MASARYKOVA UNIVERZITA Prírodovedecká fakulta ÚSTAV EXPERIMENTÁLNEJ BIOLOGIE ODDELENIE GENETIKY A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Štúdium interakcií proteínov a telomerickej DNA Diplomová práca Brno, 2008 Ján Boroň Rád by som sa poďakoval rodičom za to, že mi umožnili študovať a svojmu školiteľovi Mgr. Ctiradovi Hofrovi, Ph.D. za trpezlivosť a vedenie pri zostavovaní práce. 2 O B S A H 1. Úvod 5 1.1. Teloméry 5 1.1.1. Telomerická DNA 5 1.1.2. Skracovanie telomér 6 1.1.3. Telomeráza 7 1.2. Proteínová zložka telomér 8 1.2.1. Interakcie proteínov s ds DNA 8 1.2.2. Shelterinový komplex 8 1.2.2.1. Proteiny shelterinu pre priamu väzbu na DNA 9 1.2.2.1.1. TRF proteiny 9 1.2.2.1.2. POT protein 10 1.2.2.2. Protein sprostredkujúci komplexáciu shelterinu proteín-proteín interakciami 10 1.2.2.3. Modulácia tvaru telomér shelterinom 12 1.2.3. Interakcie shelterinu s ssDNA 14 1.2.3.1. 3'presah a jeho ochrana 14 1.2.4. Interakcie proteínov shelterinu s dalšími proteínmi 17 1.3. Anizotropia fluorescencie: teoretický základ 17 2. Ciele diplomovej práce 21 3. Materiál a Metódy 22 3.1. Klonovanie TIN2 22 3.2. Expresia TIN2 23 3.3. Purifikácia TIN2 23 3.4. EMSA (Elektrophoretic mobility shift assay) 24 3.5. Anizotropia fluorescencie 25 4. Výsledky 27 4.1. Optimalizácia expresie a purifikácia TIN2 proteinu 27 4.2. Stechiometria interakcie TIN2 s TRF2-YFP 28 4.3. Stanovenie väzbovej afinity TIN2 a TRF2 29 5. Diskusia 31 5.1. Expresia a purifikácia TIN2 proteinu 31 3 5.2. Stechiometria interakcie TIN2 s TRF2-YFP 32 5.3. Stanovenie väzbovej afinity TIN2 a TRF2 33 5.4. Faktor koncentrácie TIN2 proteínu 33 5.5. Záver 34 6. Súhrn 36 7. Summary 37 8. Literatúra 38 9. Použité skratky 44 4 1. Úvod Lineárne chromozómy poskytujú svojim nositeľom funkčné výhody pri rekombinácii, keďže lineárne chromozómy sa rekombinujú častejšie a poskytujú tým evolučnú výhodu. Na druhej strane je nevýhodou z hľadiska funkcie chromozómov, že ich konce musia byť chránené pred reparačnými mechanizmami bunky, aby neboli rozpoznané ako veľmi nebezpečné chromozómové zlomy. Navyše na koncoch chromozómov dochádza k neúplnej replikácii. Preto, aby tento fakt nemal dopad na stratu genetickej informácie, sú na koncoch chromozómov repetitívne časti DNA, ktoré nenesú genetickú informáciu. Konce chromozómov, ktoré plnia ochrannú funkciu, sa nazývajú teloméry. Nasledujúca časť tejto práce sa bude zaoberať popisom stavby telomér a proteínov, ktoré sa podieľajú na ochrannej funkcii telomér. 1.1 Teloméry Teloméry sú koncové časti chromozómov eukaryotických organizmov. Slovo teloméra zaviedol v roku 1938 Herman Muller pri štúdiu Drosophila melanogaster a pochádza z gréckych slov telos (koniec) a meros (časť). Z hľadiska molekulárnej štruktúry sa jedná o komplex DNA a proteínov. 1.1.1. Telomerická DNA DNA, ktorá sa nachádza v koncovej časti chromozómov, tvorí tandemové repetície nukleotidov. U človeka a ostatných stavovcov sa jedná o opakujúci sa motív 5'- [TTAGGG]n-3' (Moyzis etal., 1988). Celková dĺžka telomér je u človeka 5 až 15 kb (Kipling and Cooke, 1990). Dĺžka telomér sa mení v závislosti od organizmu, napríklad rastlina A. thaliana má extrémne krátke teloméry, ktorých dĺžka sa pohybuje v intervale 2 až 9 kb (Sharikov and Shippen, 2004). Naproti tomu pri tabaku sú pozorované extrémne dlhé teloméry, ktorých dĺžka sa pohybuje od 60 do 160kb (Fajkus etal., 1995). Vlákna telomerickej DNA sa označujú podľa zastúpenia nukleotidov ako Gvlákno a C-vlákno, teda vlákno bohaté na guanín a k nemu komplementárne vlákno bohaté na cytozín. G-vlákno vytvára na 3'strane jednoreťazový presah, ktorý sa 5 označuje aj ako G-presah. Dĺžka G-presahu sa podobne, ako celková dĺžka telomér mení, napr.: 130-210 u človeka (Makarov eŕa/.,1997) a 20-30 nukleotidov pri rastline A thaliana (Riha etal., 2000). 1.1.2. Skracovanie telomér V úvode spomínaný problém s replikáciou koncov chromozómov nastáva pri replikácii lineárnych chromozómov, presnejšie je to problém s dokončením syntézy 3^T 5' Obr. 1: (Rosypal, 2002) matricový řecěz&c 315' ve de u; i > t é z ř c -5' -ľ RNA-primer OkazaKltio fragmenty matricový řetězec RNA-primer • po lyd eoxyríbon uklectldovýl Feteaec v 5' -3' Sa' 31 - smér odbourávání RNA-prvnarů 5J- •pri -směr doplňováni deoxyribo nukleotidy— 5W 5' a- S'3* I 5' J' 5' I 3'konca chromozómov. Replikácia DNA prebieha za pomoci matricového vlákna a DNApolymerázy. DNA-polyme-rázy potrebujú pre svoju činnosť RNA primery, ktoré im poskytujú 3x koniec ribonukleotidov pre začiatok syntézy. Smer syntézy je od 5x konca ku 3x koncu. Vlákna DNA sú však uložené proti bežne, čo spôsobuje, že iba jedno vlákno je replikované ako jeden celok. Druhé, tzv. oneskorujúce sa vlákno sa syntetizuje za pomoci Okazakiho fragmentov. Na konci syntézy dôjde k odstráneniu RNA primerov. Medzery, ktoré takto vzniknú sú doreplikované. To však neplatí pre 5' konce novo syntetizovaných reťazcov. Takto pri každej replikácii DNA dochádza ku skráteniu dĺžky telomér a vytvoreniu 3'presahu. Hore popísaný proces sa označuje ako replikatívne skracovanie telomér (1972 James Watson a nezávisle na ňom Alexej Olovnikov). Mechanizmus postupného skracovania telomér vysvetľuje jav obmedzeného delenia ľudských somatických buniek tzv. Hayflickov limit (Hayflick and Moorhead, 1961). Vplyvom replikatívneho skracovania telomér sa po určitom počte delení teloméry skrátia až na kritickú 6 Zdenem3'-Xůncůvý öeoxyriDonuKieotitf 5' Zde není 3'-kůncový daoxYriboriLJkforid Ä ľ V , V 51 YDNA-ligáza nedorepl i kovaný konsc '5' 3' n edorep litovaný Konec. S1 - hranicu, čo spôsobí, že bunka prejde do fázy senescencie (starnutia). Behom senescencie dôjde k zmene expresií proteínov, zastaví sa delenie a zníži sa aktivita metabolizmu. 1.1.3. Telomeráza ' / t ! lilii v DNA * M , T , C O Bunky vyriešili problém replikatívneho skracovania koncov chromozómov enzýmom telomerázou. Tento enzým, ktorý bol prvý krát popísaný v roku 1985 Carol Greiderovou a Elizabeth Blackburnovou u nálevníka Tetrahymena thermophila, využíva reverznú transkripciu k predlžovaniu telomér. Telomeráza Pôvodný názov znel reverzná »** traskriptáza. Ako je ukázané na obr. 2, telomeráza pozostáva z dvoch podjednotiek. Prvou podjednotkou je RNA podjednotka (TR, Telomerase RNA), ktorá slúži ako templát pri syntéze repeticií. Druhou funkčnou _ T . j í v * podjednotkou telomerázy je proteínová Obr.2: Telomeráza pri predlžovaní ^ 3 3 3 ľ koncov chromozómov katalytická podjednotka (TERT, Telomerase (http://stemcells.nih.gov, 7.2.2010) _ . , Reverse Transcnptase), ktorá zodpovedá za syntézu telomér. Mechanizmus replikácie koncov chromozómov spočíva v postupnom predlžovaní 3'konca matricového vlákna DNA reverznou transkripciou telomerickej repetície, ktorá je katalyzovaná TERT a kde ako matrica slúži TR. Po skončení syntézy jednej repetície sa telomeráza posunie a hybridizuje s novo vytvoreným vláknom a začína dálší cyklus syntézy. Presný mechanizmus predlžovania komplementárneho 5'konca zatiaľ popísaný nebol. Predpokladá sa, že 3'koniec materského vlákna sa ohne späť alebo sa na 5'konci do syntetizovaného vlákna vytvorí primer. Každopádne pri oboch verziách vzniká 3'hydroxylový koniec, od ktorého môže prebiehať syntéza. Interakcia DNA a telomerázy závisí od bunkového cyklu. Pre ľudské bunky platí, že sa telomeráza viaže na DNA počas S fázy bunkového cyklu, čiže počas replikácie DNA (Jady et al. 2006; Ten Hagen et al., 1990; Tomlinson et al., 2006). Mimo S fázu je telomeráza uchovávaná v oddelených jadrových štruktúrach mimo 7 telomerickú DNA. Ďalší spôsob regulácie telomerázy je prístupnosť 3'presahu a jeho tvarovaním do štruktúr, ktoré sú vytvárané interakciou s telomérovými proteínmi. 1.2. Proteínová zložka telomér Proteiny sa viažu na DNA a vytvárajú chromatin. Teloméry sa od zvyšku chromozómu líšia aj tým, že obsahujú pre nich špecifické proteiny, ktoré majú vplyv nielen na vznik špecifických štruktúr, ale sa podieľajú aj na regulácii dĺžky telomerickej DNA. Tieto proteiny je možné rozdeliť do niekoľkých skupín podľa ich interakčných partnerov na proteiny s väzbou na ssDNA, proteiny s väzbou na dsDNA a proteiny sprostredkujúce väzbu proteín-proteín. 