2014 Podpis studenta Poděkování Za cenné rady a pomoc při zpracování této diplomové práce bych chtěla poděkovat doc. RNDr. Vladislavě Růžičkové, C S c , doc. RNDr. Zbyňku Zdráhalovi, Dr., Mgr. Davidu Potěšilovi, Ph.D., RNDr. Haně Konečné, Mgr. Tiboru Botkovi, Mgr. Kamilu Mikuláškovi, Mgr. Evě Srbové, Daně Kadaňkové a Danuši Fridrichové. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 9. května 2016 Tereza Vavrdová Obsah 1. Úvod 9 1.1. Molekulární charakteristika Staphylococcus aureus 9 1.2. Extracelulární faktory virulence S. aureus 10 1.2.1. Enzymy a toxiny s enzymovou aktivitou 10 1.2.2. Toxiny poškozující membrány 12 1.2.3. Toxiny interferující s receptory 12 1.2.4. Genetická determinace a regulace exprese faktoru virulence 13 1.3. Studium virulence S. aureus na úrovni fenotypu 15 1.3.1. Biologické, imunologické a proteomické metody 15 1.3.2. Využití hmotnostní spektrometrie při studiu proteomu S. aureus 16 2. Cíl diplomové práce 18 3. Materiál a metody 19 3.1. Bakteriální kmeny a bakteriofágy 19 3.2. Materiál 20 3.2.1. Chemikálie 20 3.2.2. Kultivační a uchovávací média 21 3.3. Laboratorní přístroje a software pro jejich ovládání 21 3.4. Software pro vyhodnocení dat 22 3.5. Metody 23 3.5.1. Stanovení citlivosti bakteriálních kmenů k temperovaným fágům 23 3.5.2. Lyzogenizace na agarových plotnách 23 3.5.3. PFGE 23 3.5.4. Charakterizace bakteriálních kmenů pomocí P C R 24 3.5.5. M A L D I - T O F M S profilování 28 3.5.6. Příprava supernatantu kultury pro proteomické analýzy 28 3.5.7. SDS-PAGE 28 3.5.8. L C - M S / M S analýza 29 4. Výsledky 33 4.1. Lyzogenizace M R S A kmenů ETATíonvertujícím bakteriofágem 33 4.2. Molekulárně4oiologická charakterizace lyzogenizovaných kmenů 34 4.3. Fenotypová charakterizace lyzogenizovaných kmenů 36 4.3.1. R P L A 36 4.3.2. S D S - P A G E 36 4.3.3. M A L D I - T O F M S profilování 38 4.3.4. Analýza sekretomu pomocí hmotnostní spektrometrie 39 5. Diskuze 49 6. Závěr 56 7. Summary 57 Literatura 58 Seznam zkratek agr - accessory gene regulator, regulátor přídatných genů CEITEC - Central European Institute for Technology, Středoevropský technologický institut ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay, stanovení zprostředkované enzymem vázaným s imunosorbentem ESI - electrospray ionization, ionizace elektrosprejem E T A - exfoliatin A F A S P - filter aided sample preparation, příprava vzorku na filtru IEC - immune evasion cluster, shluk genů pro proteiny sloužící k úniku před imunitním systémem L C - liquid chromatography, kapalinová chromatografie; R P L C - reversed-phase liquid chromatography, vysokoúčinná L C s reverzní fází L M D M - Laboratoř molekulární diagnostiky mikroorganismů M A L D I - matrix assisted desorption/ionization, desorpce a ionizace za účasti matrice M G E - mobilní genetické elementy M R S A - methicillin-resistant Staphylococcus aureus, S. aureus rezistentní k meticilinu M S - mass spectrometry, hmotnostní spektrometrie; M S / M S - tandemová analýza N R L - Národní referenční laboratoř P F G E - pulse-field gel electrophoresis, pulzní gelová elektroforéza P S M - phenol soluble modulins, moduliny rozpustné ve fenolu R P L A - reverse-passive latex-agglutination, reverzně-pasivní latexová aglutinace SCCmec - staphylococcal cassette chromosome, stafylokoková chromozómová kazeta mec SDS-PAGE (též 1D-GE) - sodium dodecyl sulphate polyakrylamid gel electrophoresis, polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti dodecylsíranu sodného; 2D-GE dvourozměrná G E (kombinovaná s izoelektrickou fokusací) TOF - time of flight, průletový analyzátor (též analyzátor doby letu) Zkratky genů a proteinů jsou uvedeny v textu a v tabulkách. 1. Úvod Grampozitivní bakterie Staphylococcus aureus získala své jméno podle charakteristického zlatého zbarvení svých hroznovitých shluků buněk. Může být neškodnou složkou mikroflóry teplokrevných živočichů, ale i patogenem vyvolávajícím nebezpečná onemocnění. Stafylokokové infekce mají často chronický průběh a zejména u imunosuprimovaných jedinců mohou vyvolat život ohrožující stavy, mezi které patří sepse, syndrom toxického šoku a nekrotizující pneumonie. Jelikož se k léčbě bakteriálních onemocnění využívají téměř výhradně antibiotika, velkým problémem se stala rezistence některých bakterií k těmto látkám. U S. aureus je za obzvlášť rizikovou považována rezistence k beta-laktamovým antibiotikům (Tenover a Pearson, 2004). Kmeny s takovou schopností se nazývají meticilin-rezistentní kmeny S. aureus (MRSA). Rozdíly v patogenite lze vysvětlit variabilní odpovědí hostitele a různou virulencí kmenů S. aureus. Virulence, neboli stupeň patogenity, je daná schopností bakterie zajistit si dostatečnou výživu v organismu hostitele, účinně se v něm šířit a vyhnout se jeho imunitnímu systému. Tyto funkce zajišťují faktory virulence, což jsou peptidy a proteiny vázané na povrch buňky nebo secernované. V současnosti je prokázáno, že virulence S. aureus je podmíněna produkcí faktorů virulence i funkcí regulačních systémů (Tong et al, 2012). Je však nutné prozkoumat další jevy, které by virulenci mohly ovlivňovat (Priest et al, 2012). Jedním ze způsobů, jak získat další informace nezbytné k plnému objasnění patogenity S. aureus, je studium fenotypových změn po lyzogenní konverzi. 1.1. Molekulární charakteristika Staphylococcus aureus Genom S. aureus je tvořen kružnicovým chromozomem o velikosti 2,8 - 3 M b (Kuroda et al, 2001) a nese asi 2000 (Becher et al, 2009) až 2900 (Sibbald et al, 2006) genů pro proteiny. Přibližně 75 % genomu tvoří konzervativní oblasti obsahující geny kódující proteiny nezbytné pro přežití bakterie, zbylou část tvoří variabilní složka složená z mobilních genetických elementů (MGE), které často nesou geny kódující faktory virulence (Narita et al, 2001). M G E se mohou mezi různými kmeny přenášet horizontálním přenosem. Díky tomu má S. aureus k dispozici flexibilní genový rezervoár (Holden a Lindsay, 2008), kdy různé 9 kombinace M G E hrají roli v adaptaci na různá prostředí (Nienaber et al, 2011) a tedy i v patogenezi (Bae et al, 2006). Mezi M G E se řadí profágy, plazmidy, transpozony, inzerční sekvence, ostrovy patogenity a chromozómové kazety (Lindsay a Holden, 2004). Profágy vznikají začleněním genomu temperovaných bakteriofágů do bakteriálního chromozomu. Důsledkem je jev označovaný jako lyzogenní konverze, kdy je bakteriální genom obohacen o fágové geny (některé z nich jsou uvedeny v tabulce 1 v kapitole 1.2.4.). Může dojít i k přerušení genů v místě integrace. Nejznámnějším příkladem je inaktivace genu hlb kódujícícího P-hemolyzin (Carroll et al, 1995). Temperované stafylofágy patří do řádu Caudovirales a čeledi Siphoviridae. Dále se rozlišují na serotypy A , B , Fa a Fb (Pantůček et al, 2004). Některé bakteriofágy serotypu B mohou nést gen eta pro exfoliativní toxin A (ETA). Takové fágy jsou označovány jako E T A konvertující a podle I C T V náleží do rodu Phietalikevirus (ICTV, 2014). N a základě modulárního uspořádání jejich genomu je možné je dále rozdělit do šesti různých genotypů (Holochová et al, 2010; Botka et al, 2015). 1.2. Extracelulární faktory virulence S. aureus Pro úspěšnou kolonizaci hostitele jsou nezbytné faktory virulence, které mohou být vázané na membráně či secernované. Kromě toho, že zajišťují bakterii dostatečnou výživu v prostředí chudém na některé esenciální látky (Oogai et al, 2011), jsou v ranných fázích infekce zodpovědné za adhezi na buněčné struktury a v pozdějších fázích jiné faktory virulence slouží k rozrušení tkání hostitele a tím k rozšíření bakterie v organismu hostitele. Velkou roli v přechodu z komenzálního do patogenního způsobu života hrají látky chránící bakterii před imunitním systémem (Pereš a Manderas, 2013). V následujících kapitolách budou charakterizovány extracelulární faktory virulence vybrané s ohledem na zaměření a řešení této diplomové práce. N a základě nejnovějších poznatků o molekulárních principech jejich účinků jsou rozděleny na enzymy a toxiny s enzymovou aktivitou, toxiny poškozující membrány a toxiny interferující s receptory. 