MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav botaniky a zoologie Velikost genomu a nadmořská výška Diplomová práce Autorka: Vedoucí diplomové práce: Bc. et Bc. Daniela Bártová Dittrichová doc. RNDr. Petr Bureš, Ph.D. Velikost genomu a nadmořská výška Abstrakt Diplomová práce se zabývá vztahem vnitrodruhové variability velikosti genomu k nadmořské výšce. Na modelových druzích, merených prUtokovou cytometrií, ukazuje, že jejich variabilita (Hordeum spontaneum 2,7 %, Dactylis glomerata 11 %) není vysvetlitelná gradientem nadmorské výšky. Falzifikuje tak závery předchozí studie Reevese et al.(1998), provedené na témže materiálu genetické banky IGER z populací Dactylis glomerata z jižní a jihozápadní Evropy. Pomocí dat z globálního klimatického modelu poukazuje na obtížnou srovnatelnost studií z riůzných geografických oblastí, založených na nadmorřské výšce jako vysveřtlující promeřnné. Klíčová slova Velikost genomu, obsah DNA, nekódující DNA, Hordeum spontaneum, Dactylis glomerata, vnitrodruhová variabilita, ASTER GDEM, Worldclim Abstračt This thesis deals with the relationship of intraspecific genome size variation and altitude. Samples of model species were measured by means of flow cytometry. We conclude, that observed genome size variation (2,7 % in Hordeum spontaneum , 11 % in Dactylis glomerata) is not related to the altitude of sample origin. This conclusion is in disagreement with previous studies by Reeves et al. (1998) in Dactylis glomer-ata from southern and southwestern Europe, despite the fact, that the same IGER accessions were used. Difficulties, which occur while comparing studies based on altitude as an explanatory variable, but originating from different geographic regions, are shown on data from a global climatic model. Keywords Genome size, DNA content, junk dna, ecogeographic factors, Hordeum sponta-neum, Dactylis glomerata, intraspecific variation, Large genome constraint hypothesis, ASTER GDEM, Worldclim 2 Velikost genomu a nadmořská výška Prohlášení Prohlašuji, že jsem práci zpracovala samostatne pod vedením doc. RNDr. Petra Bureše, Ph.D. Uvedla jsem všechny prameny a literární zdroje, ze kterých jsem Čerpala. Souhlasím s uložením této diplomové práce v knihovne Ústavu botaniky a zoologie PřF MU v Brne, prípadne v jiné knihovne MU a elekronickém archivu IS MU, s jejím verřejným pujcřováním a využitím pro veřdecké, vzdeřlávací nebo jiné verřejneř prospešné úcely, a to za predpokladu, že prevzaté informace budou rádne citovány a nebudou využívány komercřneř. Jsem seznámena s tím, že na moji diplomovou práci se plne vztahuje zákon c.121/2000 Sb. - autorský zákon, zejména § 35 - využití díla v rámci obcanských a náboženských obřadu, v rámci školních predstavení a využití díla školního a § 60 -školní dílo. Prohlašuji, že elektronická verze práce, vložená v IS MU, a tišteřná verze práce jsou shodné. V Brně v plném květnu 2010 3 Velikost genomu a nadmořská výška Poděkování Petru Burešovi, Petru Šmardovi, Ivane Hralové, Dite Blažkové, Jane Procházkové, Lucii Horové, Jakubovi Šmerdovi, Libuši Dittrichové, Pavlu Veselému, Olze Rotreklové, I.D. Thomasovi, Tomáši PavlíCkovi a Patricii Cardet, Ludvíku Bártovi, Marii Bártové, Danovi, Páje & Adamovi a všem inspirátomrn, vzomm a spolecníkům. 4 Velikost genomu a nadmořská výška Gutta cavat lapidem non vi sed saepe cadendo... 