1.2.1. Interakcie proteínov s dsDNA Jedná sa o pomerne veľkú skupinu proteínov označovaných aj ako Myb-like proteiny. Ich názov je odvodený od myb-like domény, ktorá je zodpovedná práve za interakciu s d s DNA (Bilaud et al,. 1996). Myb-like doména dostala svoj názov podľa onkogénnu v-Myb, ktorý bol známy už v roku 1982 vo víruse vtáčej myeloblastózy (Klempnauer et al., 1982). Vo viacerých transkripčných faktoroch má myb-like doména tri tandemové repetície označované ako R1, R2 a R3. To však neplatí pre myb-like domény proteínov, ktoré sa viažu na teloméry, pretože tu sa väčšinou vyskytuje iba jedna z repetícií. Podľa umiestnenia Myb-like domény môžeme rozlišovať proteiny s Myb-like doménou na C alebo N-konci. U človeka sa vyskytujú najmä DNA väzbové telomerické proteiny s Myb-like doménou na C-konci. Tieto proteiny sa podieľajú na tvorbe komplexu, ktorý sa označuje ako shelterin, prípadne shelterinový komplex (de Lange, 2005). 1.2.2. Shelterinový komplex Shelterinový komplex pozostáva zo šiestich proteínov, ktoré plnia rozdielne úlohy. To, čo majú spoločné je vplyv na reguláciu dĺžky telomér. Tento komplex je schopný represovať hlavné dráhy, ktoré sú potenciálne nebezpečné pre teloméry, 8 pretože bez prítomnosti Shelterinového komplexu by boli teloméry rozpoznané ako chromozómové zlomy, čo by malo za následok zastavenie bunkového cyklu a spustenie reparačných mechanizmov. 1.2.2.1. Proteiny shelterinu pre priamu väzbu na DNA 1.2.2.1.1. TRF proteiny Na tvorbe ľudského shelterinového komplexu sa podieľajú proteiny TRF1 (TTAGGG Repeat binding Factor 1, Telomeric Repeat binding Factor 1) a TRF2 (TTAGGG Repeat binding Factor 2, Telomeric Repeat binding Factor 2) (Bilaud et al., 1997; Broccoli, et al., 1997; Chong et al., 1995), ktoré sa viažu priamo na dsDNA. Štruktúra oboch proteínov je tvorená Myb-like doménou na C-konci, ktorá má zloženie typu „helix-turn-helix" a s TRFH homológnou doménou v centrálnej oblasti. TRFH slúži TRF proteínom pri tvorbe homodimérov a interakciách s ďalšími proteínmi telomér. Práve TRFH bráni proteínom TRF1a TRF2, aby vzájomne vytvárali heterodiméry. Myb-like doména monomérov TRF umožňuje väzbu na dsDNA. Jej prítomnosť postačuje však len na väzbu in vitro. Pri in vivo sú podmienky pre väzbu nedostačujúce a k interakcii TRF proteínov s dsDNA predchádza vytvorenie homodimérov, čo sprostredkúva práve doména TRFH (Fairall et al., 2001). To majú oba TRF proteiny spoločné, líšia sa však na N-koncoch. Koniec TRF1 je bohatý na kyslé proteínové zvyšky, zatiaľ čo TRF2 protein má N-koniec zásaditý. Z in vitro experimentov bolo zistené nasledovné: TRF1 a jeho nadmerná tvorba má za následok skrátenie telomér. Pri vystavení účinkom dominantne negatívnej varianty naopak dochádza k ich predĺženiu. Z čoho vyplýva, že TRF1 ovplyvňuje dĺžku telomér negatívne (Smogorzewska et al., 2000; van Steensel and de Lange, 1997). Vymazanie génu pre TRF2 u ľudských buniek vedie k značnému skráteniu telomér. Jeho nedostatok má za následok stratu 3'presahu, čo vedie k následnej fúzií chromozómov a niekedy aj k apoptóze a vytvorenie mutantnej formy spôsobuje in vivo zastavenie rastu a senescenciu. Čiže hlavná funkcia TRF2 je regulácia dĺžky telomér a ochrana koncov chromozómov (Karlseder et al., 1999; van Steensel et al., 1998). 9 1.2.2.1.2. POT protein Na vytvoření shelterinového komplexu priamou väzbou na jednoreťazový DNA presah sa zúčastňuje taktiež protein POT1 (Protection Of Telomeres 1). Zo svojimi 634 aminokyselinami a veľkosťou 71,4kDa je POT1 najväčší protein shelterinového komplexu. Protein POT1 bol identifikovaný na základe sekvenčnej podobnosti s TEBPa/p telomerickým komplexom Oxytricha nova (Baumann, Cach, 2001). Gén pre protein POT1 podlieha alternatívnemu zostrihu, preto vzniká päť jeho variantov, ktoré sa označujú V1-V5. Ich výskyt je bežný takmer vo všetkých tkanivách, výnimku tvorí len variant V5, ktorý je špecifický výskytom iba v bielych krvinkách. Rozdiely jednotlivých variantov v ich intenzite väzby na G-vlákno (Baumann etal., 2002) naznačujú, že zastupujú rôzne funkcie v bunke. O doménach POT1 a ich funkciách bude táto práca pojednávať v stati o ochrane 3x presahu. 1.2.2.2. Protein sprostredkujúci komplexáciu shelterinu proteín-proteín interakciami Shelterinový komplex netvoria len proteiny, ktoré sa podieľajú na väzbe s DNA. Podstatnú časť tvoria aj proteiny, ktoré shelterinový komplex spájajú svojimi proteín-proteín interakciami. Do tejto množiny spadajú proteiny: TPP1 (Three Prime Phosphatase-1, TriPeptidyl Peptidase 1), hRapI (human Repressor activator protein 1), TIN2 (TRF1-Interacting Nuclear Protein 2) a (de Lange, 2005). TPP1 spája TIN2 a P O T 1 , vdáka doménam na C-konci. N-koniec proteinu TPP1 obsahuje OB-fold doménu, ktorá umožňuje interakciu s telomerázou, pravdepodobne je TPP1 zahrnuté pri rekrutovaní alebo regulácii telomerázy (Xin et al., 2007 a Ye et al., 2004). Protein TPP1 vytvára s POT1 heterodiméry a až tieto heterodiméry sa viažu na ssDNA, pretože osamotený POT1 má nižšiu afinitu k DNA. Interakcia TPP1 s POT1 proteínom je umožnená doménou RD (POT1-Recruitment Domain), ktorá sa nachádza v centre proteinu TPP1 (Xin et al., 2007). Podobnosť sekvencií TPP1 a TEBP a-(3 viedla k predpokladu, že interakcia TPP1-POT1 je obdoba heterodiméru TEBP a-(3. Protein TPP1 interaguje aj sTIN2 proteínom cez TID doménu (TIN2-lnteracting Domain), ktorá sa nachádza na N-konci. Ďalšia 10 funkcia TPP1 spoločne s TIN2 je zaistenie vytvorenia komplexu TRF1-TIN2-TRF2h R a p l Vytvorenie tohto komplexu zvyšuje afinitu oboch proteínov TRF k DNA telomér (O'Connor et al., 2006). Bolo dokázané, že strata TTP1 pri myši vedie k rovnakým fenotypovým prejavom ako vyradenie POT1 (Palm et al, 2010). Čo sa týka účinku na dĺžku telomér, ukazuje sa, že komplex TPP1 s POT1 ovplyvňuje dĺžku telomér v závislosti na mieste väzby (Wang etal., 2007). Ďalší z tejto skupiny proteínov je TIN2. S veľkosťou 50kDa a 451 aminokyselinami nijako nevyniká spomedzi ostatných shelterinových proteínov. Ale ako vidíme na obrázku č.3, TIN2 má ústrednú polohu v komplexe a spája časť komplexu, ktorá interaguje s ssDNA, zastúpenú heteroduplexom POT1/TPP1 a časť komplexu zodpovednú za interakcie s dsDNA, ktorú predstavujú TRF proteiny. Tieto interakcie sú sprostredkované doménami na N-konci TIN2, kde sú tam centrá pre interakciu s TPP1 a TRF2. C-koniec zodpovedá za interakciu s TRF1 (Houghtaling et al., 2004; Liu et al., 2004; Ye et al., 2004a). Pokusy in vivo ukázali, že TIN2 sa súčasne viaže na TRF1 aj TRF2 a chráni TRF1 pred modifikačným pôsobením tankyráz (Ye et al., 2004b). Nadmerná tvorba TIN2 proteinu vedie in vitro k skracovaniu telomér a pri tvorbe modifikovaného proteinu TIN2 bez N-konca sa naopak teloméry predlžujú. Poslednou menovanou zložkou shelterinového komplexu je hRapl. Protein hRapI identifikovali v roku 2000 Li et al. na základe jeho špecifickej interakcie s TRF2. Veľkosť hRapl je 47kDa, má 399 aminokyselín a obsahuje 4 domény. Prvá doména BRCT (BRCA1 C-Terminal) sa nachádza na N-konci a jej úlohou je interakcia s inými proteínmi. V centrálnej časti proteínovej sekvencie sa nachádza Myb-like doména a na C-konci nesie hRapl domény coiled-coil a konzervatívnu RCT (Rap1 C-Terminus). Myb-like doména hRapl sa od ostatných líši, má iba jednu repetíciu a neviaže sa na DNA telomér. Doména RTC slúži na interakciu hRapl s TRF2. Zvyšné dve domény coiled-coil a BRCT pravdepodobne interagujú s opravnými proteínmi DNA (O'Connor et al., 2004). Protein hRapl je negatívny regulátor dĺžky telomér (obr.3). 11 T1N2 FxLxP TRFl/2 Myb domains bound to telomeric DNA b ™ 2 s- CTAACCCTAACCCTAACCCTAACCC Obr. 3: Protein TIN2 spojuje TRF1 s TRF2. POT1 sa viaže na 3'presah a s T P P 1 , ten sa zase viaže na TIN2 a tým spojuje POT1 s dsDNA. Nakoniec TRF2 sa ešte viaže na proteiny POT1 a hRapI (Wilhelm Palm and de Lange, 2008). 