1.2.1. Enzymy a toxiny s enzymovou aktivitou Významnými toxiny jsou exfoliatiny, serinové proteázy sekvenčně podobné V8 proteáze (Dancer et al, 1990). Štěpí desmoglein, transmembránový protein zajišťující adhezi keratinocytů v granulami vrstvě epidermis (Hanakawa et al, 2002), tím způsobují vznik puchýřů a odlupovaní svrchní vrstvy pokožky. Radí se mezi ně i exfoliatin A a B , příčiny 10 bulózního impetiga a syndromu opařené kůže (Yamasaki et al, 2005). Exfoliatiny jsou stejně jako některé další stafylokokové toxíny superantigenní (Monday et al, 1999a), což znamená, že j sou schopné vyvolat patologickou aktivaci a proliferaci lymfocytů vedoucí k cytokinové bouři, jež může způsobit selhání orgánů a smrt hostitele. Méně toxické než exfoliatiny jsou proteázy, lipázy a nukleázy. Různorodá skupina extracelulárních proteáz zahrnuje zinkovou metaloproteázu aureolyzin (Aur), glutamyl endopeptidázu (SspA) zvanou též V8 proteáza, cysteinové proteázy stafopain A a B (SspP; SspB) a šest setinových proteáz (SplA - SplF). Mezi lipolytické enzymy se řadí triacylglycerol lipáza (Lip), glycerol ester hydroláza (Geh), fosfatidylinositol fosfodiesteráza (Plc) a glycerofosforyl diester fosfodiesterázy, které mohou být sekretované (GlpQ) nebo vázané na membránu (UgpQ). Významnou extracelulární termostabilní endonukleázou je termonukláza (Nuc). Uvedené enzymy rozkládají biomolekuly hostitele a tím zajišťují bakterii dostatek živin a usnadňují šíření bakterie ve tkáních (Potempa et al, 1988; Ohbayashi et al, 2011). Podílejí se na ochraně bakterie před imunitním systémem (Rollof et al, 1988; Brinkmann a Zychlinsky, 2012). Lipázy hrají roli i v adhezi (Stehr et al, 2003). Proteázy štěpí některé membránově vázané faktory virulence (McGavin et al, 1997) a inaktivují moduliny rozpustné ve fenolu (PSM; Cassat et al, 2012), a tím modulují virulenci S. aureus (Lindsay a Foster, 1999). Invazi bakterie usnadňuje i hyaluronát lyáza (HysA) a stafylokináza (Sak). HysA i Sak způsobují poškození tkání (Makris et al, 2004; Beaufort et al, 2008). Kromě toho působí Sak protizánětlivě (Jin et al, 2004) a brání fagocytóze (Rooijakkers et al, 2005a). Často bývá spojována s inhibitorem chemotaxe (Chips) a inhibitorem komplementu (Sein), neboť geny, které je kódují, leží společně ve shluku genů pro proteiny sloužící k úniku před imunitním systémem (IEC). Stafylokoaguláza (Coa) tvoří s protrombinem komplex stafylotrombin, který vyvolá tvorbu krevních sraženin (Hemker et al, 1975). Důsledkem je obalení bakterie shluky fibrínu, které ji chrání před imunitním systémem, usnadňují tvorbu abscesu (Cheng et al, 2010) a adhezi ke katetrům (Vanassche et al, 2013). Koagulázovou aktivitu vykazuje i protein vázající von Willebrandův faktor (vWbp; Bjerketorp et al, 2004), který se kromě toho podílí na adhezi bakterie na struktury hostitele (O'Seaghdha et al, 2006). Sfingomyelináza C, neboli [34iemolyzin (Hlb), sice patří do skupiny cytotoxinů, ale výrazně se od nich liší svým mechanismem účinku - neničí membrány buněk hostitele tvorbou pórů, nýbrž štěpením sfingomyelinu (Huseby et al, 2007). 11 1.2.2. Toxiny poškozující membrány Některé stafylokokové toxiny tvoří v membránách cílových buněk oligomerní póry, což vede k narušení osmotické rovnováhy, případně i ke smrti buňky (Walev et al, 1993). Tyto toxiny se dělí na dvě skupiny podle toho, zdaje podmínkou jejich cytolytického účinku interakce se specifickým membránovým receptorem, či nikoliv. Specifický receptor na membráně cílové buňky vyžadují toxiny tvořící ß-barelove póry (Inoshima et al, 2011). Kromě jednosložkového a-hemolyzinu (Ha) patří do této skupiny i dvojsložkové toxiny, konkrétně y-hemolyzin (HlgAB, HlgCB; Konig et al, 1997), PantonůvValentinův leukocidin (PVL) a další leukocidiny (LukAB neboli LukGH; LukDE). Tyto proteiny jsou si navzájem strukturně a funkčně podobné (Gouaux et al, 1997). Způsobují poškození membrán různých buněčných typů a mohou plnit i další úlohy (Inoshima et al., 2011). Naopak 5-hemolyzin (Hld) ke své cytolytické funkci nevyžaduje přítomnost specifického receptoru na cílové membráně. Je to surfaktant a stejně jako PSMal-a4 tvoří ve vysokých koncentracích póry v membránách (Mellor et al, 1988). Je natolik podobný P S M , že je někdy řazen mezi ně jako PSMy (Wang et al, 2007). Kromě cytotoxických P S M a existují i kratší PSMß. P S M hrají roli v kolonizaci a tvorbě biofiolmu (Schwartz et al, 2012) a předpokládá se, že by se mohly zapojovat i do bakteriální interference (Cogen et al, 2010). V roce 2009 byl popsán PSM-mec (Queck et al, 2009), který je funkčně velmi odlišný od ostatních P S M . Transkript genu psm-mec i protein PSM-mec regulují virulenci S. aureus tak, že potlačují expresi invazivních a toxických faktorů virulence a naopak podporují tvorbu biofilmu (Kaito et al, 2013). 1.2.3. Toxiny interferující s receptory Stafylokokové enterotoxiny (SEs) a toxiny podobné stafylokokovým enterotoxinům (SEls) jsou pyrogenní superantigenní proteiny odolávající vysokým teplotám, nízkému pH a proteázám. Předpokládá se, že způsobují enterotoxikózy vyvoláním nadměrného vyplavení cytokinů (Lin et al, 2010). U SEs prokázán emetický účinek (Hennekinne et al, 2012). V současnosti je známo 22 sérotypů (SEA - SE1X), z nichž dva jsou známy ve více variantách (SEC1-3, SelUl-2). Toxin původně označený jako SEF (Bergdoll et al, 1981), byl později přejmenován na toxin syndromu toxického šoku (TSST). Na receptory leukocytu se váže již výše zmíněný inhibitor chemotaxe (Chips), který tak brání jejich aktivaci chemoatraktanty a komplementem (De Haas et al, 2004). Do žádné z uvedených kategorií nespadá inhibitor komplementu (Sein), který brání pohlcení bakterie fagocyty (Rooijakkers et al, 2005b). 12 1.2.4. Genetická determinace a regulace exprese faktorů virulence Zatímco geny pro povrchově vázané faktory virulence a exoenzymy leží zpravidla na chromozomu, geny kódující toxiny se až na pár výjimek nachází na M G E (tabulka 1). Tabulka 1: Genetické determinanty faktorů virulence S. aureus Protein Gen Citace Geny lokalizované na chromozomu aureolyzin aur Kuroda etai, 2001 enterotoxinům podobný toxin X selx Wilson etal., 2011 glycerol ester hydroláza (lipáza) geh (Iip2) Kuroda etal., 2001 glycerolfosforyl diester fosfodiesteráza glpQ (SA0820) Kuroda etal., 2001 a-hemolyzin, (3-hemolyzin, y- hla, hlb, hlgA, hemolyzin, 5-hemolyzin hlgB, hlgC, hld Kuroda etal., 2001 hyaluronát lyáza hysA Kuroda etal., 2001 leukocidin AB lukA, lukB Kaneko a Kamio, 2004 moduliny rozpustné ve fenolu a l ­ psma1-a4, ert, (31, (32 psmßl, psmß2 Wang et ai, 2007 stafopain A a B sspP, sspB Kuroda etal., 2001 stafylokoaguláza coa Kuroda etal., 2001 termonukleáza nuc Kuroda etal., 2001 thacylglycerol lipáza Up Kuroda etal., 2001 V8 proteáza sspA Kuroda etal., 2001 protein vázající von Willebrandův faktor vWbp (SA0743) Kuroda etal., 2001 Geny lokalizované na prof azích exfoliatin A eta Yamaguchi etal., 2000 enterotoxiny A a E sea, see Couch etal., 1988; Kuroda etal., 2001 enterotoxinům podobné toxiny K, selk, selp, selq Kuroda etal., 2 0 0 1 ; Baba etal., P,Q 2002 inhibitor chemotaxe chips Baba etal., 2008 inhibitor komplementu sein Baba etal., 2008 Pantonův-Valentinův leukocidin lukS-PV, lukF-PV Baba etal., 2002 stafylokináza sak Kuroda etal., 2001 Geny lokalizované na ostrovech patogenity, genomových ostrovech enterotoxiny B, C, G, I seb, sec, seg, Kuroda etal., 2 0 0 1 ; Gill etal., sei 2005 enterotoxinům podobné toxiny K, selk, seli, selm, Kuroda etal., 2 0 0 1 ; Omoe etal., L, M, N, 0 , Q, U, V seln, selo, selq, 2005; Thomas etal., 2006 selu, selv exfoliatin A a D eta, etd Yamaguchi etal., 2002; Gill etal., 2005 leukocidin DE lukD, lukE Baba etal., 2002 serinové proteázy splA-splF Kuroda etal., 2001 toxin syndromu toxického šoku tst Kuroda etal., 2001 Gen lokalizovaný na stafylokokové chromozómové kazetě mec modulin rozpustný ve fenolu psm-mec Queck et ai, 2009 13 Gen lokalizovaný poblíž stafylokokové chromozómové kazety mec enterotoxin H seh Baba etal., 2002 Geny lokalizované na plazmidech enterotoxiny B, C, D, R, S, T seb, sec, sed, Altboum etal., 1985; Zhang etal., ser, ses, set 1998; Omoe etal., 2003; Ono et al., 2008 enterotoxinům podobný toxin J selj Zhang etal., 1998 exfoliatin B etb Yamaguchi etal., 2001 Legenda: Při anotaci genomu Kurodou et al. (2001) ještě všechny uvedené geny nebyly popsány. U takových genů je v závorce uvedeno označení, pod kterým byly anotovány. Vedle přítomnosti genů pro faktory virulence je důležitá i regulace jejich exprese. Dosud vylo objeveno 20 regulačních systémů ovlivňujících virulenci, z nichž velká část dosud nebyla plně popsána. Všechny známé poznatky o regulačních systémech podmiňujících virulenci shrnuli Priest et al. (2012) do schématu (obrázek 1). Na obrázku jsou uvedeny známé regulační dráhy a to, jak indukují (šedé šipky), či inhibují (červené dráhy) jiné regulační systémy. Vně kruhu jsou zaznamenány známé efekty regulačních systémů na adhezi (A), toxicitu (T) a schopnost vyhnutí se imunitnímu systému (E, z anglického evasiveness). Otazníky značí případy, kdy buď chybí informace, nebo si informace z více zdrojů navzájem protiřečí. Ze vztahů mezi regulačními systémy vyplývá, že jsou společně regulovány takové faktory virulence, které jsou si funkčně podobné. N a základě indukce nebo inhibice skupiny adhezivních, toxických nebo imunomodulačních faktorů virulence pak dochází k fenotypovému projevu bakterie. 14 1.3. Studium virulence S. aureus na úrovni fenotypu Nález vysoce virulentních kmenů u asymptomatických přenašečů (Kikuchi et al, 2003) i veliká odlišnost sekretomů příbuzných kmenů S. aureus ukazují (Le Maréchal et al, 2011), že virulence S. aureus není podmíněna jediným faktorem virulence (Gillet et al, 2002). Navíc nebyla nalezena žádná jednoduchá korelace mezi souborem genů a virulenčním potenciálem daného kmene. Závěrem je, že virulence je podmíněna souborem faktorů virulence (Moreillon et al, 1995), složitým regulačním systémem, případně i dalšími, dosud neobjasněnými faktory (Ge a Shan, 2011). Z toho plyne, že pro plné pochopení patogenity S. aureus musí být studie genů pro faktory virulence a regulačních systémů doplněny analýzou souboru povrchově vázaných faktorů virulence (Dreisbach et al, 2010) a sekretomů, souboru sekretovaných faktorů virulence (Khoon a Neela, 2010). 