5 Velikost genomu a nadmořská výška Obsah 1 Úvod 9 1.1 Úskalí studia podél altitudinálních gradientu.............. 9 1.1.1 Co znamená nadmořská výška v ekologii?........... 9 1.1.2 Jaké jsou vlastnosti potenciálního modelového druhu? .... 11 1.2 Studium adaptivity vnitrodruhové variability velikosti genomu ... 11 1.2.1 Velikost genomu .......................... 11 1.2.2 Vnitrodruhová variabilita velikosti genomu .......... 12 1.2.3 Adaptivita velikosti genomu................... 13 1.2.4 StruCné shrnutí dosud publikovaných prípadových studií . . 16 1.3 Cíle práce................................... 17 2 Materiál a metodika 18 2.1 Studovaná území.............................. 18 2.2 Materiál ................................... 19 2.2.1 Deschampsia, Sesleria, Ranunculus................. 19 2.2.2 Hordeum spontaneum........................ 21 2.2.3 Dactylis glomerata .......................... 22 2.3 Meřrření velikosti genomu .......................... 27 2.4 Další morfologické charakteristiky.................... 32 2.4.1 Merení velikosti pmduchových bunek.............. 32 2.4.2 Herbářové položky......................... 32 2.5 Datové soubory a environmentální faktory............... 32 2.6 Statistická analýza .............................. 33 3 Výsledky 37 3.1 Deschampsia, Ranunculus, Sesleria ..................... 37 3.2 Hordeumspontaneum ............................ 39 3.3 Dactylis glomerata .............................. 44 3.3.1 Velikost genomu a nadmorřská výška .............. 45 3.3.2 Velikost genomu a další faktory prostrředí ............ 47 3.3.3 Velikost genomu a velikost priůduchových bunek....... 52 4 Diskuse 61 4.1 Deschampsia, Ranunculus, Sesleria: Hodnocení experimentu...... 61 4.2 Dactylis glomerata: Hodnocení experimentu a srovnání s výsledky puvodní studie ............................... 61 4.3 Dactylis glomerata, Hordeum spontaneum, velikost genomu....... 65 4.4 Dactylis glomerata, Hordeum spontaneum, adaptivita........... 66 4.5 Dactylis glomerata, velikost pruduchových bunek............ 70 4.6 Dactylis glomerata, Hordeum spontaneum, nadmorská výška ...... 70 6 Velikost genomu a nadmořská výška 5 Závěr 71 6 Prílohy 81 7 Velikost genomu a nadmořská výška Seznam použitých zkratek alt - Nadmořská výška ANCOVA - Analýza kovariance (užívající spojité i kategoriální vysvětlující proměnné) ANOVA - Analýza variance, (užívající spojité vysvětlující proměnné) DAPI - 4,6-diamidino-2-phenylindol DEM - Digital Elevation Model - digitální model terénu GS - Genome size - velikost genomu HEAT - název přomenné: index tepelného požitku (popsán na stř. 35) IGER GRU - Institute of Grassland and Environmental Research, Genetic Ressources Unit IVR - Index vyšikmenosti rozdelení (popsán na str. 35) LARGE - název pramenné: pmmemá velikost tří nejvetších genomu v populaci PC - Principal Component- hlavní komponenta, jedna z os mnohorozmerného prostom v PCA PCA - Principal Component Analysis - analýza hlavních komponent PI - Propidium jodid RAD - název promeřnné: index ozárřenosti(popsán na str. 35) SMALL - název promenné: průmerná velikost trí nejmenších genomu v populaci VAR - název promeřnné: rozptyl velikosti genomu populace. 