1.2.2.3. Modulácia tvaru telomér shelterinom Minimálna dĺžka telomér, ktorú je shelterinový komplex schopný rozpoznať je päť repetícií (de Lange, 2005). Práve po dve repetície rozpoznávajú homodiméry TRF1 a TRF2 a jednu protein POT1. Tento proteínový komplex vytvára špecifickú štruktúru t-slučku (telomerická slučka), obr 4. Prvý krát bola pozorovaná elektrónovým mikroskopom pri sledovaní reštrikčných fragmentov myších a ľudských buniek (Griffith et al., 1999). Štruktúra t-slučky vznikla po ohnutí telomerickej ds DNA do kruhu. Okrem t-slučky poznáme aj d-slučku (displacement-loop), ktorá vznikla zanořením 3'presahu do ds DNA telomér. Týmto zanořením sa znemožní prístup telomerázy a tým pádom sa Obr. 4: http://delangelab.rockefeller.edu/r esearch.html 11.5. 2008 12 zamedzí predĺženiu telomér. T-slučka zase obdobne bráni teloméry pred reparačnými mechanizmami bunky, ktoré by koniec chromozómu rozpoznali ako zlom. (Obr. 5). TERC DKC1 T1N2 Obr. 5: Štruktúra t-slučky a d-slučky umožnená proteínami shelterinového komplexu (http://www.genomeknowledge.org/figures/t-loop_all.jpg 11.5. 2008) Samotná telomeráza alebo jej aktivita teda nie je priamo ovplyvňovaná TRF proteínmi ale tým, že sa práve TRF proteiny zúčastňujú pri vytváraní štruktúry tslučky (Griffith et al., 1999; Smogorzewska et al., 2000). Na vytvorenie t-slučky stačí v prostredí in vitro iba TRF2, lenže in vivo je výhradná prítomnosť TRF2 nedostačujúca a na správne zloženie t-slučky sa vyžaduje aj účasť TRF1, ktorý indukuje ohýbanie telomerickej ds DNA (Bianchi et al., 1997). TRF2 in vivo slúži na stabilizáciu d-slučky, pretože je naviazaný v mieste, kde sa 3'presah zanára do DNA. Množstvo shelterinu je priamo úmerné dĺžke telomér, pretože čím sú teloméry kratšie, tým menej komplexu sa môže naviazať. Pri skrátení telomér pod určitú medzu už nie je možné vytvoriť štruktúru slučky a to umožní prístup telomerázy a následné predĺženie telomér. Takto sa dá vysvetliť jav, pri ktorom sú prednostne predlžované kratšie teloméry (Liu et al., 2002; Marcand et al., 1999; Ouellette et al., 2000; Shakirov and Shippen, 2004). 13 Ďalšie proteiny, ktoré majú vplyv na dĺžku telomér sú tankyrázy, konkrétne Tankyráza 1 a Tankyráza 2 (TRF1-interacting ANKyrin-Related ADP-ribose polymerase 1 and 2) (Kaminker et al., 2001; Smith et al., 1998). Tieto proteiny regulujú väzbu TRF1 s DNA telomér, oba majú ankyrinovú doménu, ktorá umožňuje interakciu s N-koncom TRF1 a katalytickou doménou PARP, ktorá je zodpovedná za chemickú modifikáciu tankyráz aj TRF1. Biochemicky sa jedná o reakciu ADP-ribóz, čiže polyADP-ribosylácia. Po pôsobení tankyrázy na TRF1 a jeho modifikácii, stráca protein TRF1 možnosť väzby na telomerickú DNA či už in vivo alebo in vitro (Cook et al., 2002; Smith and de Lange, 2000). Pred účinkami tankyrázy 1 je TRF1 chránený prostredníctvom TIN2 proteinu (Ye et al., 2004b). Tankyráza 1 spôsobuje v nadbytku predĺženie telomér, pretože má za následok modifikáciu TRF1, ktorý sa nemôže zakomponovať do shelterinového komplexu, čo odkrýva konce telomér a sprístupňuje ich telomerázy. Tankyráza 2 spôsobuje v nadmernom množstve neprogramovanú smrť: nekrózu, čo je najskôr následok vyčerpania ATP v bunke. 1.2.3. Interakcie shelterinu s ssDNA Hicke et al. v roku 1990 našli u nálevníka Oxytricha nova protein TEBP a-6 (Telomere Binding Protein). Na základe sekvenčnej podobnosti s týmto proteínom bola možná identifikácia väčšiny proteínov, ktoré sa viažu na ssDNA. 1.2.3.1. 3 presah a jeho ochrana Ochranu 3'presahu sprostredkúva protein POT1 (Protection Of Telomeres 1), ktorý sa špecificky viaže na G-vlákno (Baumann and Cech, 2001). Všetky alternatívne zostrihy proteinu POT1 obsahujú OB fold doménu (Oligonucleotide/Oligosaccharide-Binding fold), ktorý sa nachádza na N-konci proteinu. Práve OB fold má schopnosť väzby na G-vlákno (Lei et al., 2004). Interakcia ale nie je podmienená doménou OB fold, pretože i skrátený POT1 bez OB fold domény je schopný sa viazať na teloméry, aj keď sa asi jedná o interakciu s ostatnými jednotkami shelterinového komplexu teda interakciu charakteru proteínproteín (Loayza and de Lange, 2003). Taktiež je možné, že POT1 má doménu OB fold aj na C-konci, ktorá zodpovedá za interakciu POT1 a TPP1 (Xin et al., 2007). POT1 potrebuje na efektívne naviazanie sa na ssDNA minimálnu sekvenciu o dĺžke 14 desať nukleotidov TTAGGGTTAG. Doména OB fold z N-konca proteínov spotrebuje pre väzby prvých šesť nukleotidov, čiže TTAGGG a doména z C-konca zvyšné štyri: TTAG. Interakcie POT1 sa neobmedzujú len na priamu interakciu s ssDNA , ale POT1 sa podieľa aj na stavbe shelterinového komplexu. Ako je vidno na obrázku č. 3, POT1 sa viaže s TRF proteínmi cez most vytvorený s TTP1 aTIN2 a tým aj s dsDNA (Loayza and de Lange, 2003; Yang et al., 2005). Takto sa zaisťuje prenos informácie o dĺžke telomerickej dsDNA k3'presahu, čiže väzba POT1 ovplyvňuje interakciu telomerázy s jednoreťazovým presahom. Takže pokiaľ Tankyráza pozmění TRF1 zníži sa množstvo naviazaného POT1 na 3'presah, práve preto, lebo TRF1 sa nenaviaže na DNA telomér a preto nedôjde ani k interakciám proteín-proteín, ktoré indikujú väzbu POT1 na koniec teloméry. Presný mechanizmus, ktorým POT1 reguluje dĺžku telomér nie je známy a výsledky experimentov sa líšia. Podľa Kelleher et al., (2005) a Lei et al., (2004) POT1 negatívne ovplyvňuje dĺžku telomér, pretože sa viaže in vitro k 3x presahu a bráni prístupu telomerázy. Túto hypotézu potvrdzujú štúdie zaoberajúce sa bunkami s neúplnými POT1, ktoré nemajú OB fold domény a dochádzalo v nich k predlžovaniu telomér (Loayza and de Lange, 2003). V rozpore s hypotézou sú výskumy poukazujúce na to, že POT1 pozitívne vplýva na dĺžku telomér ako napr. jeho nadmerná tvorba v nádorových bunkách človeka, ktorá výrazne predlžuje teloméry (Colgin et al., 2003) a jeho nízka tvorba má in vitro rovnaké následky ako nedostatok TRF2, t.j. strata 3'presahu, fúzia chromozómov a niekedy apoptóza, z čoho sa dá usúdiť, že POT1 má tú istú funkciu ako TRF2 a to ochrana koncov chromozómov pred reparačnými mechanizmami bunky (Yang et al., 2005). Tieto protichodné mechanizmy objasnil Lei et al. (2005), keď pozoroval in vitro, že POT1 reguluje dĺžku telomér podľa miesta, kde sa viaže (Obr. 6). 15 hP0T1 c-koncová i — > doména telomei áza VTAGGGTTAGGG neaktivní stav t tenH P 8 nt ' aktivní stav vyšší aktivita telomér ázy telomeráza Obr. 6: Protein POT1 a regulácia aktivity telomerázy v závislosti od umiestnenia proteinu na DNA (Lei etal., 2005). Prišiel na to, že pokiaľ je POT1 na konci 3'presahu, tak na predlžovanie telomér vplýva negatívne, ale pokiaľ za POT1 ostalo aspoň osem voľných nukleotidov, tak 3'presah je prístupný pre telomerázu, ktorá má takto vyššiu procesivitu a aktivitu než za neprítomnosti POT1. Potvrdenie tohto procesu in vivo sa zatiaľ nepodarilo. POT1 sa uplatňuje aj na stavbe shelterinového komplexu in vivo na stavbe tslučky (Griffith et al., 1999). Obe tieto štruktúry sú na telomérach prítomné buď spoločne, alebo je možné, že predstavujú rôzne fázy dynamiky telomér (Lei et al., 2005). Ďalšou vlastnosťou POT1 je schopnosť narušiť G-kvadruplexy in vitro (Zaug et al., 2005). G-kvadruplex je usporiadanie DNA, ktoré vzniká, keď oligonukleotidy G-vlákna majú aspoň štyri repetície TTAGGG a zbalia sa do tejto štruktúry. Telomeráza dosť slabo rozpoznáva G-kvadruplexy pre ich štruktúru, kde guaníny sú v rovine a spojené vodíkovými mostíkmi Hoogsteenovým párovaním (Sundquist and Klug, 1989; Wang and Patel, 1993; Williamson et al., 1989) (Obr.7). Protein POT1 je schopný narušiť G-kvadruplex, čím umožní obr 7: G-kvadraplex http://phobos.ramapo.ed lepší prístup k telomerám. u/~pbagga/GQ_structure jpgll.5. 