1.3.1. Biologické, imunologické a proteomické metody Pro detekci stafylokokových toxinů se dříve využívaly hlavně testy na zvířatech a imunologické metody, konkrétně reverzně-pasivní latexová aglutinace (RPLA) a stanovení zprostředkované enzymem vázaným s imunosorbentem (ELISA). Tyto techniky jsou závislé na použití laboratorních zvířat, případně protilátek z nich získaných. Využití laboratorních zvířat je eticky problematické, mimo to jsou některé toxiny druhově specifické (Loffler et al, 2010). U imunologických testů je vysoké riziko falešně pozitivních výsledků, a proto musí být jejich pozitivní výsledky ověřovány jinou metodou (den Reijer et al, 2016). Z těchto důvodů se zkoumá možnost tyto metody doplnit či nahradit proteomickými technikami. Při detekci proteinů v komplexních směsích, mezi které patří i supernatanty bakteriálních kultur, jsou složky směsi nejprve separovány pomocí gelové elektroforézy na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS-PAGE, též 1D-GE) nebo kapalinové chromatografie (LC), samotnou detekci proteinů pak zajistí hmotnostní spektrometrie (MS). Při SDS-PAGE jsou proteiny rozděleny na základě jejich hmotnosti, u dvourozměrné gelové elektroforézy (2D-GE) jsou navíc separovány podle jejich izoelektrického bodu. Uvedené metody jsou vhodné zejména pro srovnávací analýzy (Pocsfalvi et al, 2008). Vyhodnocení těchto metod je komplikováno nálezy proteinů na jiných místech gelu, než kde byly očekávány (Ziebandt et al, 2001) a výskytem některých proteinů na více místech gelu současně (Ziebandt et al, 2004). Navíc je G E nevhodná pro hydrofobní, příliš malé nebo naopak velké proteiny, u 2D-GE pak nastávají problémy i při identifikaci proteinů s extrémní hodnotou izoelektrického bodu. 15 K rozdělení komplexních směsí se často využívá vysokoúčinné kapalinové chromatografie s reverzní fází (RPLC), při které jsou proteiny rozděleny na základě jejich hydrofobicity, a která probíhá za vysokého tlaku na nepolárních sorbentech s malým průměrem částic a s polární mobilní fází. Detekci proteinů pomocí M S většinou předchází redukce disulfidických můstků a alkylace thiolových skupin následovaná trypsinovým štěpením. Vzniklá směs peptidů je analyzována ve hmotnostním spektrometru, kde je vzorek nejprve ionizován pomocí desorpce a ionizace za účasti matrice ( M A L D I ; Karas a Hillenkamp, 1988) nebo ionizace elektrosprejem (ESI; Fenn et al, 1989). Ionty jsou pak ve hmotnostním analyzátoru separovány na základě poměru hmotnosti ku náboji, případně mohou být dále fragmentovány při tzv. tandemové analýze (MS/MS). Jako analyzátory se používají například analyzátory doby letu (TOF), kvadrupóly, či elektrostatické iontové pasti (Orbitrap). Při M S / M S jsou poměry hmotnosti ku náboji naměřené pro fragmenty peptidových iontů srovnány s teoreticky vytvořenými fragmenty peptidů, které vznikly in silico štěpením databázové sekvence daného proteinu. M S umožňuje i kvantifikaci proteinů a to buď pomocí izotopických značek, nebo statistickým vyhodnocením dat. 1.3.2. Využití hmotnostní spektrometrie při studiu proteomu 5. aureus V laboratorní praxi se dnes k taxonomické identifikaci bakterií využívá M A L D I - T O F M S profilování (Szabados et al, 2010). Přestože se studuje možnost dalšího využití této techniky, například k charakterizaci kmenů (Wolters et al, 2011) a k identifikaci toxinogenních kmenů S. aureus (Gagnaire et al, 2012), má M A L D I - T O F M S profilování však jistá omezení (Dauwalder et al, 2010), a proto se v současnosti rozvíjí spíše metodika využívající L C - M S / M S . Již delší dobu se zkoumá možnost využití M S pro přímou detekci stafylokokových toxinů. Po detekci purifikovaných toxinů (Kientz et al, 1997) se zkoumala možnost detekovat toxiny ve složitějších směsích, konkrétně v potravinách (Nedelkov et al, 2000; Sospedra et al, 2012) a v tělních tekutinách (Brun et al, 2007). Metodika přímé detekce bakteriálních toxinů je dále rozvíjena a předpokládá se její praktické využití při kontrole potravin a diagnostice infekčních onemocnění. Díky značnému technologickému pokroku je dnes možné proteomické techniky využít k analýze velmi složitých směsí (Armengaud, 2013) a jejich vhodnou kombinací je možné zmapovat téměř celý proteom (Becher et al, 2009). Z těchto důvodů se začala řada mikrobiologických otázek řešit na proteomické úrovni - kromě studií popisujících proteom či 16 jeho části (Dreisbach et al, 2010), jsou publikovány studie popisující změny proteomu v průběhu růstu, během stresu, při tvorbě biofilmu, internalizaci v buňkách hostitele, či při infekcích v různých typech tkání (Cordwell et al, 2002; Resch et al, 2006; Garzoni et al, 2007; Hessling et al, 2013; Liew et al, 2015). Těmito metodami jsou zkoumány regulační systémy (Ziebandt et al, 2001; Rogasch et al, 2006), rozdíly mezi patogenními kmeny (Muthukrishnan et al, 2011) a interakce mezi patogenními bakteriemi (Kluge et al, 2012). Kromě objasnění role již popsaných faktorů virulence mohou být proteomickými technikami identifikovány i nové faktory virulence (Ventura et al, 2010) a proteiny využitelné při tvorbě vakcín (Gil et al, 2014; den Reijer et al, 2016). Uvedené studie ukazují, že proteomické techniky podrobně informují o bakteriálním proteomu a jeho změnách, a proto jsou vhodné pro studium vlivu lyzogenní konverze na sekrétom S. aureus. 17 2. Cíl diplomové práce Cílem diplomové práce bylo provést analýzu genotypových a fenotypových změn u kmenů S. aureus lyzogenizovaných mírnými bakteriofágy. Výstupem řešení práce je posouzení možnosti využití proteomických metod k popisu sekretomu u studovaných kmenů S. aureus a ke zjištění rozsahu změn u těchto kmenů po lyzogenizaci. Pro tento účel byl vybrán laboratorní kmen S. aureus 1039 ( C C M 4890), klinické a veterinární M R S A kmeny a ETA-konvertující bakteriofágy (ze sbírky Laboratoře molekulární diagnostiky mikroorganismů). Při řešení diplomové práce byly využity metody molekulární biologie (PCR, PFGE), imunologické metody (RPLA) a proteomické metody (SDS-PAGE, M A L D I - T O F M S profilování, L C - M S / M S analýza). Splnění cíle diplomové práce bylo podmíněno provedením následujících dílčích úkolů: 1. Výběr M R S A kmenů citlivých k ETA-konvertujícím bakteriofágům. 2. Lyzogenizace vybraných kmenů ET A-konvertují čími bakteriofágy. 3. P F G E - detekce integrace eto-pozitivního profága. 4. P C R detekce genů pro vybrané faktory virulence, především profágových genů majících hlavní roli v lyzogenní konverzi. 5. Proteomická analýza vzorků pomocí SDS-PAGE, LC-ESI-MS/MS. 6. Posouzení možnosti využití proteomických metod k identifikaci fenotypových změn vzniklých fágovou konverzí u S. aureus. 18 3. Materiál a metody 3.1. Bakteriální kmeny a bakteriofágy V tabulce 2 je uveden soubor vybraných klinických a veterinárních M R S A kmenů, které byly charakterizovány v Laboratoři molekulární diagnostiky mikroorganismů ( L M D M ) pomocí standardních genotypizačních metod, a u nichž byl určen typ stafylokokové chromozómové kazety mec (SCCmec) a sérotyp profágů přítomných v jejich genomu. Všechny ETA-konvertující bakteriofágy uvedené v tabulce 3 byly izolovány v L M D M z donorových ETA-pozitivních kmenů S. aureus, které byly charakterizovány v Národní referenční laboratoři (NRL) a v L M D M (Růžičková et al, 2012). Tabulka 2. Přehled meticilin rezistentních kmenů S. aureus Číslo kmene Zdroj spa typ MLST SCC typ Profágy C C M 7109 člověk, Nový Jičín NT ST22 IV like A, Fa E14 člověk, Brno t030 CC8 INA Fa E15 člověk, Brno t030 CC8 III Fa, Fb E26 člověk, Brno t105 CC5 II A, B, Fa E34 člověk, Brno t030 CC8 I Fb E49 člověk, Brno t041 CC5 I B, Fa S321A veterinární prostředí t011 ST398 IVA SA2090 skot t315 ST361 V Fa SA2115 veterinární prostředí t011 ST398 V A UL21 člověk, Ústí nad Labem t003 NT II Fa Legenda: spa typ - typizace podle polymorfismu v genu pro stafylokokový protein A; MLST multilokusová sekvenční typizace; ST - alelický profil; CC - klonální komplex; SCC typ - typ stafylokokové chromozomální kazety; NT - netestováno. Tabulka 3. Přehled ETA-konvertujících bakteriofágů izolovaných v L M D M Název ETA-B typ Donorový kmen 4> 166 ETA-B6 SA09/166 * 234 ETA-B3 SA10/234 * 236 ETA-B5 SA08/236 * 557 ETA-B1 SA98/557 4> 841 ETA-B2 SA06/841 K testování různých metodických postupů byl využit mutantní kmen bez plazmidů a profágů 1039 ( C C M 4890; Yoshizawa, 1985) a jeho jednonásobné, případně dvojnásobné lyzogeny fágů 4> 166 a c|>410, které jsou v této práci označené jako 1039 (166+), 1039 (410+) a 1039 (166+, 410+). Při pulzní gelové elektroforéze (PFGE) byl jako velikostní marker použit kmen N C T C 8325 (PS47 77+, NC_007795). Pozitivní kontroly používané pro P C R jsou uvedeny v tabulce 4. Jako negativní kontrola sloužil buď kmen 1039, nebo Staphylococcus nepalensis ( C C M 7045; konkrétně při agr typizaci a detekci hemolyzinů). Při M A L D I - T O F M S profilování byl pro externí kalibraci použit kmen Escherichia coli DH5a. 3.2. Materiál 3.2.1. Chemikálie Acetonitril ( A C N ; Merck, SRN) Agar n . l , n.3 (Oxoid, U K ) Agaróza (Serva, ČR) Akrylamid (Sigma, SRN) Arginin (Lachema, ČR) Brain-Heart Infusion (Oxoid, U K ) Bromfenolová modř (Merck, SRN) Cfr9l (Thermo Fisher Scientific, U S A ) Chlorid horečnatý (MgCl2 ; 5 Prime, SRN) Chlorid sodný (NaCl; Penta, ČR) Chlorid vápenatý (CaCl2; Penta, ČR) Citronan sodný (Lachema, ČR) Coomassie Brilliant Blue G-250 (Biosafe Coomassie; Sigma, SRN) Deoxycholát sodný (Sigma, SRN) Dithiotreitol (DTT; Sigma-Aldrich, U S A ) Dodecylsulfát sodný (SDS; Sigma, SRN) Enzymatický hydrolyzát kaseinu (Imuna Pharm, SR) Ethanol (Penta, ČR) Ethidium bromid (Sigma, SRN) FastStart P C R Master (Roche Diagnostics, SRN) Glycerol (Sigma, SRN) Glycin (Penta, ČR) Heptahydrát síranu horečnatého (Sigma, SRN) Hydrogenfosforečnan draselný (Lachema, ČR) Hydrogenuhličitan amonný ( A B C ; Sigma Aldrich, U S A ) Imunoglobulin G (IgG; Sigma, SRN) Jodacedamid (IAA; Sigma Aldrich, U S A ) Kspl (Roche Diagnostics, SRN) Kyselina ethylendiaminotetraoctová (EDTA; Sigma, SRN) Kyselina ethylenglykoltetraoctová (EGTA; Sigma, SRN) Kyselina a-kyano-4-hydroxyskořicová (HCCA; Bruker Daltonics, SRN) Kyselina mravenčí (FA; Riedel de Haěn; SRN) Kyselina nikotinová (Lachema, ČR) Kyselina octová (Penta, ČR) Kyselina trifluorooctová (TFA; SigmaAldrich, SRN) Lauroyl sarkosinát sodný (Sigma, SRN) Lyzostafin (SIGMA, SRN) Močovina (Sigma Aldrich, U S A ) Nukleotidy dATP, dTTP, dGTP, dCTP (Roche Diagnostics, SRN) Nutrient broth (Oxoid, U K ) Pantotenát vápenatý (Merck, SRN) Pepton (Oxoid, U K ) Peroxodisíran amonný (APS; Sigma, SRN) 20 Polyethylen glykol 20 000 (PEG 20 000; Sigma Aldrich, U S A ) Proteináza K (Roche Diagnostics, SRN) ProteoSilver Plus (Sigma-Aldrich, SRN) Pufr pro P C R (Apronex s.r.o., CR) Reagens Bradfordové (Bio-Rad, U S A ) Precision Plus Protein Standard (Bio-Rad, Taq D N A polymeráza (Apronex s.r.o., CR) N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED; Sigma, SRN) Thiamin (Koch-Light Laboratories Ltd, U K ) USA) Smal (Roche Diagnostics, SRN) Tris-base (Sigma, SRN) Trypsin (Promega, U S A ) Trypton (Oxoid, U K ) Yeast extract (Oxoid, U K ) 3.2.2. Kultivační a uchovávací média • 2 x Y T médium: trypton 16 g, NaCl 5 g, yeast extract 10 g, d d H 2 0 1000 ml. • Masopeptonový bujón (MPB): nutrient broth 13 g, pepton 5 g, yeast extract 3 g, d d H 2 0 1000 ml. • Masopeptonový agar 1,5 % (MPA): agar n.l 15 g, nutrient broth 13 g, pepton 5 g, yeast extract 3 g, d d H 2 0 1000 ml. • Masopeptonový agar 0,7 % (MPA): agar n.l 7 g, nutrient broth 13 g, pepton 5 g, yeast extract 3 g, d d H 2 0 1000 ml. • Upravené Hognessovo zamražovací médium (HMFM): 3,6 m M hydrogenfosforečnan draselný 0,164 g, 1,3 m M hydrogenfosforečnan draselný 0,035 g, 2,0 m M citronan sodný 0,118 g, 1,0 m M heptahydrát síranu horečnatého 0,049 g, 4,4 % (v/v) glycerol 8,8 ml. • Živné médium (dle N R L ) : brain-heart infusion 3,7 g, enzymatický hydrolyzát kaseinu 3 g, arginin 0,0125 g, agar n.3 1,5 g, kyselina nikotinová 0,13 mg, pantotenát vápenatý 0,06 mg, thiamin 0,05 mg, d d H 2 0 100 ml; pH upraveno na 7,5. 3.3. Laboratorní přístroje a software pro jejich ovládání • C H E F F M A P P E R (Bio-Rad, U S A ) : aparatura pro PFGE. • Protean II xi Cell (Bio-Rad, U S A ) : aparatura pro SDS-PAGE. • InGenius 3 (Syngene, U K ) ; Calibrated Densitometer GS-900 (Bio-Rad, USA): zobrazovací systémy. • S E T - R P L A „SEIKEN" a E X T - R P L A „SEIKEN" ( D E N K A SEIKEN, Japonsko): sady pro detekci vybraných toxinů S. aureus. • UltiMate 3000 RSLCnano, Chromeleon (verze 6.8): kapalinový chromatograf, jeho řídící systém; parametry předkolonek: 20 mm x 100 um, velikost částic 5 um, nepolární oktadecylová stacionární fáze (Cl8), velikost pórů 100Á: případně 30 mm x 100 um, 21 velikost částic 3,5 um, stacionární fáze C18; parametry analytických kolon: 500 mm x 0,75 mm, velikost částic 3 um, stacionární fáze C18, Acclaim PepMap 100 (Thermo Scientific, USA), velikost pórů 100 Á. • Ultraflex III (Bruker Daltonics, SRN): hmotnostní spektrometr použitý pro M A L D I - T O F M S . • Impact II (Bruker Daltonics, SRN) hmotnostní spektrometr typu QqTOF použitý pro L C M S / M S , tandemová analýza byla provedena pomocí kolizně indukované disociace (CID). • Orbitrap Elite (Thermo Scientifics, U S A ) vybavený iontovou pastí a orbitrapem hmotnostní spektrometr použitý pro L C - M S / M S , tandemová analýza byla provedena pomocí kolizní disociace za vyšších energií (HCD). 3.4. Software pro vyhodnocení dat • N C B I (National Center for Biotechnology Information): databáze nukleotidových sekvencí. • B L A S T (NCBI): sekvenční přiložení; Primer-BLAST: návrh primerů. • In silico simulace experimentů (http://insilico.ehu.es): in silico PCR. • Clustal Omega (Sievers et al, 2011): mnohonásobné srovnání sekvencí. • GeneSys a GeneTools (Syngene, U K ) ; ImageLab 5.1 (Bio-Rad, U S A ) : analýza výsledků gelové elektroforézy. • UniProtKB (European Bioinformatics Institute): databáze proteinových sekvencí. • Pro analýzu dat z L C - M S / M S experimentů byly použity varianty UniReflOO s taxonomickým omezením na Firmicutes (verze z července 2014, případně z května 2015) a UniRef90 s taxonomií Staphylococcus aureus (verze ze 27.10.2015). • Upravená cRAP databáze (The Global Proteome Machine, upraveno na pracovišti Středoevropského technologického institutu - CEITEC): databáze běžných kontaminant proteomických analýz. • Pfam 29.0 (EBI): databáze proteinových rodin. • PSORTdb (Rey et al, 2005; Nancy et al, 2011; Peabody et al, 2016): databáze lokalizace proteinů v buňkách. • CATH/Gene3D (Silitoe et al, 2014): klasifikace proteinových struktur. • FlexControl 3.0 a Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, SRN), DataAnalysis 4.2 (Bruker Daltonics, SRN), Thermo Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific, U S A ) , Mascot 2.4.1 a Mascot Percolator (MatrixScience), Sequest (University of Washington, USA): vyhodnocení dat z M A L D I - T O F M S profilování a L C - M S / M S analýz. 22 3.5. Metody 3.5.1. Stanovení citlivosti bakteriálních kmenů k temperovaným fágům Bakteriální kultura byla kultivována přes noc v 10 ml M P B při 37 °C. Do roztavených 0,7% M P A (2,5 ml) vytemperovaných na 45 °C bylo přidáno 0,1 ml bakteriální suspenze a CaCi2 (výsledná koncentrace 0,002 M). Vše bylo rychle promícháno a vylito na plotny s 1,5 % M P A . Po ztuhnutí agaru při pokojové teplotě byl ředěný lyzát testovaného fága nakapán (10 ul) na povrch agarového média. Pro každý kmen byly provedeny dvě paralely. Po vsáknutí kapek probíhala inkubace při 37 °C přes noc, následovalo vyhodnocení misek. 3.5.2. Lyzogenizace na agarových plotnách Kultura byla naočkována do 20 ml M P B a inkubována 18 hod při 37 °C. K e kultuře byl přidán 0,02 M CaCi2 (tak, aby tvořil 1/10 objemu) a 0,1 ml této suspenze bylo přeneseno do zkumavky s 0,7% M P A vytemperované na 45 °C. Obsah zkumavky byl vylit na Petriho misku s 1,5% M P A . Po zatuhnutí byly na misku napipetovány kapky (10 ul) lyzátu o titru Q Q 10 a 10 PFU/ml. Misky byly inkubovány 18 hod při 37 °C. V projasněných zónách byly nalezeny jednotlivé kolonie, které byly odebrány sterilním párátkem a přečárkovány na M P A s 0,01M citronanem sodným. Byly třikrát pasážovány na M P A s 0,01M citronanem sodným (vždy kultivovány 18-24 hod při 37 °C). Z izolovaných kultur byly připraveny hrubé buněčné lyzáty a byla provedena P C R pro detekci genu eta. 3.5.3. PFGE Kultura byla naočkována do 20 ml 2> 3')Cíl detekce fágový S G A 1 TATCAGGCGAGAATTAAGGG serotyp A SGA2 CTTTGACATGACATCCGCTTGAC fágový S G B 1 ACTTATCCAGGTGGYGTTATTG serotyp B SGB2 TGTATTTAATTTCGCCGTTAGTG fágový S G F 1 TACGGGAAAATATTCGGAAG serotyp Fa SGF2 ATAATCCGCACCTCATTCCT fágový SGF3 AGACACATTAAGTCGCACGATAG serotyp Fb SGF4 TCTTCTCTGGCACGGTCTCTT vnitřní S A U 1 GACGGCTTTGATGGCTAGTGG kontrola SAU2 AGTTAATTCACGCCCTAGTG geny pro: fágovou ami-11 F CCACGATCARTWCAATCTCC amidázu 1 ami-11 R C DCCC ATTG ATTG AC AYACT fágovou a m i - 1 2 F ATGTTYTTTATGWTAGCRACA amidázu 2 ami-12 R GTCCAWCCTTTACCRTTCC fágovou ami-13 F AAACATGGCAACAGTATATGA amidázu 3 ami-13 R ACGATTATCACCGTATCTAGT fágovou ami-eta F ATTTATTGAACGCTAACGTGT amidázu 4 ami-eta R CAGYGCTTGGCTTACTACTTG fágovou Sa1 int F AAGCTAAGTTCGGGCACA integrázu 1 Sa1 int R GT AATGTTTG G GAG CC AT fágovou Sa3int F GAAAAACAAACGGTGCTAT integrázu 3 Sa3int R TTATTGACTCTACAGGCTGA portálový por166_1 TTTGCAAAACGCATGATATT prot. o>166 por166_2 CGGGAAAATATTCGGAAGAA portálový porNM3_1 CGCTTTCATCTTCATCACCA prot. o>420 porNM3_2 CGGGAAAATATTCGGAAGAA enterotoxin A sea3 G CAG G GAAC AG CTTT AG G C sea4 GTTCTGTAGAAGTATGAAACACG exfoliatinA ETA-66 F ATACAGATGATAACGGTAATACT ETA-66 R ATAATTCCCAATACCAACAC Kontrola Složení reakční směsi Podmínky PCR Citace NCTC 8325 (744 bp) NCTC 8325 (405 bp) NCTC 8325 (548 bp) NCTC 8325 (147 bp) NCTC 8325 (217 bp) NCTC 8325 (364 bp) NCTC 8325 (254 bp) NCTC 8325 (430 bp) 98/534 (183 bp) 1039 (166+, 410+) (569 bp) 1039 (166+, 410+) (475 bp) 1039 (166+, 410+) (347 bp) 1039 (166+, 410+) (686 bp) 1039 (166+, 410+) (520 bp) 1039 (166+, 410+) (425 bp) 1x kone. pufr; SGA1/2 0,6 uM, SGB1/2 1,2 uM, SGF1/2 0,8 uM, SFG3/4 1 uM, SAU1/2 0,6 uM 94 °C 5'; 30x 94 °C ľ 58 °C 1'30", 70 °C 1'30"; 70 °C 5' 1x konc. pufr, MgCI2 0,2 m M , dNTP 0,016 m M ; ami-12 F/R 0,72 uM, ami-11 F/R 0,72 uM, ami-13 F/R 0,6 uM, ami ETA F/R 0,6 uM 1 x konc. pufr, MgCI2 94 °C 3 ' 1,125 uM; Salint F/R 57 °C ľ 0,15 uM, Sa3int F/R 5 ' 0,125 pM, por166_1/2 0,1 pM, porNM3_1/2 0,15 pM, sea3/4 0,1 pM, ETA-66 F/R 0,15 pM 95 °C 7'; 30x 94 °C 45' 53 °C 30", 72 °C 1 ' 2 0 " 72 °C 5' Pantuček etal., 2004 Kahánková etal., 2010 30x 94 °C 40", 72 °C ľ ; 72 °C LMDM; Goerke etal., 2009; Holochová etal., 2010; Monday a Bohach, 1999b 25 gen chips gen sak chips 1 chips 2 sak F sak R gen scin sen up sen low gen selp sep 1 sep 2 gen sea sea-1 sea-2 gen seb seb-1 seb-2 gen sec sec-1 sec-2 gen s e d sed-1 sed-2 gen see see-1 see-2 gen seg seg-1 seg-2 gen se/? seh-1 seh-2 gen sei sei-1 sei-2 gen sey sej-1 sej-2 gen tst tst-1 tst-2 gen era eta-1 eta-2 CACCATCATTCAGCGAAAG GATATATAAAGGTTTGGCAAG A A G G C G A T G A C G C G A G T T A T GCGCTTGGATCTAATTCAAC AGTCTTTTGACTTAAGAGC GTTTTAGCATCACCACTAGTA AATCATAACCAACCGAATCA TCATAATGGAAGTGCTATAA GCA G G G AAC A G C TTT A G G C GTTCTGTAGAAGTATGAAACACG ACATGTAATTTTGATATTCGCACTG TGCAGGCATCATGTCATACCA CTTGTATGTATGGAGGAATAACAA