8 Velikost genomu a nadmořská výška 1 Úvod 1.1 Úskalí studia podél altitudinálních gradientu 1.1.1 Co znamená nadmořská výška v ekologii? Empiricky vzato je gradient nadmořské výšky považován za jeden z nejstrmejších gradientu ekologických podmínek o Cemž svedCí např. altitudinální zonalita vegetace. Jakou však konkrétní informaci o charakteru stanovište, relevantní pro rostlinu, rrmže posktynout údaj o jeho nadmořské výšce? (Körner, 2007) Nadmorská výška není promennou, která pusobí sama o sobe, ale je gradientem, podél neřhož je rozložena rřada jiných, prředevším klimatických promeřnných, které rostliny prímo ovlivmijí. Celá rada z nich se mení v úzké vazbe na gradient nadmořské výšky a je s jejím efektem tradicne zamenována. K temto faktorům patrí: s nadmorskou výškou klesající atmosférický tlak, klesající parciální tlak plynu (z nichž jsou pro rostliny relevantní O2, CO2 a vodní pára), klesající teplota vzduchu, rostoucí ozárřenost a nocřní tepelné vyzarřování (tj. rostoucí amplituda mezi denním maximem a nocním minimem teplot), a rostoucí podíl UV-B zárení (Körner, 2007). Klimatické složky (prubeh teplot, intenzita záření) však nejsou s nadmorskou výškou spojeny globálne uniformním zpusobem. Na jejich promenlivosti se podílí prříslušnost konkrétího gradientu k vyššími geomorfologickému celku a tím i do specifické globální klimatické oblasti (ovlivnené zemepisnou šírkou, mořským proudením, kontinentalitou), specifických lokálních podmínek (prevládající smer proudeřní vzduchu, singularity, prřevládající tlakové útvary) která znamená zcela jiné výchozí hodnoty a jiný pmbeh techto faktorii. Dalším promenlivým prvkem gradientu nadmorské výšky jsou mezoklimatické a topoklimatické jevy, které mají sice obecný pmbeh, ale vycházejí z konkrétního tvaru reliéfu, orientace a sklonu svahu. Mohou se tak podílet na klimatické odlišnosti různých lokalit nezávisle na jejich nadmorské výšce (příkladem budiž snehové výležisko, inverzní údolí nebo vrcholová plošina). K temto faktorům je ješteř trřeba dodat další, s nadmorřskou výškou nekorelované lokální neklimatické jevy, jako promenlivá hloubka pudy, fyzikálne-chemická povaha substrátu, nebo velikost pohorří. Sekundárne pak mikroklimatické pomery promenuje lokální biota, reflektující jak celý komplex dosud jmenovaných promeřnných, tak další vlivy, naprříklad zmenšování plochy s rostoucí nadmorřskou výškou ((Körner, 2007), vedoucí ke vzniku situace analogické ostrovnímu fenoménu (Körner, 2007), a samozrřejmeř biotické interakce. 9 Velikost genomu a nadmořská výška Körner Körner (2007) diskutuje ve svém celoživotním díle proměny klimatu podél gradientu nadmorské výšky následujícím zpUsobem: • Změny atmosférického tlaku. Zrychlení difúze, zpiůsobené poklesem tlaku vzduchu, je kompenzováno sníženou teplotou, která zapríCíní opetovné zpomalení. Mimo to, transport CO2 probíhá ve fyziologických pochodech rostlin v kapalné fázi, která tak není tlakem vzduchu ovlivnena. Potvrzena je však adaptace v podobe efektivnejší fixace CO2 horskými druhy (Körner, 2003). • Změny teploty a rUstová forma. Riůzné riůstové formy rostlin jsou riizným zpiůsobem adaptovány k horskému klimatu. Například druhy s klonálním a polštárovitým ruustem nebo polokeře svým tvarem, který prispívá k akumulaci tepla. Není proto pro takové druhy nutností, aby byly adaptovány sníženým teplotním optimem fotosyntézy. Kontrastním prříkladem jsou stromové formy, pro neřž je typická primárneř teplotneř podmíneřná horní hranice výskytu (tj. lesa). (Körner, 2003). • Změny teploty v průběhu roku. Průmerná rocní teplota stanovište je ovlivneřna jeho kontitnentalitou, minimální rocřní teplota a délka vegetacřní sezóny