2008 16 1.2.4. Interakcie proteínov shelterinu s ďalšími proteínmi Táto skupina by sa mohla ešte rozdeliť na 2 podskupiny a to: proteiny s interakciou na telomerické proteiny väzbou proteín-proteín a proteiny zodpovedné za opravné procesy DNA a prenos signálu k senescencii alebo apoptóze. Proteiny zodpovedné za opravné procesy tvoria značne obsiahlu podskupinu a táto práca sa nimi nebude zaoberať. Proteiny prvej podskupiny, sa zúčastňujú na stavbe shelterinového komplexu (str. 8-14). Patria sem proteiny: TIN2 (TRF1-lnteracting Nuclear Protein 2), TPP1 ( Three Prime Phosphatase-1, TriPeptidyl Peptidasel) a hRapI (human Repressor activator protein 1). Prvý z uvedených proteínov TIN2 má veľkosť 50kDa, na jeho stavbe sa podieľa 451 aminokyselín a bol objavený vďaka špecifickej interakcii s TRF1 (Kim et al., 1999), ku ktorej slúži C-koniec TIN2, zatial čo jeho N-koniec obsahuje domény slúžiace k interakcii s TRF2 a TTP1 (Houghtaling et al., 2004; Liu et al., 2004; Ye et al., 2004a). Nadmerná tvorba TIN2 proteinu vedie in vitro k skracovaniu telomér a pri tvorbe modifikovaného proteinu TIN2 bez N-konca sa naopak teloméry predlžujú. 1.3. Anizotropia fluorescencie: teoretický základ Dnes hojne používaná metóda anizotropie fluorescencie bola prvý krát použitá v roku 1990 k štúdiu interakcií medzi proteínom, ktorý sa viazal s cAMP a lac promótorom (Heyduk and Lee, 1990). Anizotropia fluorescencie je nástroj pre analýzu a kvantifikáciu interakcii, či už pre medziproteínové väzby alebo aj interakcie DNA a proteínov a to priamo v roztoku. Medzi ďalšie výhody patrí možnosť ustanovenia rovnováhy zložiek podieľajúcich sa na reakcii bez nutnosti separovať voľné a naviazané molekuly, k tomu je možné merať zmeny v anizotropii v reálnom čase a bez vplyvu detekčnej techniky na rovnováhu väzby. Fluorescenčná anizotropia je založená na spektroskopickom princípe, ktorý umožňuje sledovať interakcie medzi molekulami, z ktorých je jedna fluorescenčné naznačená. Každá fluorescenčné naznačená molekula má excitačný a emisný dipólový moment (Obr. 8). 17 Absorpce Emise Obr. 8: Dipólové momenty molekuly fluoroforu (Hofr, 2010) Tieto momenty udávajú mieru a smer, v ktorom je svetlo najviac absorbované respektíve emitované. Kexcitácii sa používa lineárne polarizované svetlo, ktoré aktivuje molekulu fluoroforu. Lineárne polarizované svetlo je definované ako svetlo, ktorého elektrická aj magnetická zložka kmitajú stále v jednej rovine. Pri lineárnom polarizovanom svetle sa rovina, v ktorej ležia kmity vektoru nazýva kmitová a rovina na ňu kolmá, (tj. rovina, v ktorej kmitá vektor) sa nazýva polarizačná (Obr. 9) Z toho vyplýva, že lineárne polarizované svetlo bude excitovat' iba molekuly, ktoré majú nenulový priemet absorpčného dipólového momentu prechodu do polarizačnej roviny. Čo má za následok excitáciu iba určitej časti populácie Obr. 9: Kmitová a polarizačná fluorescenčné naznačených rovina(http://fyzika.jreichl.com/) molekúl. Medzi excitáciou a emisiou fluoroforu existuje krátky časový úsek, ktorý je pre väčšinu fluorofórov 1- 25ns. Tento časový úsek sa označuje ako doba dohasínania flourofóru a pre merania anizotropie fluorescencie je veľmi dôležitá. Pokiaľ by bola doba dohasínania veľmi krátka, nedošlo by k zmene orientácie molekúl v roztoku a nebolo by možné pozorovať anizotropiu fluorescencie. Nedochádzalo by ani ku zmene roviny polarizácie emitovaného svetla. Lenže molekuly sa v roztoku pohybujú a za dobu dohasínania, ktorá je rádovo porovnateľná s dobou rotácie molekúl, zmenia svoju polohu a orientáciu. To spôsobí, že svetlo je emitované v rôznych rovinách a je len menej polarizované. Zmena miery polarizácie sa popisuje veličinou anizotropie. 18 Anizotropia znamená nerovnorodosť. Obecne platí, že čim je nižšia depolarizácia emitovaného svetla, tým je väčšia anizotropia, čo platí aj opačne. Tento princip (Obr. 10) sa používa pri štúdiu a popisovaní interakcií biomakromolekúl. Obr. 10: Princíp anizotropie fluorescencie (Hofr, materiály predmetu Pokročilé biofyzikálne metody v experimentálnej biologii) Malé molekuly (napr. tu zobrazená fluorescenčně značená DNA, ale môže sa jednať aj o fluorescenčné značený protein) sa v roztoku pohybujú rýchlejšie a preto za dobu dohasínania viacej pozmenia svoju polohu a nimi emitované svetlo je viacej depolarizované, čo má za následok namerané nízke hodnoty anizotropie. Naopak väčšie molekuly či dokonca komplexy molekúl (tu zobrazený komplex DNA-proteín) sa za dobu dohasínania pohnú výrazne menej, takže emisia nebude až tak depolarizovaná ako v predchádzajúcom prípade. Tomu budú zodpovedať aj namerané vyššie hodnoty anizotropie. Pri vznikaní komplexu teda vzrastie podiel molekúl, ktoré sa nachádzajú vo väzbe práve v tomto komplexe, čím sa bude znižovať ich pohyblivosť, miera depolarizácie bude klesať a teda namerané hodnoty anizotropie budú stúpať. Takéto meranie závislosti anizotropie na zvyšujúcej sa koncentrácii komplexu umožňuje priame sledovanie väzby, či už proteín-DNA ako je uvedené na Obr. 13 ale aj proteín-proteín. Týmto postupom je možné získať väzbové krivky, z ktorých sa po preložení dá vypočítať disociačná konštanta Kd. Disociačná konštanta je definovaná ako koncentrácia proteinu, pri ktorej je obsadená práve polovica miest pre väzbu na fluorescenčné značenej makromolekule. Z disociačnej Excitace Emise nízká anizotropie i 19 konštanty je možné dopočítať recipročnú hodnotu, ktorá predstavuje asociačnú konštantu (Ka ). 20 Ciele diplomovej práce 1. Optimalizácia expresie a purifikácia proteinu TIN2. 2. Určenie stechiometrie interakcie TIN2 a TRF2 metódou retardačnej analýzy. 3. Zistenie väzbovej afinity TIN2 a TRF2 s využitím anizotropie fluorescencie 21 3. Materiál a metódy 3.1. Klonovanie TIN2 Sekvencia cDNA proteinu TIN2 bola objednaná od Geneservice (UK). Gén TIN2 vo forme cDNA bol klonovaný technológiou Gateway® s použitím Klonazy™ II do vektoru pHGGWA, ktorý bol následne transformovaný do buniek Escherichia coli BL21(DE3) CodonPlus RIPL Protein nesie na svojom N-konci pridané sekvencie aminokyselín tzv. „tagy", konkrétne GST-tag a na ňom His-tag. (Obr. 11) His-tag GST-tag TRF1 N-koniec C-koniec Obr. 11: Fúzny protein TIN2 umiestnenie domén a "tagov" Gateway® technológia je založená na špecifických rekombinačných miestach odvedených s bakteriofágu lambda. Výhodami tohto systému je jednoduchosť a univerzálnosť, keď v dvoch krokoch vzniká expresný vektor. (Obr. 12) aSB attí, attP alP aTÍL aCL alt R attfí Obr. 12: Gateway® Technology with Clonase™ II, 2004 Bunky línie BL21(DE3) CodonPlus® RIPL boli zvolené kvôli jednoduchej indukcii vďaka kazete DE3 a obsahu plazmidov pre málo sa vyskytujúce triplety tRNA E.coli. 22 3.2. Expresia TIN2 Kultúra buniek BL21(DE3) CodonPlus RIPL, ktorá obsahuje vektor so sekvenciou TIN2 bola inkubovaná v Luria-Bertrani (LB) médiu s obsahom ampicilínu o výslednej koncentrácii 100ug/ml a chloramfeniklu o koncentrácii 50ug/ml. Kultúra bola inkubovaná na teplotu 37 °C pri 200 rpm cez noc (O/N). Ďalší deň bolo 5mI cez noc inkubovanej kultúry pridaných do 11 LB média s prídavkom ampicilínu s koncentráciou 100ug/ml v erlenmayerovej banke s objemom 51. Takto zaočkovaná kultúra sa nechala trepať na 180-200rpm pri teplote 37 °C, kým nevzrástlo OD600 na hodnotu ~ 1. Po dosiahnutí požadovanej optickej hustoty média sa ku kultúre pridáva IPTG (isopropyl 3-D-1-thiogalactopyranosid) s konečnou koncentráciou 0,5 mM a zároveň sa banky s kultúrou ochladia pod tečúcou vodou. Po indukcii IPTG prebiehala inkubácia cez noc (cca 16 hod) pri teplote 15 °C a 180-200rpm. Druhý deň sa previedol zber buniek centrifugáciou kultúry pri 8000g na dobu 8 minút pri teplote 4 °C. Pelet bol zamrazený a uložený v mraziacom boxe pri teplote -70°C. 3.3. Purifikácia TIN2 Pelet z jedného litra média bol rozsuspendovaný v 45 ml fosfátového pufri (50 m M, pH 8.0) obsahujúceho 300mM NaCI a10mM imidazolu. Pred rozsuspendovaním boli do pufra pridané inhibitory proteáz Leupeptin (75 uL) a Pepstatin A (125 uL). Pelet bol sonikovaný na sonikátore UP200S (Ultrasound Technology, Hielscher) s amplitúdou 80% a cyklom 0.8 a to po dobu 4krát 5minút s minútovými prestávkami medzi sonikačnými cyklami. Nasledujúcim krokom bola centrifugácia pri 20 OOOg po dobu 1 hodiny pri teplote 4 °C. Po centrifugácií bol supernatant přefiltrovaný cez filtre spormi o veľkosti 0,45um (STERIVEX™, Millipore). Ďalší krokom bola metaloafinitná chromatografia, pri ktorej sa ako sorbent používal TALON™ (BD Biosciences). Mechanizmus prečistenia spočíva vo využití vysokej afinity histidinu k sorbentu a k naviazaniu proteinu cez His-tag na kolónu pri nízkej koncentrácii imidazolu a následné uvoľnenie proteinu po zvýšení koncentrácie imidazolu. Kvôli odstráneniu kopurifikovaných proteínov zo skupiny chaperónov bol ku klasickému postupu podľa výrobcu pridaný medzi krok. K zvýšeniu čistoty proteinu bol sorbent inkubovaný s pufrom obsahujúcim 20mM HEPES (pH 7.0), 23 150mM KCI, 10mM MgCl2, 5mM ATP po dobu 2 hodin při 4 °C. Počas inkubácie dochádza k disociácii chaperónov a TIN2. Elúcia proteinu prebieha po pridaní pufra so zvýšenou koncentráciou imidazolu (300 mM imidazol, 300mM NaCI v 50mM fosfát sodný, pH 8.0). Koncentrácia výťažku bola určovaná Bradfordovej metódou (Bradford, 1976) a čistota bola overená elektroforézou v 10% SDS-polakrylamidovom gélu, ktorý bol následne vyhodnotený denzitometricky v programe Multigauge (Fujifilm). Zistený podiel proteinu TIN2 bol použitý ako faktor koncentrácie pri výpočte disociačnej konštanty. 