TGCAGGCATCATATCATACCA G T G G T G A A A T A G A T A G G A C T G C A T A T G A A G G T G C T C T G T G G TACCAATTAACTTGTGGATAGAC CTCTTTGCACCTTACCGC CGTCTCCACCTGTTGAAGG CCAAGTGATTGTCTATTGTCG CAACTGCTGATTTAGCTCAG GTCGAATGAGTAATCTCTAGG CAACTCGAATTTTCAACAGGTACC CAGGCAGTCCATCTCCTG CATCAGAACTGTTGTTCCGCTAG CTGAATTTTACCATCAAAGGTAC G C T T G C G A C A A C T G C T A C A G TGGATCCGTCATTCATTGTTAT CTAGTGCATTTGTTATTCAA TGCATTGACACCATAGTACT Newman (475 bp) Newman (222 bp) Newman (228 bp) 04/754 (499 bp) Newman (521 bp) 5757 (667 bp) 05/498 (284 bp) 78/2 (385 bp) 04/817 (171 bp) FRI 1169 (328 bp) SAH 822 (359 bp) FRI 1169 (446 bp) 10/5 (142 bp) 78/4 (559 bp) 2331 (119 bp) 1 * konc. pufr, MgCI2 0,25 m M ; 9 5 °C 5'; 30x 94 °C 3 0 " , nepublikováno chips 1/2 0,5 uM 50 °C 3 0 " , 72 °C 4 5 " ; 72 °C 5' 1x konc. pufr; sak F/R 0,5 uM 95 °C 5'; 30x 94 °C 3 0 " , van Wamel 50 °C 3 0 " , 72 °C 4 5 " ; et al., 2006 72 °C 5' 1 x konc. pufr; sen up/low 94 °C 5'; 30x 94 °C 3 0 " , nepublikováno 0,5 uM 46 °C 3 0 " , 72 °C 4 5 " ; 72 °C 5' 1x konc. pufr; sep 1/2 1 uM 95 °C 5'; 30x 94 °C 3 0 " , van Wamel 50 °C 3 0 " , 72 °C 4 5 " ; et al., 2006 1 x konc. pufr, MgCI2 1 m M ; sea-1/2 1,5 uM M1X1: 1x konc. pufr; mecA-1/2 0,5 uM MIX2: 1x konc. pufr; eta-1/2 0,5 pM, etb-1/2 0,5 pM, etd-1/2 0,5 pM MIX3: 1x konc. pufr; sea-1/2 0,75 pM, sej-1/2 0,75 pM MIX4: 1x konc. pufr, MgCI2 2 m M ; seb-1/2 0,75 pM, sec- 1/2 0,75 pM, see-112 0,75 pM, seh-1/2 0,75 pM MIX5: 1x konc. pufr, MgCI2 3,5 mM;sed-1/2 0,74 pM, seg-1/2 0,74 pM, sei-1/2 0,74 pM, tst-112 0,74 pM 72 °C 5' 94 °C 2'; 30x 94 °C 4 5 " , 53 °C ľ , 72 °C ľ ; 72 °C 5' M I X 1 : 9 4 ° C 4 ' ; 30x 94 °C 4 5 " , 60,5 °C 4 5 " , 72 °C ľ ; 72 ° C 2 ' MIX2: 94 °C 4 ' ; 35x 94 °C ľ , 52 °C 1'30", 72 °C ľ ; 72 °C T MIX3-5: 95 °C 5'; 35x 95 °C ľ , 63 °C 4 5 " , 72 °C ľ ; 72 °C 10' Monday a Bohach, 1999b Johnson etal., 1991; Lovseth et al., 2004; Monday a Bohach, 1999b; Růžičková etal., 2003 26 gen etb gen etd gen mecA gen hla gen hlb gen hld gen s e d geny sec2, seC3 agr typ I agr typ II agr typ III agr typ IV etb-1 etb-2 etd-1 etd-2 mecA-1 mecA-2 h la-F h la-R hlb-1 hlb-2 hld-F hld-R sec1-up sec2-low ACG G CT AT AT AC ATTC AATT TCCATCGATAATATACCTAA AACTATCATGTATCAAG G CAGAATTTCCCGACTCAG G T A G A A A T G A C T G A A C G T C C G A T A A CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA G C G A A G T C T G G T G A A A A C C C G T G G T T T A G C C T G G C C T T C A G T T G G T G C A C T T A C T G A C A A T G T G T A C C G A T A A C G T G A A C T G A A T T T G T T C A C T G T G T C G A T T C A C A G A G A T G T G A T G G A A A A GACATAAAAGCTAGGAATTT AAATCGGATTAACATTATCC sec2,3-up GTAATTTTGATATTCGCACT sec2,3-low CCTACATTATCTTTGGATGA agr agr agr agr agr agr agr agr - u p CACTTATCATCAAAGAGCC -low CC ACT AATT AT A G CTG G l-up G T A G A G C C G T A T T G A T T C C I- low GT ATTTC ATCTCTTT AAG G II- up CTGCATTTATTAGTGGAATACG I l-low GTTTCATTTCTTTAAGAG V-F CACTTATCATCAAAGAGCC V-R GT ATTTC ATCTCTTT AAG G 98/436 (200 bp) 2331 (376 bp) 11/48 (310 bp) COL (458 bp) COL (479 bp) COL (151 bp) 493/88 (257 bp) 778/02 (360 bp) 05/832 (351 bp) 439/98 (464 bp) Cowan (558 bp) 06/515 (894 bp) 1x kone. pufr, hla-F/R 0,4 |JM 94 °C 3'; 58 °C 30' 72 °C 5' 1x kone. pufr, hlb-1/2 0,6 |JM 94 °C 3'; 51 °C 30' 72 °C 5' 1x kone. pufr, hld-F/R 0,4 uM 94 °C 3'; 58 °C 30' 72 °C 5' 1 * kone. pufr, MgCI22,5 m M ; 94 °C 4'; sec1-up/low 1 uM 51 °C ľ , T 1 * kone. pufr, MgCI23,5 m M ; 94 °C 4'; sec2,3-up/low 1 uM 45 °C ľ , ľ 1 * kone. pufr pro PCR, MgCI294 °C 2'; 1,25 mM, 0,2 mM dNTP, Taq 55 °C 30' polymeráza 1,25 U; agrl- 72 °C 5' up/low 0,4 uM, agrll-up/low 0,4 uM, agrlll-up/low 0,4 uM, agr IV-F/R 0,4 uM 30x 94 °C 3 0 " , ', 68 °C 3 0 " ; 30x 94 °C ľ , ', 68 °C 3 0 " ; 30x 94 °C 3 0 " , ', 68 °C 3 0 " ; 30x 94 °C 2', 72 °C ľ ; 72 °C 30x 94 °C 2', 72 °C ľ ; 72 °C 30x 95 °C 3 0 " , ', 72 °C ľ ; v této práci van Wamel et al., 2006, upraveno v této práci Johnson etal., 1991 Kobayashi et al., 1998 nepublikováno; Moore a Lindsay, 2 0 0 1 ; Ten over et al., 2006; Bikandi et al., 2004 Legenda: u pozitivních kontrol je v závorce uvedena velikost amplikonu v bp; Poznámka: U multiplex-PCR reakcí je někdy uvedeno více autorů - jako prvn uvedeny publikace, v nichž byly použité primery poprvé popsány. portálový prot. - portálový protein, konc. pufr - koncentrovaný pufr. í jsou vždy citováni autoři protokolů pro multiplexní reakce, dále jsou 27 3.5.5. MALDI-TOF MS profilování Kultura byla naočkována na M P A a misky byly inkubovány přes noc při 37 °C. Druhého dne byla kultura odebrána kličkou a přenesena do mikrozkumavky, kde byla promíchána v 1,2 ml 70% ethanolu. Vzorek byl zcentrifugován 14 000x g/2 min, poté byl odpipetován supernatant a vzorek byl vysušen (pelet byl ponechán v otevřené mikrozkumavce přikryté sterilním víkem z Petriho misky při 37 °C). Proteiny byly extrahovány rozpuštěním peletu v 50 ul 70% F A a 50 ul A C N . Po centrifugaci (14 000x g/2 min) byl supernatant nanesen na tři pozice na M A L D I destičce (v množství 0,3 ul). Po zaschnutí byly vzorky převrstveny nasyceným roztokem H C C A ve směsi A C N , d d H 2 0 a T F A (50:47,5:2,5, v/v). Při měření byl sběr dat prováděn automaticky, po 1000 střelách z jednoho terčíku a přístroj byl nastaven na detekci v rozmezí 2 - 2 0 kDa. 3.5.6. Příprava supernatantu kultury pro proteomické analýzy Kultura byla zaočkovaná na živné médium (dle N R L ) a misky byly inkubovány 20 hod při 37 °C. Následovalo preočkovaní kultury na živné médium pokryté celofánem a další inkubace (20 hod při 37 °C). Celofán byl přenesen na víčko, zakapán 1,5 ml fyziologického roztoku (8,5 g NaCl v 1 1 ddH2 0) a byla získána buněčná suspenze. 100 ul suspenze bylo odebráno pro stanovení titru buněk (výpočtem kolonie-tvořících jednotek CFU). Dále byla suspenze centrifugována (6000x g/30 min/4 °C) a supernatant byl přefiltrován přes bakteriologický filtr (0,22 um). Následovala tepelná inaktivovace (95 °C/10 min), po které bylo 20 ul supernatantu zaočkováno na M P A pro ověření sterility. Koncentrace proteinů byla změřena podle metody Bradfordové (1976) kalibrované na IgG. 3.5.7. SDS-PAGE Polyakrylamidové gely byly tvořené 15 % (případně 12 %) rozděl ovacím gelem (15% akrylamid, 2,5% SDS, 0,38 M Tris-Cl (pH 8,8), 2,5% APS, T E M E D ) a 5% zaostřovacím gelem (5% akrylamid, 0,1% SDS, 0,4 M TrisCl (pH 6,8), 0,16% A P S , T E M E D ) . Vzorky byly smíchány se 4x koncentrovaným nanášecím pufrem (3,5 ml 100% glycerol, 2,5 ml 1M TrisC l (pH 6,8), 0,8 g SDS, 0,004 g bromfenolová modř, 0,62 g DTT, 4 ml ddH2 0) a spolu s markerem byly inkubovány 10 min při 95 °C. U 15% gelu bylo do jamky naneseno 120 ul směsi obsahující 68 ug proteinů, u 12% gelu bylo naneseno 101 ul směsi obsahující 61 ug proteinů, respektive 12 ul směsi se 6,8 ug proteinů. Pro elektroforézu byl použit elektroforetický pufr (3,03 g Tris-Cl, 14,42 g glycin, 1 g SDS, 1000 ml ddH2 0). Aparatura byla v průběhu elektroforézy chlazena na 10 °C. Po průchodu proteinů přes zaostřovací gel byl proud zvýšen z 15 raA na 30 m A. Po elektroforéze byl gel opláchnut d d H 2 0 a barven Biosafe Coomassie, respektive stříbrem. Posléze byl gel odbarven a vyfotografován. 28 3.5.8. LC-MS/MS analýza Pro L C - M S / M S analýzu byly využily tři metodické postupy, které jsou schematicky znázorněny na obrázku 2. Charakteristika metodických postupů: (1) Z polyakrylamidového gelu byly vyříznuty vybrané proužky a proteiny v nich byly po redukci a alkylaci štěpeny trypsinem; po kyselé extrakci peptidů následovala analýza na L C - M S / M S systému s hmotnostním spektrometrem Impact II; výsledky byly prohledávány proti databázi UniReflOO (Firmicutes, verze z července 2014). (2) Vzorky byly připraveny na filtru (FASP) přímo ze supernatantů bakteriální kultury, kde byly proteiny štěpeny trypsinem, redukovány, alkylovány a poté byly odstraněny vysokoi nízkomolekulární nečistoty; dále se pokračovalo stejně, jako v případě (1) - po kyselé extrakci následovala L C - M S / M S na přístroji s QqTOF (Impact II) a k analýze výsledků byla využita databáze UniReflOO {Firmicutes, verze z května 2015). (3) Po FASP a kyselé extrakci následovala L C - M S / M S analýza s využitím hmotnostního spektrometru Orbitrap Elite; výsledky byly prohledávány proti databázi stafylokokových proteinů (UniRef90, verze ze 27.10.2015). Obrázek 2. Znázornění tří metodických postupů 1D-GE F A S P vyřezání z gelu -> redukce a alkylace -»• enzymatické štěpení 0 kyselá extrakce 0 v " v " M S / M S (QqTOF) databáze Firmicutes - redukce a alkylace - enzymatické štěpení - propláchnutí odstranění vysoko- a nízkomolekulárních složek a kapalinová chromatografie v " M S / M S (OrbitrapElite) databáze stafylokokových proteinů Legenda: postupy jsou vyznačeny barevnými šipkami - 1. zelenými, 2. žlutými a 3. červenými; 1D-GE - jednorozměrná gelová elektroforéza, FASP - příprava vzorku na filtru, MS/MS - tandemová hmotnostní spektrometrie, QqTOF a OrbitrapElite - hmotnostní analyzátory. 