pak nemá stejný prubeh s nadmorskou výškou vzhledem k existenci inverzí. • Srážky. Nevykazují žádný konzistentní vztah k nadmořské výšce. Mohou s ní být lokálne korelovány (napr. tak, jak je tomu na území CR), ale vždy je treba brát v úvahu topograficky a klimaticky danou promenlivost. Z údaje o nad-morřské výšce nelze obecneř predikovat úhrn srážek, ani jiné promeřnné, spojené s vlhkostí. • UV zárení. Publikované údaje o dopadajícím UV záření se obvykle vztahují k podmínkám bez oblacnosti. Avšak ani oblačnost nevykazuje konzistentní vztah k nadmorské výšce. S nadmořskou výškou rostoucí trend v expozici UV zárení se tedy netýká priumterných hodnot, ale maximálních. I tyto mohou být ješteř vyšší, než za úplneř jasného pocřasí, vlivem neřkolikanásobného odrazu mezi povrchem a oblacřností. • Délka věgětaCní sezóny. Trvání vegetacní sezóny je podmíneno nejen teplotneř, ale i vlhkostneř. Proto je zkracování vegetacřní sezóny s rostoucí nad-morřskou výškou typické pro temperátní oblast. Pro oblasti, kde je v nižších nadmořských výškách limitujícím faktorem vlkhkost, se rrmže vegetacní sezóna smerem do vyšších výšek prodlužovat. (Körner, 1998) Ve veřtšineř dosud publikovaných prací, týkajících se velikosti genomu a nad-morřské výšky, je na nadmorřskou výšku pohlíženo jako na komplexní faktor. Lokálne má tento pohled bezpochyby své opodstatnení, problematickým se však 10 Velikost genomu a nadmorřská výška stává prři vzájemném srovnání více prací, jejichž výsledky pocházejí z odlišných geografických regionu. V nekterých prípadech pak nelze separovat vliv faktoru s nadmorřskou výškou primárneř nesouvisejících, ale práveř v konkrétním gradientu s ní korelovaných. Ve své práci se pokusím nejrříve vyhodnotit vztah velikosti genomu studovaných organismu k nadmorské výšce jako komplexu (tedy tak, jak je s ní nakládáno ve vetšine podobných prací). Poté se pokusím separovat vliv nekterých dalších promeřnných, které gradient podmínek tvorří, a vztáhnout zmeřny ve velikosti genomu k nim. 1.1.2 Jaké jsou vlastnosti potenciálního modelového druhu? Je-li zámeřrem studovat promeřnlivost jediného rostlinného druhu podél altitudinál-ního gradientu, je zrřejmé, že je zapotrřebí vybrat takový druh, který se bude vyskytovat v co nejširším spektru nadmořských výšek. A to nejlépe kontinuálne po celé délce gradientu i v podmínkách zonality vegetace (strřídání lesních a nelesních ekosystému). Nesmí být také vázán na striktne přirozený typ biotopu, ale je třeba, aby se vyskytoval i v biotopech poloprřirozených (vzhledem k charakteru možných oblastí studia). Již z toho nástinu vyplývá, že možným modelem nebude ani tak ekologický specialista, ale spíše generalista, postrádající specifické adaptace, u nehož lze též prředpokládat vyšší úrovenř fenotypové plasticity a genetické variability. V neposlední rřadeř by nemeřl být druhem ohroženým, meřl by se vyskytovat v dostatecném poctu exempláru v jedné populaci a jeho šíření by nemelo být závislé na lidské cřinnosti. 