3.4. EMSA (Elektrophoretic mobility shift assay) EMSA alebo inak nazývaná aj retardačná analýza sa využíva pri určovaní stechiometrie interakcií, či už proteín-DNA, DNA-DNA alebo proteín-proteín. V podstate sa využíva zmena pohyblivosti (mobility shift) v gélu u vzniknutých komplexov oproti pohyblivosti samostatných voľných podjednotiek (Obr. 13). Obr. 13: Princíp E M S A (Hofr, materiály predmetu Pokročilé biofyzikálne metódy v experimentálnej biolóaii) Bola pripravená reakcia, ktorá obsahovala rovnaké množstvo komplexu DNA s TRF2-YFP, kde použitá DNA tvorila dve opakovania ľudského telomerického motívu, čiže 5'-gTTAgggTTAgggTTAg-3' a je naznačená fluorescenčnou značkou Rhodamine X. TRF2-YFP bol fluorescenčné značený taktiež, kedže sme pre naše 24 interakčné štúdie použili fúzny protein proteínuTRF2 a žltého fluorescenčného proteinu (Yellow Flourescence Protein). Vo všetkých čiastkových reakciách bolo inkubované rovnaké množstvo DNA (5 pmol) a TRF2-YFP (15pmol) a vzrastajúce množstvo TIN2 (5, 7,5, 15, 30, 45, 60, 75 pmol) tak, aby výsledné pomery TRF2-YFP a TIN2 boli 3:1, 2:1,1:1,1:2, 1:3, 1:4, 1:5. Každá vzorka bola doplnená Hepes pufrom (Hepes 20mM, 50mM KCI, 1mM MgCl2, 0,1% Tween, 5% glycerol pH=8) na celkový objem 30,25 ul. Pred nanesením na gél bolo do každej vzorky pridané 1/5 objemu 6x Loading dye Orange G a Coomassie Briliant blue R-250 na 0.02% celkového objemu (Braz, 2009). Takto pripravené reakčné zmesi boli nanesené na 4% natívny polyakrilamidový gél, ktorý bol prevrstvený n-butanolom kvôli zneprístupneniu vzduchu a zaručenie lepšej polymerizácii (Buczek and Horvath, 2006). Samotná elektroforéza prebiehala v 0,25 TBE pufri pri parametroch 40V po dobu 30 minút a potom 80V na 90 minút pri rozmeroch gélu 10x15 cm. Analýza gélu bola vypracovaná na fluorescenčnom scaneri FLA 7000 (Fujifilm). Pre detekciu polohy DNA fluorescenčné označené Rhodaminom bolo použité nastavenie: laser 532, filter 580 . Pre detekciu proteinu TIN2 fluorescenčné označeného Y F P bolo použité nastavenie: laser 473, filter 520. 3.5. Anizotropia fluorescencie Anizotropia fluorescencie bola nameraná v L usporiadaní na spektrofluorimetri FluoroMax-4 (Horiba), vybaveného automatickými polarizátormi s užívateľským prostredím Origin Fluorescence (patch 2.1.6.). Pri meraní boli použité vlnové dĺžky 513nm pre excitáciu a 525nm pre emisiu, obe z nastavením šírky štrbín na 5nm a s integračným časom 3s. Na merania bola použitá křemenná kyveta o rozmeroch základne 14x14mm s optickou dráhou 10mm. Merania boli uskutočnené v fosfátovom pufri (50 mM sódny fosfát a 300 mM NaCI) pri teplote 25 °C. Do 1400 ul pufra bol pridaný zakoncentrovaný protein TRF2-YFP na výslednú koncentráciu 100nM (prídavok bol 15ul). Do kyvety bol postupne titrovaný protein TIN2 s koncentráciou 66 uM s jednotlivými prídavkami 1, 2, 2, 5, 5, 10, 10, 20, 50 ul, čiže sa celkom použilo 105 ul TIN2 proteinu. K zaisteniu homogenity roztoku v kyvete bolo použité magnetické miešadielko. Pre každý prídavok proteinu TIN2 a bazálnu 25 hodnotu boli namerané tri hodnoty anizotropie. Pre účely zostavenia grafu a výpočet disociačnej konštanty sa opakované merania pre daný prídavok spriemerovali a pri výpočtoch bol zohľadnený faktor koncentrácie TIN2 proteinu (o faktore koncentrácie TIN2 proteinu bude pojednávané v diskusii kapitola 5.4.). Vyhodnotenie anizotropie a stanovenie väzbovej krivky bolo uskutočnené pomocou programu SigmaPlot (Systat Software). 26 4. Výsledky 4.1. Optimalizácia expresie a purifikácia TIN2 proteinu Počiatočná expresia proteinu TIN2 prebiehala v bunkách E.coli BL21 (DE3), avšak produkt bol po prečistení značne naštiepený. Bolo potvrdené pomocou western blotu a následnou imunochemifluorescenčnou detekciou, že v jednotlivých fragmentoch je prítomný His-tag, čo viedlo k hypotéze, že sa jedná o skrátené produkty proteinu TIN2 v dôsledku rozdielneho zastúpenia tRNA v prokaryotickom expresnom systéme E.coli a v ľudskom expresnom systéme, z ktorého je sekvencia cDNA odvodená. Táto hypotéza bola neskôr potvrdená bioinformatickou analýzou v programe GCUA (Graphical Codon Usage Analyser), keď bola zistená korelácia s dĺžkou skrátených verzií a pozície v E.coli vzácne sa vyskytujúceho tripletu CTA. Na základe tohto boli zvolené iné kmene, ktoré obsahovali tento a aj iné vzácne kodóny (Obr. 14). blot TIN2 z BL21(DE3) codon plus RILP SDS-page TIN2 TIN2 TIN2 marker TIN2 TIN2 marker Expresia proteinu TIN2 bola prevedená do buniek E.coli CodonPlus® RIPL. Podmienky expresie boli optimalizované na zvýšenie výťažku pre nasledujúce podmienky: teplota inkubácie po indukcii, koncentrácia IPTG potrebná pre indukciu, dĺžka expresie, zmena teploty počas indukcie, miera airácie po indukcii. Purifikácia bola prevedená afinitnou chromatografiou IMAC (Imobilized Metal ion Affinity 27 Chromatography) s medzi krokom inkubácie v ATP pufri. IMAC využíva afinitu kovových iónov k His-tagu proteínov. Koncentrácia bola stanovená Bradfordovej metódou (Bradford, 1976) a získané frakcie produktu boli ďalej podrobené analýze na SDS-page a zviditeľnené pomocou kitu PROTEOSILVER™ Silver Stain (Sigma). Pre denzitometrické určenie hodnoty podielu TIN2 bolo použité farbenie Coomassie Briliant Blue R-250 (Obr. 15). Obr. 15: Gél určený pre denzitometrickú analýzu, marker udáva hodnotz v kDa ^ TIN2 Standart proteinu (rôzne koncentrácie) (rôzne koncentrácie) marker 170 ' — - 130 95 72 55 43 34 26 4.2. Stechiometria interakcie TIN2 s TRF2-YFP Stechiometria interakcie bola určená retardačnou analýzou (EMSA). Protein TRF2YFP je fúzny protein TRF2 proteinu a žltého fluorescenčného proteinu (Yellow Flourescence Protein). Tento protein má zachovanú schopnosť viazať sa na DNA a aj na TIN2 protein rovnako ako TRF2 bez pripojeného Y F P . Pre retardačnú analýzu bol navrhnutý reakčný systém s troma komponentmi už spomínaným TRF2YFP, TIN2a DNA. Pomery na obrázku 16 udávajú relatívne zastúpenie TIN2 proteinu kTRF2YFP+DNA. Látkové množstvo TRF2-YFP+DNA je v každej dráhe konštantné. Rímska číslica I označuje pruhy, kde sa nachádza komplex TIN2 s TRF2-YFP+DNA, 28 rímska číslica II označuje pruhy s komplexom TRF2-YFP+DNA a rímska III označuje čistú DNA. Ako vidno TIN2 s narastajúcim látkovým množstvom posúva intenzitu pruhov komplexu TRF-YFP+DNA čoraz viac k nižším hodnotám, ale nie je možné určiť stechiometrický pomer, pretože pruh komplexu TRF2-YFP+DNA nevymizol ani pri mnohonásobnom zvýšení látkového množstva proteinu TIN2 oproti očakávanej hodnote. Obr. 16: Interakcia TIN2 s TRF2-YFP a DNA 4.3. Stanovenie väzbovej afinity TIN2 a TRF2 Určenie väzbovej afinity bolo uskutočnené metódou anizotropie fluorescencie. Pre roztok TRF2-YFP (100nM) v kyvete boli namerané bazálne hodnoty anizotropie fluorescencie a následne bol do kyvety pridaný protein TIN2 (tabuľka 1). V dôsledku väzby proteínov TIN2 a TRF2-YFP dochádzalo k zvyšovaniu nameraných hodnôt. Pre každý prídavok boli uskutočnené tri merania, z ktorých bola pre zostavenie grafu a určenie disociačnej konštanty použitá priemerná hodnota. 