29 Příprava vzorků po 1D-GE: Proužky proteinů vyřezané z gelu byly nařezány na malé kousky, přeneseny do mikrozkumavky a pětkrát promyty ve 100 ul vody (inkubace 5 min). Barvivo Coomassie bylo 15 min odbarvováno pomocí 50 ul směsi 50 m M A B C a 100% A C N (1:1), následovalo promytí ve 25 ul A C N (inkubace 5 min). Vzorek byl dále třikrát 5 min sonifikován, přičemž byl rozpuštěn poprvé v A B C roztoku, poté v A C N . Pro provedení redukce a alkylace bylo ke vzorku vysušeném ve vakuové odparce přidáno nejprve 20 ul 10 m M DTT na 45 min, poté 20 ul 55 m M I A A na 30 min. Vzorky byly dvakrát promyty, nejprve ve směsi A B C roztoku a A C N (1:1), pak v samotném A C N , přičemž pokaždé probíhala inkubace 25 min. Po vysušení vzorků ve vakuové odparce následovalo štěpení trypsinem (5 ng/ul; v A B C roztoku) 2 hodiny při 40 °C. Následovala kyselá extrakce. Příprava vzorků pomocí FASP: Podle upraveného protokolu F A S P bylo nejprve 200 ul vzorku (obsahujícího přibližně 100 ug proteinů) naneseno do ultrafiltrační centrifugační jednotky Microcon. Redukce byla provedena dvojnásobným propláchnutím ve 200 ul U A roztoku (8 M močovina v 0,1 M Tris-Cl; p H 8,5) s přídavkem 0,1 M DTT. Po promytí U A roztokem bylo ke vzorku na 20 min přidáno 100 ul 50 m M IAA. Dále byly vzorky třikrát propláchnuly ve 100 ul U A roztoku a třikrát ve 100 ul A B C roztoku. Štěpení trypsinem (0,5 ug/ul; v A B C roztoku) probíhalo 18 hod při 37 °C v prostředí s vyšší vlhkostí. Po přenesení vzorků do nových ultrafiltračních jednotek bylo dvakrát provedeno propláchnutí v 50 ul A B C roztoku. Výsledný objem vzorku byl 150 ul. Po vysušení vzorků ve vakuové odparce následovala kyselá extrakce. Kyselá extrakce: Roztok obsahující směs peptidů byl postupně přenášen z mikrozkumavky do L C - M S vialky obsahující 1,5 ul 0,01% P E G 20 000. Do mikrozkumavky bylo napipetováno 25 ul 5% F A a 25 ul A C N , pak byl roztok 10 min sonifikován. Pro závěrečnou extrakci bylo použito 100 25 ul A C N . Nakonec byl vzorek vysušen pomocí vakuové odparky. LC-MS/MS analýza (hmotnostní spektrometr Impact II): Peptidová směs byla separována v systému RSLCnano. Nejprve byly peptidy zachyceny a zakoncentrovány na předkolonce (20 mm x 100 um). Po promytí předkolonky 0,1% F A byly peptidy eluovány (průtok 300 nl/min) na analytickou kolonu (500 mm x 0,75 mm). Mobilní fáze se skládala zvodné (0,1 % F A ; v/v) a organické složky (80 % A C N , 0,1 % F A ; v/v). Při gradientově eluci s celkovou délkou 65 min v prvních 55 min rostla koncentrace organické mobilní fáze (1% v 1. min, 30% ve 35. min, 56% v 50. min, 80% v 5. min), v posledních 10 min byla 80%. Výstup z analytické kolony byl přímo spojen s iontovým zdrojem hmotnostního spektrometru, kterým byl nanosprej (nanoESI). 30 Měření na hmotnostním spektrometru probíhalo v režimu na datech závislé akvizice. Po provedení průzkumového skenu byly vybrány nej intenzivnější peptidy, které byly dále selektovány a fragmentovány pomocí CID fragmentace. Spektrometr analyzoval ionty v rozmezí od 150 do 2200 m/z. Pro každý kmen byla provedena čtyři nezávislá měření. LC-MS/MS analýza (hmotnostní spektrometr Orbitrap Elite): Separace peptidové směsi proběhla v systému RSLCnano. Po zachycení a zakoncentrování na předkolonce (30 mm x 100 um) byly peptidy eluovány promytím předkolonky 0,1% F A (průtok 300 nl/min) na analytickou kolonu (500 mm x 0,75 mm). Mobilní fáze se skládala zvodné (0,1 % F A ; v/v) a organické složky (80 % A C N , 0,1 % F A ; v/v). Gradientova eluce s celkovou délkou 120 min začala na 1% organické mobilní fázi a během prvních 100 min se zvýšilo její zastoupení na 65% (1% v 1. min, 14% ve 30. min, 30% v 60. min, 56% ve 100. min). V následujících 5 min se její zastoupení zvýšilo na 80% a v tomto stavu setrvalo dalších 15 min. Výstup analytické kolony byl přímo spojen s hmotnostním spektrometrem. Měření na hmotnostním spektrometru probíhalo v režimu na datech závislé akvizice. Po provedení průzkumového skenu byly vybrány nej intenzivnější peptidy, které byly dále selektovány a fragmentovány pomocí H C D fragmentace. Spektrometr analyzoval ionty v rozmezí od 350 do 2000 m/z s rozlišením 60 000 při 400 m/z. Při tandemové analýze se zaznamenávalo již od 100 m/z a rozlišení bylo 15 000 při 400 m/z. Analýza dat z MS/MS: Data byla nejprve rekalibrována pomocí programu Proteome Discoverer, poté byla prohledána proti databázi, kdy sekvence peptidů identifikovaných ve směsi byly přirovnávány k sekvencím peptidů vzniklých in silico štěpením bakteriálních, respektive stafylokokových proteinů. Na základě těchto přirovnání byla určena totožnost proteinů, které se před trypsinovým štěpením nacházely ve vzorku. Data ze systému QqTOF byla pomocí programu Mascot prohledána proti databázi UniReflOO s taxonomií Firmicutes. Data změřená na systému Orbitrap-Elite byla pomocí programů Mascot a Sequest prohledána proti databázi UniRef90 pro S. aureus. K cílové databázi byla přidána upravená databáze běžných kontaminant cRAP. V obou případech bylo databázové prohledávání nastaveno tak, že u trypsinového štěpení byla povolena maximálně dvě chybná štěpení; oxidace methioninu, deamidace asparaginu a glutaminu byly nastaveny jako variabilní a karbamidomethylace cysteinu jako fixní peptidové modifikace. Do výsledného reportu byly zahrnuty pouze M S / M S spektra se statisticky významným skóre (p > 0,01), respektive s q-hodnotou < 0,01 (určené skrze Mascot Percolator) a proteiny identifikované na základě alespoň jednoho unikátního peptidů (takového, který nebyl přiřazen k žádné jiné proteinové skupině v rámci daného reportu). 31 Pokud bylo k souboru identifikovaných peptidů přiřazeno více proteinů současně (kvůli redundantním záznamům v databázi), byl vzniklý soubor proteinů zahrnut do tzv. proteinové skupiny. Parametry charakterizující výsledky LC-MS/MS analýzy: počet peptidů (PP) udává množství peptidů, které byly přiřazeny k danému proteinu, přičemž některé peptidy mohly být přiřazeny k více různým proteinům; počet unikátních peptidů (PUP) vypovídá o tom, kolik peptidů bylo jedinečných pro daný protein; pokrytí sekvence (PS) vyjadřuje poměr aminokyselin v identifikovaných peptidech ku počtu aminokyselin v celé sekvenci proteinu. Pro relativní kvantifikaci byl využit tzv. „top3" kvantitativní algoritmus, který je založen na poznatku, že průměrná hodnota plochy tří nej intenzivnějších L C - M S píků náležejících peptidům určitého proteinu koreluje s absolutním množstvím daného proteinu ve směsi (Grossmann et al, 2010). Plocha tří nejhojnějších peaků pro proteiny identifikované ve směsích byla stanovena pro čtyři nezávislá měření, a následně byl z těchto hodnot určen medián plochy píků proteinu (MPPP). 32 4. Výsledky V této kapitole je uveden přehled výsledků dosažených při studiu kmenů S. aureus, které byly lyzogenizovány ETA-konvertujícími bakteriofágy. K e studiu lyzogenní konverze byly vedle metod molekulární biologie použity i imunologické a proteomické metody. 4.1. Lyzogenizace MRSA kmenů ETA-konvertujícím bakteriofágem Před samotnou lyzogenizací byl proveden test citlivosti deseti M R S A kmenů k pěti ETA-konvertujícím bakteriofágům. Při testu byla hodnocena schopnost fágů lyžovat bakterie. Na základě tohoto testu (tabulka 5) byly k lyzogenizací fágem Ó166 vybrány kmeny UL21, S321A a SA2090. Tabulka 5. Test citlivosti vybraných M R S A kmenů k ETA-konvertujícím bakteriofágům MRSA kmeny ETA-konvertující bakteriofágyMRSA kmeny

Inoshima, I., Inoshima, N., Wilke, G. A., Powers, M . E., Frank, K. M., Wang, Y., Bubeck Wardenburg, J. (2011) A Staphylococcus aureus pore-forming toxin subverts the activity of A D A M 10 to cause lethal infection in mice. Nat Med 17 (10): 1310-1314. 62 Jin, T., Bokarewa, M . , Foster, T., Mitchell, J., Higgins, J., Tarkowski, A. (2004) Staphylococcus aureus resists human defensins by production of staphylokinase, a novel bacterial evasion mechanism. 7 Immunol 172 (2): 1169-1176. Johnson, W. M . , Tyler, S. D., Ewan, E . P., Ashton, F. E., Pollard, D. R., Rozee, K. R. (1991) Detection of genes for enterotoxins, exfoliative toxins, and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by the polymerase chain reaction. 7 Clin Microbiol 29 (3): 426- 430. Kahánková, J., Pantůček, R., Goerke, C , Růžičková, V., Holochová, P., Doškář, J. (2010) Multilocus P C R typing strategy for differentiation of Staphylococcus aureus siphoviruses reflecting their modular genome structure. Environ Microbiol 12 (9): 2527-2538. Kaito, C , Saito, Y., Ikuo, M . , Omae, Y., Mao, H., Nagano, G., Fujiyuki, T., Numata, S., Han, X . , Obata, K., Hasegawa, S. (2013) Mobile genetic element S C C mec-encoded psmmec R N A suppresses translation of agrA and attenuates M R S A virulence. PLoS Pathog 9 (4): el003269. Kaneko, J., Kamio, Y. (2004) Bacterial two-component and hetero-heptameric pore-forming cytolytic toxins: structures, pore-forming mechanism, and organization of the genes. Biosci Biotech Biochem 68 (5): 981-1003. Kaprál, F.A., Miller, M . M . (1971) Product of Staphylococcus aureus responsible for the scalded-skin syndrome. Infect Immun 4 (5): 541-545. Karas, M . , Hillenkamp, F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10 000 Daltons. Anal Chem 60 (20): 2299-2301. Khoon, L.Y., Neela, V. (2010) Secretome of Staphylococcus aureus. Afr J Microbiol Res 4 (7): 500-508. Kientz, C. E., Hulst, A. G., Wils, E . R. (1997) Determination of staphylococcal enterotoxin B by on-line (micro) liquid chromatography-electrospray mass spectrometry. 7 Chromatogr A 757 (1-2): 51-64. Kikuchi, K., Takahashi, N., Piao, C., Totsuka, K., Nishida, H., Uchiyama, T. (2003) Molecular epidemiology of meticillin-resistant Staphylococcus aureus strains causing neonatal toxic shock syndrome-like exanthematous disease in neonatal and perinatal wards. 