1.2 Studium adaptivity vnitrodruhové variability velikosti genomu 1.2.1 Velikost genomu Velikost genomu (tedy obsah DNA v haploidním poctu chromozomu (Swift, 1950, Greilhuber et al., 2005) je jednou z podstatných charakteristik rostlinného druhu, jejíž význam stále nariůstá jak v oblasti studia evoluce druhu, tak jejich ekologie. U rostlin je podobne jako u dalších organismu evidentní nezávislost složitosti organismu na velikosti jeho genomu (Thomas, 1971). Rozsah velikostí genomu napríc všemi rostlinami je impozantní (od nejmenšího z dosud známých údaju u zelených ras Ostreococcus tauri 1C = 0,01 pg (Derelle et al. in Bennett et Leitch (2005), od ne-jmenší z krytosemenných Genlisea margaretae 1C = 0,064 pg (Greilhuber, 2006) po nejvetší Fritillaria assyriaca 1C = 127,4 pg (McLeish et LaCour in Leitch et al. (2007), kterou se však recentne nepodařilo overit (Leitch et al., 2007)), i mezi druhy téhož 11 Velikost genomu a nadmořská výška rodu (např. Anemone parviflora 5,95 pg a Anemone tetrasepala 22,70 pg, (Rothfels et al. in Bennett et Leitch (2005)). Je zpUsoben: • Velkou schopností rostlin jakožto prevážne hermafroditních organismU přestát opakovanou polyploidizaci - např. (Soltis et al., 2007, Parisod et al., 2010, Stebbins, 1985), • tolerancí k hybridizaci, která tak nemusí nutne vést k infertilite, ale naopak k etablování hybridogenních taxonu • v kombinaci s dalšími prvky dynamického genomu jako „nelegitimním" (illegitimate) a „nerovnomerným" (unequal) crossing-overem (Vitte et Panaud, 2003, Devos et al., 2002), proliferací mobilních elementu (Sanmiguel et Bennetzen, 1998, Bennetzen et al., 2005) a s nimi spojenými chromozomálními prestavbami a dvouřetezcovými zlomy (Kirik et al., 2000) a zmenami chro-mozomových poctu. Zminovnané procesy vedou ke zmenám velikosti genomu, přicemž prevažujícím typem zmeřn jsou ty, které vedou k jeho zveřtšení. Vznikla proto teorie o jednosmernosti evoluce v tomto znaku (Hawkins et al., 2008) (ackoliv za typickou byla pro evoluci dlouho považována absence jednoznacřného smeřru a stochasticita. Velikost genomu je jedním nekolika príkladu, které platnost teorií o možném nasmerování evoluce, zpusobeném „mechanistickým" omezením, podpírají, napr. (Luo, 2009, Vigouroux et al., 2003, Ziehe et Demetrius, 2005). 1.2.2 Vnitrodruhová variabilita velikosti genomu Pro jednotlivé druhy byla velikost genomu (resp. pocet chromozomu a jejich velikost) dlouhou dobu považována za konstantu. S postupeným rozvojem metodiky merení obsahu bunecné DNA se objevovalo množství údaju o ruuzných druzích, v nichž byla údajná velikost genomu variabiliní v až neuveritelném rozsahu (např. až o 48 % v pletivech téhož jedince Helianthus annuus (Price, 1998). Množství publikovaných údaju o vnitrodruhové variabilite však bylo falzifikováno po objevech vlivu sekundárních metabolitu a látek fenolické povahy, schopných autofluorescence ci ovlivnení vazby molekul fluorescencního barviva, na merení obsahu DNA - například u Bituminaria bituminosa (Walker et al., 2006) nebo v rodu Coffea (Noirot et al., 2005). Další falzifikace pak vzešly z identifikace metodických pochybení, především pri použití Felugenovy mikrodenzitometrické metody - více se tomuto fenoménu vtenují nekteré publikované prehledy (Šmarda et Bureš, 2010) a (Greilhuber, 2005). 12 Velikost genomu a nadmořská výška Přesto nadále existuje množství druhU, u nichž je vnitrodruhová variabilita nezpochybněná - například Curcuma longa (Leong-ŠkorniCková et al., 2007), Picris hieracioides (Slovak et al., 2009), Dianthus broteri (Balao et al., 2009), Poa pratensis (Murovec et al., 2009), Festuca pallens (Šmarda et Bureš, 2006) a další. Tyto druhy jsou prípady aktuálne probíhající speciace, která muže (např. u P. hieracioides), ale nemusí (napr. Capsicum campylopodium (Moscone et al., 2003)) mít morfologické projevy a být pak taxonomicky významná. 