29 Tabuľka 1: Namerané hodnoty anizotropie c(nM) r1 r2 r3 0 0,30322 0,30309 0,30312 4,68237 0,30399 0,30389 0,30419 14,02708 0,30365 0,30272 0,30402 23,3452 0,30525 0,30306 0,30346 46,52482 0,30554 0,30522 0,30535 69,54064 0,30608 0,3064 0,30579 115,0877 0,3084 0,30893 0,30751 160 0,30984 0,30904 0,31032 247,9725 0,3109 0,31205 0,31205 457,6744 0,31682 0,31817 0,31687 Väzba TIN2 k TRF2-YFP 0.320 m 1 1 1 0.315 " 0.310 - • 0.305 - 0.300 >—1 1 1 1 1 1 0 100 200 300 400 500 TIN2 (nanoM) Obr 17: Graf anizotropie fluorescencie v záwslosti na koncentrácii TIN2 Disociačná konštanta bola určená zo závislosti koncentrácie proteinu a anizotropie fluorescencie (Obr. 17) na hodnotu Kd= 910±210nM s 28% chybou. Takto vysoká chyba bola zapríčinená veľkým rozptylom nameraných hodnôt anizotropie fluorescencie pre jednotlivé prídavky. 30 5. Diskusia 5.1. Expresia a purifikácia TIN2 proteinu Expresia proteinu TIN2 pôvodne prebiehala v bunkách E.coli BL21 (DE3), v ktorých vznikal značne naštiepený produkt. Western-blotový prenos a detekcia chemilumiscenčnou metódou ukázali, že jednotlivé naštiepené fragmenty obsahujú His-tag, čo viedlo k hypotéze, že sa jedná o skrátené verzie TIN2 proteínov. Bioinformatická analýza potvrdila túto hypotézu a odhalila koreláciu medzi dĺžkou skrátených úsekov a umiestnením tripletu CTA v c D N A použitej v expresnom vektore. tRNA pre tento triplet je v bežných expresných bunkách E.coli zastúpená veľmi nízkym výskytom, čo má za následok ukončenie expresie proteinu, akoby sa jednalo o stop kodon. Po potvrdení hypotézy bolo teda nutné zvoliť iný kmeň expresných buniek. Výber E.coli CodonPlus® RIPL nebol náhodný. Táto línia buniek obsahuje niekoľko dálších génov pre tRNA z nízkym zastúpením v transkrypčnom aparáte bežných E.coli buniek, čím predchádza dálším potencionálnym problémom pri expresii zvyšných proteínov shelterinového komplexu v budúcnosti a zároveň rieši problém skrátených verzií proteinu TIN2. Ďalšou výhodou E.coli CodonPlus® RIPL oproti iným kmeňom je jednoduchšia manipulácia a menšie nároky na udržiavanie vektorov s génmi pre „vzácne" tRNA. Ako vidno na obrázku č.14 v porovnaní s predošlými E.coli BL21 (DE3) majú E.coli CodonPlus® RIPL menej fragmentovaný produkt. Purifikácia prebiehala celkom uspokojivo, až na problémy s kopurifikáciou chaperónov spoločne s TIN2 proteínom. Pri stresových podmienkach bunky E.coli nedokážu zbaliť protein bežnou cestou počas expresie. Tento problém riešia pomocnými proteínmi, ktoré obklopia exprimovaný protein a vytvoria tak podmienky pre jeho zbalenie. Zvyčajne túto dráhu spúšťa tzv. heat shock ale môžu ju spustiť aj iné podmienky ako napr. veľkosť exprimovaného proteinu. V prípade overexpresie väčších proteínov o veľkosti cca 50kDa a viac dochádza v bunkách k spusteniu tejto stresovej dráhy. V tomto prípade sa jedná o kombináciu oboch faktorov, tak ako heat shocku, tak aj veľkosti fúzneho proteinu, ktorého veľkosť je takmer 80kDa. Počas medzi kroku s inkubáciou v ATP pufri (20mM Hepes, 10mM MgCl2, 5mM ATP a 150mM KCI pH=7 ) pri purifikácii vzniká komplex MgCl2/ATP, ktorý narúša väzbu 31 chaperónov na purifikovaný protein, čo umožňuje ich odmytie a purifikáciu čistého proteinu (Joseph and Andreotti, 2008). 5.2. Stechiometria interakcie TIN2 s TRF2-YFP. Očakávaný výsledok retardačnej analýzy bola stechiometria 1:1 ale ako vidno na Obr. 16 z retardačnej analýzy sa nepodarilo určiť stechiometrický pomer väzby TIN2 TRF-YFP. Retardačná analýza síce umožňuje určenie stechiometrie, ale zvyčajne býva zaťažená značnou chybou, najmä pri určení koncentrácií jednotlivých komponentov. Táto chyba môže spôsobiť odchýlenie údajov od skutočného pomeru aj o 25%. K tomu je nutné ešte prirátať možnú chybu pri určení faktora koncentrácie TIN2. Chyba je o to väčšia, že v jamkách ostal nezaputovaný TRF2-YFP. Tento jav je bežný u TRF2 proteinu, ktorý vytvára veľké homomultimerné komplexy (VizlinHodzic, 2009), ktoré jednak neochotne reagujú z niektorými komponentmi v reakcii, ale predovšetkým sú príliš veľké na zaputovanie do gélu, čím zanášajú ďalšiu chybu do analýzy. Homomultimér TRF2 nezaputováva ani v 4% polyakridamidovom gélu, čo je pravdepodobne gél s najnižšou hustotou, s ktorým sa dá ešte pracovať, pretože redšie gély už nie sú dostatočne konzistentné k manipulácii pri analýze (Jana Pavloušková, 2010). K zaputovaniu TRF2 malo napomôcť aj pridanie proteinu TIN2 (Kim, 1999), ktorý síce bol prítomný, ale množstvo vzniknutého mutliméru bolo pravdepodobne príliš veľké. Vzorkám mal pomôcť v zaputovávaní aj prídavok Coomassie® Briliant Blue G-250, ktorá sa nešpecifický viaže na proteiny a zvyšuje ich záporný náboj, čím zväčšuje elektrickú silu, ktorá pôsobí na molekuly. Aj napriek využitiu všetkých týchto prídavných mechanizmov súčasne, nie je momentálne možné určiť stech iometrický pomer, pretože z komplexu TRF2-YFP s DNA ubúda, s rastúcim zastúpením TIN2 proteinu band komplexu TRF2-YFP s DNA nevymizol. Úplne prevedené zmeny oproti bežnému protokolu síce zlepšili zaputovávanie, ale nie natoľko, aby sa dala určiť stechiometria. 32 5.3. Stanovenie väzbovej afinity TIN2 a TRF2 Afinita TIN2 proteinu k proteinu TRF2 bola určená pomocou metódy anizotropie fluorescencie. Pri analýze bol k roztoku fúzneho proteinu TRF2-YFP postupne pridávaný TIN2 protein, ktorý vytváral s TRF2-YFP komplex, čo viedlo k zvyšovaniu hodnoty anizotropie fluorescencie, ako je možné vidieť na grafe 1. Väzbová krivka, ktorá je znázornená na grafe v podobe izotermy, vyobrazuje závislosť normalizovaných hodnôt anizotropie fluorescencie na koncentrácii proteinu TIN2. Koncentrácia proteinu TIN2 bola aj v tomto prípade faktorizovaná a faktor bol premietnutý do výpočtu koncentrácie pri príprave analýzy anizotropie fluorescencie. Stanovená disociačná konštanta bola 910 ± 210 nM, s udanou chybou 28%. Táto chyba môže mať niekoľko príčin. Ako vidno na grafe č. 1, pre jednotlivé prídavky proteinu TIN2 sú veľké odchýlky hodnoty anizotropie fluorescencie od normalizovanej hodnoty, čo má za následok relatívne významnú chybu pri určení disociačnej konštanty. Tieto odchýlky boli najpravdepodobnejšie spôsobené chybou merania. Druhou príčinou by mohla byť chyba merania pri určovaní koncentrácií proteínov TIN2 a TRF2-YFP. Určenie koncentrácie proteínov prebiehalo pomocou metódy Bradfordovej (Bradford, 1976). Tretia zložka, ktorá má vplyv na chybe určenia disociačnej konštanty je chyba merania pri určovaní faktoru koncentrácie TIN2 proteinu. Aj napriek značnej chybe určenia disociačnej konštanty nám zistená hodnota udáva približnú hodnotu, s ktorou je dálej možné pracovať v rámci dálších interakčných štúdií. 5.4. Faktor koncentrácie TIN2 proteinu Kedže žiadna z odskúšaných metód pri optimalizácii purifikácie nebola celkom účinná a vo vzorke je značné množstvo fragmentov pozostávajúcich hlavne z GST a His tagov, pre pokračovanie analýz pre túto diplomovú prácu bola zvolená možnosť používania čiastočne purifikovanej vzorky (Obr. 18). 33 Obr. 18: Čiastočne nurifikovanv TIN2 Predpokladali sme, že fragmenty ktoré sú pri znečistení dominantné, by nemali nijako ovplyvňovať interakciu TIN2 a TRF2, kedže nebola popísaná interakcia TRF2 proteinu či už s GTS alebo His tágom. Faktor koncentrácie proteinu TIN2 teda vyjadruje podiel proteinu TIN2 na celkovej koncentrácii vzorky získanej pri expresii a purifikácii samotného proteinu. Jeho stanovenie prebiehalo denzitometrickou metódou použitím fluorescenčného skenera FLA 7000 (Fujifilm), v ktorom bol nafotený gél a vyhodnocovacím softwarom Mutligauge (Fujifilm). Faktor bol určený na hodnotu 0,26 a bol použitý pri všetkých prepočtoch koncentrácie proteinu TIN2. Aj keď použitím faktorizácie koncentrácie sa do dálších analýz vniesla vyššia chyba merania, bez faktorizácie by získané výsledky boli zaťažené omnoho väčšou chybou, prípadne by ich nebolo možné bez faktorizácie získať. 