7 Clin Microbiol 41 (7): 3001-3006. Kluge, S., Hoffmann, M . , Benndorf, D., Rapp, E . , Reichl, U. (2012) Proteomic tracking and analysis of a bacterial mixed culture. Proteomics 12 (12): 1893-1901. Kobayashi, N., Okada, J. I., Kojima, K., Urasawa, S., Uehara, N., Watanabe, N. (1998) Molecular discrimination of enterotoxin C subtype in clinical isolates of Staphylococcus aureus. Diagn Microbiol Infect Dis 32 (3): 243-246. Konig, B., Prevost, G. Konig, W. (1997) Composition of staphylococcal bi-component toxins determines pathophysiological reactions. J Med Microbiol 46 (6): 479-485. 63 Kuroda, M . , Ohta, T., Uchiyama, I., Baba, T., Yuzawa, H., Kobayashi, I., Cui, L . , Ogushi, A., Aoki, K., Nagai, Y., Lian, J., Ito, T., Kanamori, M . , Matsumaru, H., Maruyama, A., Murakami, H., Hosoyama, A., Mizutani-Ui, Y., Takahashi, N. K., Sawano, T., Inoue, R., Kaito, C , Sekimizu, K., Hirakawa, H., Kuhara, S., Goto, S., Yabuzaki, J., Kanehisa, M., Yamashita, A., Oshima, K., Furuya, K., Yoshino, C , Shiba, T., Hattorf, M . , Ogasawara, N., Hayashi, H., Hiramatsu, K. (2001) Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet 357 (9264): 1225-1240. Le Maréchal, C , Seyffert, N., Jardin, J., Hernandez, D., Jan, G., Rault, L., Azevedo, V., Francois, P., Schrenzel, J., Van De Guchte, M . , Even, S. (2011) Molecular basis of virulence in Staphylococcus aureus mastitis. PLoS One 6(11): e27354. Lee, E . Y., Choi, D. Y., Kim, D. K., Kim, J. W., Park, J. O., Kim, S., Kim, S. H., Desiderio, D. M . , Kim, Y. K., Kim, K. P., Gho, Y. S. (2009) Gram-positive bacteria produce membrane vesicles: Proteomics-based characterization of Staphylococcus aureusderived membrane vesicles. Proteomics 9 (24): 5425-5436. Liew, Y. K., Hamat, R. A., van Belkum, A., Chong, P. P., Neela, V. (2015) Comparative exoproteomics and host inflammatory response in Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections, bacteremia, and subclinical colonization. Clin Vaccine Immunol 22 (5): 593-603. Lin, C. F., Chen, C. L., Huang, W. C , Cheng, Y. L., Hsieh, C. Y., Wang, C. Y., Hong, M . Y. (2010) Different types of cell death induced by enterotoxins. Toxins 2 (8): 2158-2176. Lindsay, J. A., Foster, S. J. (1999) Interactive regulatory pathways control virulence determinant production and stability in response to environmental conditions in Staphylococcus aureus. Mol Gener Gen MGG 262 (2): 323-331. Lindsay, J. A., Holden, M . T. (2004) Staphylococcus aureus: superbug, super genome? Trends Microbiol 12 (8): 378-385. Loffler, B., Hussain, M., Grundmeier, M., Bruck, M., Holzinger, D., Varga, G., Roth, J., Kahl, B. C , Proctor, R. A., Peters, G. (2010) Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin is a very potent cytotoxic factor for human neutrophils. PLoS Pathog 6 (1): el000715. Lovseth, A., Loncarevic, S., Berdal, K. (2004) Modified multiplex P C R method for detection of pyrogenic exotoxin genes in staphylococcal isolates. 7 Clin Microbiol 42 (8): 3689-3872. Makris, G., Wright, J. D., Ingham, E., Holland, K. T. (2004) The hyaluronate lyase of Staphylococcus aureus - a virulence factor? Microbiol 150 (6): 2005-2013. McGavin, M . J., Zahrádka, C , Rice, K., Scott, J. E . (1997) Modification of the Staphylococcus aureus fibronectin binding phenotype by V 8 protease. Infect Immun 65 (7): 2621-2628. Mellor, I. R., Thomas, D. H., Sansom, M . S. P. (1988) Properties of ion channels formed by Staphylococcus aureus d-toxin. Biochim Biophys Acta 942 (2): 280-294. 64 Monday, S. R., Vath, G. M., Ferens, W. A., Deobald, C., Rago, J. V., Gahr, P. J., Monie, D. D., Iandolo, J. J., Chapes, S. K., Davis, W. C. Ohlendorf, D. H . (1999a) Unique superantigen activity of staphylococcal exfoliative toxins. J Immunol 162 (8): 4550-4559. Monday S. R., Bohach G. A. (1999b) Use of multiplex P C R to detect classical and newly described pyrogenic toxin genes in staphylococcal isolates. 7 Clin Microbiol 37 (10): 3411- 3414. Moore, P. C. L . , Lindsay, J. A. (2001) Genetic variation among hospital isolates of methicillin-sensitive Staphylococcus aureus: Evidence for horizontal transfer of virulence genes. 7 Clin Microbiol 39 (8): 2760-2767. Moreillon, P., Entenza, J. M . , Francioli, P., McDevitt, D., Foster, T. J., Francois, P., Vadaux, P. (1995) Role of Staphylococcus aureus coagulase and clumping factor in pathogenesis of experimental endocarditis. Infect Immun 63 (12): 4738-4743. Muthukrishnan, G., Quinn, G. A., Lamers, R. P., Diaz, C , Cole, A. L., Chen, S., Cole, A. M . (2011) Exoproteome of Staphylococcus aureus reveals putative determinants of nasal carriage. JProteomRes 10 (4): 2064-2078. Nakano, M . , Kawano, Y., Kawagishi, M . , Hasegawa, T., Iinuma, Y., Ohta, M . (2002) Two-dimensional analysis of exoproteins of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) for possible epidemiological applications. Microbiol Immunol 46 (1): 11-22. Nancy, Y. Y., Laird, M . R., Spencer, C , Brinkman, F. S. (2011) PSORTdb—an expanded, auto-updated, user-friendly protein subcellular localization database for Bacteria and Archaea. Nucleic Acids Res 39: D241-D244. Narita, S., Kaneko, J., Chiba, J., Piemont, Y., Jarraud, S., Etienne, J., Kamio, Y. (2001) Phage conversion of Panton-Valentine leukocidin in Staphylococcus aureus: molecular analysis of a PVL-converting phage, (pSLT. Gene 268 (1): 195-206. Nedelkov, D., Rasooly, A., Nelson, R. W. (2000) Multitoxin biosensor-mass spectrometry analysis: a new approach for rapid, real-time, sensitive analysis of staphylococcal toxins in food. Int J Food Microbiol 60 (1): 1-13. Nienaber, J. J. C , Sharma Kuinkel, B. K., Clarke-Pearson, M . , Lamlertthon, S., Park, L., Rude, T. H., Barriere, S., Woods, C. W., Chu, V. H., Marin, M., Bukovski, S., Garcia, P., Corey, G. R., Korman, T., Doco-Lecompte, T., Murdoch, D. R., Reller, L . B., Fowler Jr, V. G. (2011) Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus endocarditis isolates are associated with Clonal Complex 30 genotype and a distinct repertoire of enterotoxins and adhesins. J Infect Dis 204 (5): 704-713. Ohbayashi, T., Irie, A., Murakami, Y., Nowak, M . , Potempa, J., Nishimura, Y., Shinohara, M . Imamura, T. (2011) Degradation of fibrinogen and collagen by staphopains, cysteine proteases released from Staphylococcus aureus. Microbiol 157 (3): 786-792. Omoe, K., Hu, D. L . , Takahashi-Omoe, H., Nakane, A., Shinagawa, K. (2003) Identification and characterization of a new staphylococcal enterotoxin -related putative toxin encoded by two kinds of plasmids. Infec Immun 71 (10): 6088-6094. 65 Omoe, K., Hu, D. L . , Takahashi-Omoe, H., Nakane, A., Shinagawa, K. (2005) Comprehensive analysis of classical and newly described staphylococcal superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus isolates. FEMS Microbiol Lett 246 (2): 191-198. Ono, H . K., Omoe, K., Imanishi, K., Iwakabe, Y., Hu, D. L., Kato, H., Saito, N., Nakane, A., Uchiyama, T., Shinagawa, K. (2008) Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T. Infect Immun 76 (11): 4999-5005. Onogawa, T. (2002) Staphylococcal a-toxin synergistically enhances inflammation caused by bacterial components. FEMS Immunol Med Microbiol 33 (1): 15-21. Oogai, Y., Matsuo, M . , Hashimoto, M . , Kato, F., Sugai, M . , Komatsuzawa, H . (2011) Expression of virulence factors by Staphylococcus aureus grown in serum. Appl Environ Microb 11 (22): 8097-8105. O'Seaghdha, M . , van Schooten, C.J., Kerrigan, S.W., Emsley, J., Silverman, G.J., Cox, D., Lenting, P.J., Foster, T.J. (2006) Staphylococcus aureus protein A binding to von Willebrand factor A l domain is mediated by conserved IgG binding regions. FEBS 7 273 (21): 4831-4841. Pantůček R., Doškář J., Růžičková V., Kašpárek P., Oráčova E., Kvardová V., Rosypal S. (2004) Identification of bacteriophage types and their carriage in Staphylococcus aureus. Arch. Virol. 149: 1689-703. Peabody, M.A., Laird, M.R., Vlasschaert, C , Lo, R., Brinkman, F.S. (2016) PSORTdb: expanding the bacteria and archaea protein subcellular localization database to better reflect diversity in cell envelope structures. Nucleic Acids Res 44 (Dl): D663-D668. Peres, A . G . , Madrenas, J. (2013) The broad landscape of immune interactions with Staphylococcus aureus: from commensalism to lethal infections. Burns 39 (3): 380-388. Pocsfalvi, G., Cacace, G., Cuccurullo, M . , Serluca, G., Sorrentino, A., Schlosser, G., Giuseppe Blaiotta, Malorni, A. (2008) Proteomic analysis of exoproteins expressed by enterotoxigenic Staphylococcus aureus strains. Proteomics 8 (12): 2462-2476. Potempa, J., Dubin, A., Korzus, G., Travis, J. (1988) Degradation of elastin by a cysteine proteinase from Staphylococcus aureus. J Biol Chem 263(6): 2664-2667. Priest, N. K., Rudkin, J. K., Fell, E . J., van den Elsen, J. M . H., Cheung, A., Peacocsk, S. J., Laabei, M . , Lucks, D. A., Recker, M . , Massey, R. C. (2012) From genotype to phenotype: can systems biology be used to predict Staphylococcus aureus virulence? Nat Rev Microbiol 10: 791-797. Queck, S. Y., Khan, B. A., Wang, R., Bach, T. H . L . , Kretschmer, D., Chen, L . , Kreiswirth, B. N., Peschel, A., DeLeo, F. R., Otto, M . (2009) Mobile genetic elementencoded cytolysin connects virulence to methicillin resistance in M R S A. PLoS Pathog 5 (7): el000533. Rasschaert, G., Vanderhaeghen, W., Dewaele, L , Janež, N., Huijsdens, X., Butaye, P., & Heyndrickx, M . (2009) Comparison of fingerprinting methods for typing methicillinresistant Staphylococcus aureus sequence type 398. 7 Clin Microbiol 47 (10): 3313-3322. 