5.5. Záver Predmetom tejto práce bola expresia proteinu TIN2 a popis jeho interakcií s proteínom TRF2. Expresia proteinu TIN2 bola optimalizovaná. Protein TIN2 bol purifikovaný pri použití modifikovaného protokolu pre metalo afinitnú purifikáciu, ktorou bolo dosiahnuté výrazné zníženie kopurifikovaných komponentov. Avšak dosiahnutá čistota proteinu dovoľovala prevedenie len počiatočných štúdií. Bola uskutočnená retardačná analýza na gélu, ktorá ukázala, že reakčná zmes obsahujúca protein TIN2 interaguje s proteínom TRF2 a mení denzitometrický profil 34 elektroforetických pásov. Stanoviť presný stechiometrický pomer interakcie sa nepodarilo. Metódou merania zmeny anizotropie fluorescencie bola stanovená väzbová konštanta proteinu TIN2 k proteinu TRF2. V rámci tejto práce bolo overené, že techniky založené na fluorescenčnej detekcii biomolekúl môžu byť využité pri sledovaní interakcie proteínov shelterinu a telomerickej DNA. 35 6. Súhrn Konce lineárnych chromozómov, nazývané teloméry, sú chránené špecifickými proteinovými komplexami naviazanými na telomerickou úseky DNA. U človeka sa tento komplex šiestich proteinov označuje ako shelterin. Protein TIN2 ma ústredne postavenie v shelterinovom komplexe, kde sa účastní na troch väzbách, čo ho robí primárním cieľom pre podrobnejšie skúmanie k objasneniu stavby komplexu. V rámci tejto práce bola charakterizovaná interakcia proteinu TIN2 s proteínom TRF2. Po analýze väzby za použitia anisotropie fluorescencie, bola stanovená afinita väzby a určena disociačna konštanta. Výsledky tejto štúdie budú v budúcnosti využité pre porovnanie afinity TIN2 k ostatným proteínom shelterinového komplexu a prispejú takto k objasneniu spôsobu formovania shelterinového komplexu. Aj keď určenie stechiometrie proteinov TRF2 a TIN2 nebolo úspešné, táto práca môže poslúžiť pre dálšie štúdie založené na retardačnej analýze TRF2 proteinu ako východzí štúdia pre zvýšenie gelovej mobility proteinu TRF2. Nové molekulárne poznatky o shelterinovom koplexe pomôžu lepšie objasniť štruktúru a funkciu zložitého proteínového komplexu shelterinu, ktorý stabilizuje tvar telomér a reguluje ich predlžovanie. Uplatnením týchto poznatkov môže raz viesť k možnosti priamo ovplyvňovať dĺžku telomér a tým by ľudstvu poskytlo nástroj pre omladzovanie buniek, či pre selektívnu liečbu rakoviny. 36 7. Summary The ends of linear chromosomes - telomeres are protected by specific protein complexes which bind telomeric DNA. The human teleomere binding complex consisting of six proteins is called shelterin. Protein TIN2 has central position in shelterin complex. Protein TIN2 participates in three pivotal interactions within shelterin protein complex, which makes this protein primary target for detailed studies with the aim to clarify assembly and function of shelterin complex. In this diploma thesis, interactions of protein TIN2 with protein TRF2 were characterized. Measurements of fluorescence anisotropy were used for analysis of the binding affinity TIN2 and TRF2. The dissociation constant for the binding interaction was estiamted. The results of this study could be used for comparison of TIN2 binding affinity to other proteins of shelterin complex and could contribute to elucidate the mechanism of shelterin protein complex formation. Even though the estiamation of stochiometric ratio for interaction of proteins TIN2 and TRF2 by gel retardation assay wasn't successful, the initial results could be helpful for future gel mobility studies of TRF2 protein and its interaction. New knowledge of molecular properites of shelterin protein complex could help to shed more ligt on structure and function of the complicated shelterin protein complex, which stabilizes shape of telomeres and regulates their prolongation. These finding could be used in applications that could once lead into possibility of direct control of telomere length. These new possibilities of molecular regulation of cell life would allowed mankind to rejuvenate cells and selectively heal cancer tissues. 37 8. Liretatura Baumann, P. and Cech, T. R. 2001. Pot1, the putative telomere end-binding protein in fission yeast and humans. Science. 292: 1171 -1175. Baumann, P., Podell, E. and Cech, T. R. 2002. Human Pot1 (Protection of Telomeres) Protein: Cytolocalization, Gene Structure and Alternative Splicing. Mol Cell Biol. 22: 8079 - 8087. Bianchi, A., Smith, S., Chong, L, Elias, P. and de Lange, T. 1997. TRF1 is a dimer and bends telomeric DNA. EMBO J . 16:1785 - 1794. Bilaud, T., Koering, C. E., Binet-Brasselet, E., Ancelin, K., Pollice, A., Gasser, S. M. and Gilson, E. 1996. The telobox, a Myb related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human. Nucleic Acids Res. 24: 1294 - 1303. Bilaud, T., Brun, C , Ancelin, K., Koering, C. E., Laroche T. and Gilson, E. 1997. Telomeric localization of TRF2, a novel human telobox protein. Nat Genet. 17: 236 - 239. Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of mikrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. Braz, V. A., Howard, K. J. 2009. Separation of protein oligomers by blue native gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 388:170 - 172. Broccoli, D., Smogorzewska, A., Chong, L. and de Lange, T. 1997. Human telomeres contain two distinct Myb-related proteins, TRF1 and TRF2. Nat Genet. 17:231 -235. Buczek, P. and Horvath, M. P. 2006. Thermodynamic characterization of binding Oxytricha nova single strand telomere DNA with the alpha protein N-terminal domain. J . Mol. Biol. 359: 1217-1234. Chong, L, van Steensel, B., Broccoli, D., Erdjument-Bromage, H., Hanish, J., Tempst P. and de Lange, T. 1995. A human telomeric protein. Science. 270: 1663 - 1667. Colgin, L. M., Baran, K., Baumann, P., Cech, T. R. and Reddel, R. R. 2003. Human POT1 facilitates telomere elongation by telomerase. Curr Biol. 13: 942 - 946. 38 Cook, B. D., Dynek, J. N., Chang, W., Shostak, G. and Smith, S. 2002. Role for the related poly(ADP-Ribose) polymerases tankyrase 1 and 2 at human telomeres. Mol Cell Biol. 22: 332 - 342. Fajkus, J., Kovarik, A., Kralovics, R. and Bezděk, M. 1995. Organization of telomeric and subtelomeric chromatin in the higher plant Nicotiana tabacum. Mol Gen Genet. 247: 633 - 638. Fairall, L., Chapman, L., Moss, H., de Lange, T. and Rhodes, D. 2001. Structure of the TRFH Dimerization Domain of the Human Telomeric Proteins TRF1 and TRF2. Mol Cell. 8:351 -361. Griffith, J. D., Comeau, L, Rosenfield, S., Stansel, R. M., Bianchi, A., Moss, H. and de Lange, T. 1999. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell. 97:503-514. Hayflick, L. and Moorhead, P. S. 1961. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25: 585 - 621. In Ouellette, M. M., Liao, M., Herbert, B. S., Johnson, M., Holt, S. E., Liss, H. S., Shay, J. W. and Wright, W. E. 2000. Subsenescent telomere lengths in fibroblasts immortalized by limiting amounts of telomerase. J Biol Chem. 275: 10072 - 10076. Heyduk, T. and Lee, J. C. 1990. Application of fluorescence energy transfer and polarization to monitor Escherichia coli cAMP receptor protein and lac promoter interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1744 - 1748. Hofr, C , 2010. Materiály predmetu Pokročilé biofyzikálne metódy v experimentálnej biológii. Houghtaling, B. R., Cuttonaro, L., Chang, W. and Smith, S. 2004. A dynamic molecular link between the telomere length regulator TRF1 and the chromosome end protector TRF2. Curr Biol. 14: 1621 - 1631. Jady, B. E., Richard, P., Bertrand, E. and Kiss, T. 2006. Cell cycle-dependent recruitment of telomerase RNA and Cajal bodies to human telomeres. Mol Biol Cell. 17:944-954. Joseph, R. E., Andreotti, A. H. 2008. Bacterial expression and purification of lnterleukin-2 Tyrosine kinase: Single step separation of the chaperonin impurity. Protein Expression and Purification. 60:194-197. Kaminker, P. G., Kim, S. H., Taylor, R. D., Zebarjadian, Y., Funk, W. D., Morin, G. B., Yaswen, P. and Campisi, J. 2001. TANK2, a new TRF1 -associated 39 poly(ADP-ribose) polymerase, causes rapid induction of cell death upon overexpression. J Biol Chem. 276: 35891 - 35899. Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S. and de Lange, T. 1999. p53-and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science. 