66 Ravipaty, S. a Reilly, J.P. (2010) Comprehensive characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus subsp. aureus C O L secretome by two-dimensional liquid chromatography and mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 9 (9): 1898-1919. Resch, A., Leicht, S., Saric, M . , Pásztor, L . , Jakob, A., Götz, F., Nordheim, A. (2006) Comparative proteome analysis of Staphylococcus aureus biofilm and planktonic cells and correlation with transcriptome profiling. Proteomics 6 (6): 1867-1877. Rey, S., Acab, M . , Gardy, J.L., Laird, M.R., Lambert, C , Brinkman, F.S. (2005) PSORTdb: a protein subcellular localization database for bacteria. Nucleic Acids Res 33 (suppl 1): D164-D168. Rogasch, K., Rühmling, V., Pané-Farré, J., Höper, D.,Weinberg,C, Fuchs, S., Schmudde, M . , Bröker, B. M . , Wolz, C , Hecker, M . , Engelmann, S. (2006) Influence of the two-component system SaeRS on global gene expression in two different Staphylococcus aureus strains. J Bacteriol 188: 7742-7758. Rollof, J., Braconier, J. H., Söderström, C , Nilsson-Ehle, P. (1988) Interference of Staphylococcus aureus lipase with human granulocyte function. Europ J of Clin Microbiol Infect Dis 7 (4): 505-510. Rooijakkers, S. H . M . , Van Wamel, W. J. B., Ruyken, M . , Van Kessel, K. P. M . , Van Strijp, J. A. G. (2005a) Anti-opsonic properties of staphylokinase. Microbes Infect 7 (3): 476-484. Rooijakkers, S. H . M . , Ruyken, M . , Roos, A., Daha, M . R., Presanis, J. S., Sim, R. B., Van Wamel, W. J. B., Van Kessel, K. P. M., Van Strijp, J. A. G. (2005b) Immune evasion by a staphylococcal complement inhibitor that acts on C3 convertases. Nature Immunol 6 (9): 920-7. Rudkin, J. K., Edwards, A. M . , Bowden, M . G., Brown, E . L . , Pozzi, C , Waters, E . M . , Chan, W. C , Williams, P., O'Gara, J. P., Massey, R. C. (2012) Methicillin resistance reduces the virulence of healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus by interfering with the agr quorum sensing system. 7 Infect Dis 205: 798-806. Růžičková, V., Pantůček, R., Petráš, P., Doškář, J., Sedláček, I. and Rosypal, S. (2003) Molecular typing of exfoliative toxin-producing Staphylococcus aureus strains involved in epidermolytic infections. Int J Med Microbiol 292: 541-545. Růžičková, V., Pantůček, R., Petráš, P., Machová, I., Kostýlková, K., Doškář, J. (2012) Major clonal lineages in impetigo Staphylococcus aureus strains isolated in Czech and Slovak maternity hospitals. Int J Med Microbiol 302 (6): 237-241. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y. Schwartz, K., Šyed, A. K., Stephenson, R. E., Rickard, A. H., Boles, B. R. (2012) Functional amyloids composed of phenol soluble modulins stabilize Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathog 8 (6): el002744. 67 Sibbald, M . J. J. B., Ziebandt, A. K., Engelmann, S., Hecker, M., de Jong, A., Harmsen, H. J. M., Raangs, G. C., Stokroos, I., Arends, J. P., Dubois, J. Y. F., van Dijl, J. M . (2006) Mapping the pathways to staphylococcal pathogenesis by comparative secretomics. Microb Mol Biol Rev 70 (3): 755-788. Sievers, F., Wilm, A., Dineen, D. G., Gibson, T. J., Karplus, K., Li, W., Lopez, R., McWilliam, H., Remmert, M . , Söding, J., Thompson, J. D., Higgins, D. G. (2011) Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Sys Biol 7 (539). Sikora, A . E . , Zielke, R.A., Lawrence, D.A., Andrews, P.C., Sandkvist, M . (2011) Proteomic analysis of the Vibrio cholerae type II secretome reveals new proteins, including three related serine proteases. J Biol Chem 286 (19): 16555-16566. Sillitoe, I., Lewis, T.E., Cuff, A., Das, S., Ashford, P., Dawson, N.L., Furnham, N., Laskowski, R.A., Lee, D., Lees, J.G., Lehtinen, S. (2014) C A T H : comprehensive structural and functional annotations for genome sequences. Nucleic Acids Res: gku947. Sospedra, I., Marin, R., Manes, J., Soriano, J. M . (2012) Rapid whole protein quantification of staphylococcal enterotoxin B by liquid chromatography. Food Chem 133 (1): 163-166. Stehr, F., Kretschmar, M . , Kröger, C , Hube, B., Schäfer, W. (2003) Microbial lipases as virulence factors. J Mol Catal B: Enzym 22 (5): 347-355. Szabados, F., Woloszyn, J., Richter, C , Kaase, M., Gatermann, S. (2010) Identification of molecularly defined Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry and the Biotyper 2.0 database. 7 Med Microbiol 59: 787-790. Tenover, F. C , Pearson, M . L . (2004) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Emerg InfectDis 10 (II): 2052. Tenover, F.C., McDougal, L.K., Goering, R.V., Killgore, G., Projan, S.J., Patel, J.B. and Dunman, P.M. (2006) Characterization of a strain of community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus widely disseminated in the United States. 7 Clin Microbiol 44: 108-118. Thomas, D. Y., Jarraud, S., Lemercier, B., Cozon, G., Echasserieau, K., Etienne, J., Gougeon, M . L., Lina G., Vandenesch, F. (2006) Staphylococcal enterotoxin-like toxins U2 and V , two new staphylococcal superantigens arising from recombination within the enterotoxin gene cluster. Infect Immun 74 (8): 4724-4734. Tong S. Y. C , Chen, L . F., Fowler, V. G. (2012) Colonization, pathogenicity, host susceptibility, and therapeutics for Staphylococcus aureus: what is the clinical relevance? Semin Immunopathol 34: 185-200. Trost, M . , Wehmhöner, D., Karst, IL, Dieterich, G., Wehland, J., Jänsch, L . (2005) Comparative proteome analysis of secretory proteins from pathogenic and nonpathogenic Listeria species. Proteomics 5 (6): 1544-1557. 68 van Wamel, W.J.B., Rooijakkers, S.H.M., Ruyken, M . , van Kessel, K.P.M. and van Strijp, J.A.G. (2006) The innate immune modulators staphylococcal complement inhibitor and Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus are located on ß-hemolysinconverting bacteriophages. J Bacteriol 188: 1310-1315. Vanassche, T., Peetermans, M . , van Aelst, L . N., Peetermans, W. E., Verhaegen, J., Missiakas, D. M . , Schneewind, O., Hoylaerts, M . F., Verhamme, P. (2013) The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections. 7 Infect Dis 208: 92-100. Ventura, C.L., Malachowa, N., Hammer, C H . , Nardone, G.A., Robinson, M.A., Kobayashi, S.D., DeLeo, F.R. (2010) Identification of a novel Staphylococcus aureus twocomponent leukotoxin using cell surface proteomics. PLoS One 5 (7): e l 1634. Walev, I., Martin, E., Jonas, D., Mohamadzadeh, M . , Muller-Klieser, W., Kunz, L . , Bhakdi, S. (1993) Staphylococcal alpha-toxin kills human keratinocytes by permeabilizing the plasma membrane for monovalent ions. Infect Immun 61 (12): 4972-4979. Wang, R., Braughton, K. R., Kretschmer, D., Bach, T. H., Queck, S. Y., L i , M . , Kennedy, A. D., Doward, D. W., Klebanoff, S. J., Peschel, A., DeLeo, F. R., Otto, M . (2007) Identification of novel cytolytic peptides as key virulence determinants for community-associated M R S A . Nat Med 13 (12): 1510-1514. Wilson, G. J., Seo, K. S., Cartwright, R. A., Connelley, T., Chuang-Smith, O. N., Merriman, J. A., Guinane, C. M . , Park, J. Y., Bohach, G. A., Schlievert, P. M . , Morrison, W. I., Fitzgerald, J. R. (2011) A novel core genome-encoded superantigen contributes to lethality of community-associated M R S A necrotizing pneumonia. PLoS Pathog 7(10):el002271. Wolters, M . , Rohde, H., Maier, T., Belmar-Campos, C., Franke, G., Scherpe, S., Aepfelbacher, M . , Christner, M . (2011) M A L D I - T O F M S fingerprinting allows for discrimination of major methicillin resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol 301: 64-68. Yamaguchi, T., Hayashi, T., Takami, H., Nakasone, K., Ohnishi, M . , Nakayama, K., Yamada, S., Kromatsuzawa, H., Sugai, M . (2000) Phage conversion of exfoliative toxin A production in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 38 (4): 694-705. Yamaguchi, T., Hayashi, T., Takami, H., Ohnishi, M . , Murata, T., Nakayama, K., Asakawa, K., Ohara, M . , Kromatsuzawa, H . , Sugai, M . (2001) Complete nucleotide sequence of a Staphylococcus aureus exfoliative toxin B plasmid and identification of a novel ADP-ribosyltransferace, EDIN-C. Infect Immun 69 (12): 7760-7771. Yamaguchi, T., Nishifuji, K., Sasaki, M . , Fudaba, Y., Aepfelbacher, M . , Takata, T., Ohara, M . , Kromatsuzawa, H., Amagai, M . , Sugai, M . (2002) Identification of the Staphylococcus aureus etd pathogenicity island which encodes a novel exfoliative toxin, ETD, and EDIN-B. Infect Immun 70 (10): 5835-5845. Yamasaki, O., Yamaguchi, T., Sugai, M . , Chapuis-Cellier, C , Arnaud, F., Vandenesch, F., Etienne, J., Lina, G. (2005) Clinical manifestations of staphylococcal scalded-skin syndrome depend on serotypes of exfoliative toxins. 7 Clin Microbiol 43 (4): 1890-1893. 69 Yoshizawa, Y. (1985) Isolation and characterization of restriction negative mutants of Staphylococcus aureus. Jikeikai Med J 32: 415-421. Zhang, S., Iandolo, J. J., Stewart, G. C. (1998) The enterotoxin D plasmid of Staphylococcus aureus encodes a second enterotoxin determinant (sej). FEMS Microbiol Lett 168 (2): 227-233. Ziebandt, A. K., Weber, H., Rudolph, J., Schmid, R., Höper, D., Engelmann, S., Hecker, M . (2001) Extracelullar proteins of Staphylococcus aureus and the role of SarA and g B . Proteomics 1: 480-493. Ziebandt, A. K., Becher, D., Ohlsen, K., Hacker, J., Hecker, M . , Engelmann, S. (2004) The influence of agr and g B in growth phase dependent regulation of virulence factors in Staphylococcus aureus. Proteomics 4 (10): 3034-3047. 70