283: 1321 - 1325. Kelleher, C , Kurth, I. and Lingner, J. 2005. Human protection of telomeres 1 (POT1) is a negative regulator of telomerase activity in vitro. Mol Cell Biol. 25: 808 -818. Kim, S. H., Kaminker, P. and Campisi, J. 1999. TIN2, a new regulator of telomere length in human cells. Nat Genet. 23: 405 - 412. Kipling, D. and Cooke, H. J. 1990. Hypervariable ultra-long telomeres in mice. Nature. 347: 400 - 402. Klempnauer, K. H., Gonda, T. J. and Bishop, J. M. 1982. Nucleotide sequence of the retroviral leukemia gene v-myb and its cellular progenitor c-myb: the architecture of a Lakowicz, J.R. 2006. Principles of fluorescence spectroscopy. Third edition. Joseph R. Lakowicz, Baltimore, de Lange, T. 2005. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19: 2100 - 2110. Lei, M., Podell, E. R. and Cech, T. R. 2004. Structure of human POT1 bound to telomeric single-stranded DNA provides a model for chromosome end-protection. Nat Struct Mol Biol. 11:1223 - 1229. Lei, M., Zaug, A. J., Podell, E. R. and Cech, T. R. 2005. Switching human telomerase on and off with hPOT1 protein in vitro. J Biol Chem. 280: 20449 - 20456. Li, B., Oestreich, S. and de Lange, T. 2000. Identification of human Rap1: Implications for telomere evolution. Cell. 101: 471 - 483. Liu, Y., Kha, H., Ungrin, M., Robinson, M. O. and Harrington, L. 2002. Preferential maintenance of critically short telomeres in mammalian cells heterozygous for mTert. Proc Natl Acad Sci USA. 99: 3597 - 3602. Liu, D., O'Connor, M. S., Qin, J. and Songyang, Z. 2004. Telosome, a mammalian telomere-associated complex formed by multiple telomeric proteins. J Biol Chem. 279:51338-51342. 40 Loayza, D. and de Lange, T. 2003. POT1 as a terminal transducer of TRF1 telomere length control. Nature. 423:1013 - 1018. Makarov, V. L., Hirose, Y. and Langmore J. P. 1997. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell. 88: 657 - 666. Marcand, S., Brevet, V. and Gilson, E. 1999. Progressive c/s-inhibition of telomerase upon telomere elongation. EMBO J . 18: 3509 - 3519. Moyzis, R. K., Buckingham, J. M., Cram, L. S., Dani, M., Deaven, L. L., Jones, M. D., Meyne, J., Ratliff, R. L. and Wu, J.-R. 1988. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 85: 6622 - 6626. O'Connor, M. S., Safari, A., Liu, D., Qin, J. and Songyang, Z. 2004. The human Rap1 protein complex and modulation of telomere length. J Biol Chem. 279: 28585-28591. O'Connor, M. S., Safari, A., Xin, H., Liu, D. and Songyang, Z. 2006. A critical role for TPP1 and TIN2 interaction in higher-order telomeric complex assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 103: 11874 - 11879. Ouellette, M. M., Liao, M., Herbert, B. S., Johnson, M., Holt, S. E., Liss, H. S., Shay, J. W. and Wright, W. E. 2000. Subsenescent telomere lengths in fibroblasts immortalized by limiting amounts of telomerase. J Biol Chem. 275: 10072 - 10076. Palm, W., Hockemeyer, D., Kibe, T., de Lange, T. 2008. Functional dissection of human anf mouse POT1 proteins. Mol Cell Biol. 29: 471-482. Palm, W. and de Lange, T. 2008. How shelterin protects mamalian telomeres. Ann Rev Genetics. 42: 301-334. Pavloušková, J. 2010. Interakce proteinů shelterinu s telomerickou DNA. Riha, K., McKnight, T. D., Fajkus, J., Výskot, B. and Shippen, D. E. 2000. Analysis of the G-overhang structures on plant telomeres: evidence for two distinct telomere architectures. Plant J . 23: 633 - 641. Rosypal, S. 2002. Úvod do molekulární biologie. Druhý díl. Třetí inovované vydání. Stanislav Rosypal, Brno. Shakirov, E. V. and Shippen, D. E. 2004. Length regulation and dynamics of individual telomere tracts in wild-type Arabidopsis. Plant Cell. 16: 1959 - 1967. 41 Smith, S. and de Lange, T. 2000. Tankyrase promotes telomere elongation in human cells. Curr Biol. 10:1299 - 1302. Smith, S., Giriat, I., Schmitt, A. and de Lange, T. 1998. Tankyrase, a poly(ADPribose) polymerase at human telomeres. Science. 282: 1484 - 1487. Smogorzewska, A., van Steensel, B., Bianchi, A., Oelmann, S., Schaefer, M. R., Schnapp, G. and de Lange, T. 2000. Control of Human Telomere Length by TRF1 and TRF2. Mol Cell Biol. 20: 1659 - 1668. van Steensel, B. and de Lange, T. 1997. Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1. Nature. 385: 740 - 743. van Steensel, B., Smogorzewska, A. and de Lange, T. 1998. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell. 92: 401 - 413. Sundquist, W. I. and Klug, A. 1989. Telomeric DNA dimerizes by formation of guanine tetrads betwee hairpin loops. Nature. 342: 825 - 829. Ten Hagen, K. G., Gilbert, D. M., Willard, H. F. and Cohen, S. N. 1990. Replication timing of DNA sequences associated with human centromeres and telomeres. Mol Cell Biol. 10: 6348-6355. Tomlinson, R. L., Ziegler, T. D., Supakorndej, T., Terns, R. M. and Terns, M. P. 2006. Cell cycle-regulated trafficking of human telomerase to telomeres. Mol Biol Cell. 17:955-965. Vizlin-Hodzic, D., Ryme, J., Simonsson, S., Simonsson, T. 2009. Developmental studies of Xenopus shelterin complexes: the message to reset telomere length is already present in the egg. Faseb Journal. 23: 2587-2594. Wang, Y. and Patel, D. J. 1993. Solution structure of the human telomeric repeat d[AG3(T2AG3)3] G-tetraplex. Structure. 1: 263 - 282. Wang, F., Poděli, E. R., Zaug, A. J., Yang. Y., Baciu, P., Cech, T. R. and Lei, M. 2007. The POT1-TPP1 telomere complex is a telomerase processivity factor. Nature. 445: 506-510. Williamson, J. R., Raghuraman, M. K. and Cech, T. R. 1989. Monovalent cationinduced structure of telomeric DNA: The G-quartet model. Cell. 59: 871 - 880. Xin, H., Liu, D., Wan, M., Safari, A., Kim, H., Sun, W., O'Connor, M. S and Songyang. 2007. TPP1 is a homologue of ciliate TEBP-8 and interacts with POT1 to recruit telomerase. Nature. 445: 559 - 562. Yang, Q., Zheng, Y. L. and Harris, C. C. 2005. POT1 and TRF2 cooperate to maintain telomeric integrity. Mol Cell Biol. 25: 1070 - 1080. 42 Ye, J. Z., Donigian, J. R., van Overbeek, M., Loayza, D., Luo, Y., Krutchinsky, A. N., Chait, B. T. and de Lange, T. 2004a. TIN2 binds TRF1 and TRF2 simultaneously and stabilizes the TRF2 complex on telomeres. J Biol Chem. 279: 47264 - 47271. Ye, J. Z., Hockemeyer, D., Krutchinsky, A. N., Loayza, D., Hooper, S. M., Chait, B. T. and de Lange, T. 2004b. POT1-interacting protein PIP1: a telomere length regulator that recruits POT1 to the TIN2/TRF1 complex. Genes Dev. 18: 1649 - 1654. Zaug, A. J., Poděli, E. R. and Cech T. R. 2005. Human POT1 disrupts telomeric G-quadruplexes allowing telomerase extension in vitro. Proc Natl Acad Sei USA. 102: 10864- 10869. Internetové zdroje: http://www.genomeknowledge.org/figures/t-loop_all.jpg http://delangelab.rockefeller.edu/research.html http://stemcells.nih.gov, http://fyzika.jreichl.com/ http://phobos.ramapo.edu/~pbagga/GQ_structure.jpg 43 9. Použité skratky EMSA z angl. Electrophoretic Mobility Shift Assay, Retardačná analýza dsDNA z angl. double-stranded DNA d-slučka displacement loop His-tag histidinová kotva hRapI z angl. human Repressor activator protein 1 IMAC z angl. Immobilized Metal-ion-Affinity Chromatography IPTG IsoPropyl B-D-1 -ThioGalactopyranosid kb kilobáza Kd disociačná konštanta kDa kiloDalton OB fold z angl. Oligonucleotide/Oligosaccharide-Binding fold PIP1 z angl. POT Interacting Protein 1 POT1 z angl. Protection Of Telomeres 1 PTOP z angl. POT and TIN2 Organizing Protein RCT z angl. Rap1 C-Terminus RD z angl. POT1-Recruitment Domain ssDNA z angl. single-stranded DNA Tankyráza z angl. TRF1-interacting ANKyrin-Related ADP-ribose polymerase TEBP z angl. TElomere Binding Protein TERT (hTERT) z angl. TElomerase Reverse Transcriptase (humanTERT) TI D z angl. TIN2-lnteracting Domain TIN2 z angl. TRF1-Interacting Nuclear Protein 2 TINT1 z angl. TIN2 INTeracting protein 1 TPP1 z angl. Three Prime Phosphatase-1, TriPeptidyl Peptidase 1 TR (hTR) z angl. Telomerase RNA (humanTR) TRF z angl. TTAGGG Repeat binding Factor, Telomeric Repeat binding Factor TRFH z angl. TRF Homology domain t-slučka telomerová slučka 44