1.2.3 Adaptivita velikosti genomu Výše popsané zmeřny ve velikosti genomu (a prředevším jeho zveřtšování) nejsou vetšinou tak následkem náruustu poctu kódujících („informačne hodnotných") oblastí DNA (ackoliv u polyploidizace nebo zaclenování duplikovaných úseku za vzniku pseudogenu tomu tak samozrejme je). Velký podíl náruustu obsahu DNA u mnoha druhu je repetitivních sekvencí DNA (autonomních a neautonomních transpozonu, MITE, helitronu a dalších), které v genomu koexistují v jakémsi paraziticko-hostitelském systému Brookfield (2005), prinášejícím obema stranám evolucní výhody i nevýhody: • Mobilní element funguje jako endogenní mutagen (vlastní inzercí, zvýšením poctu homologních úseku zpiisobuje rostoucí intenzitu rekombinace). Zvýšená frekvence mutací muže zvyšovat genetickou variabilitu a urychlovat evoluci (Knibbe et al., 2007), podílet na vzniku nových genu a regulacních sekvencí. • Transpozony jako endogenní mutageny však zárovenř mohou narušovat již fungující systémy. • Transpozony prispívají ke vzniku nových strukturních prvku (telomery, cen-tromerické repetice, regulacní sekvence) (Brookfield, 2005). • V neposlední řade puusobí samotným navyšováním množství DNA a jak nepríznivým, tak pravdepodobne i příznivým zpiůsobem. Tento bod bude po-drobneřji rozebírán v následujích odstavcích. Jaké jsou možné fukncní výhody úseku nekódující („sobecké", „nadbytecné", „junk") DNA, nezávisle na potenciálu informace v nich obsažené? • Snižování pravdeřpodobnosti vzniku mutace v kódujících oblastech pod vlivem exogenních mutageniů (Patrushev et Minkevich, 2008). 13 Velikost genomu a nadmořská výška • Obnovení rovnováhy koncentrací genových produktu po celogenomové duplikaci a následných delecích, pomocí tlaku na zvetšení objemu bunky (Veitia et Bottani, 2009). • Role v epigenetických mechanismech regulace transkripce, fungujících na bázi riůzného stupne kondenzace chromatinu (Vinogradov, 2005,1998) Mnohé z techto mechanismu však byly dosud oveřeny pouze u živocichu. A jaké jsou nevýhody plynoucí z přítomnosti nekódující DNA? Samotná přítomnost nekódující DNA je pro organismus jednoznacne záteží, at' už se jedná o energetické náklady na replikaci dlouhého rřeteřzce nebo jeho údržbu prostřednictvím reparacních mechanismu. Podstatné jsou i zmeny casové náročnosti replikace celého genomu. Především u rostlin (a dílem také u živocichu) byly potvrzeny tyto vztahy mezi velikostí genomu a neřkerými fenotypovými prarametry, souhrnneř nazývané jako nukleoskeletární teorie (nebo také nukleoty-pový efekt): • Velikosti genomu je přímo úmerná délka trvání bunecného cyklu (Van't Hof et Sparrow, 1963, Francis et al., 2008) • Velikosti genomu je přímo úmerný objem jádra a objem bunky (Cavalier-Smith (1985) in Cavalier-Smith et Beaton (1999), (Jovtchev et al., 2006) Z techto základních vztahu byly pak odvozeny hypotézy o konkrétních funkcních výhodách a omezeních, platných pro rostliny. Trvání bunecného cyklu urcuje minimální generacní dobu, miůže proto omezovat výskyt velkých genomu v prostrředích s krátkou vegetacřní sezónou, malé genomy jsou v neřm naopak zvýhodneřné. Pro jednoleté rostliny je proto charakteristická nižší velikost genomu: aby zdárne dokoncily svuj vývoj, nemoho si dovolit vydržovat velký genom, na rozdíl od rostlin víceletých (Bennett, 1972). Lze tedy predpokádat extistenci selekcních tlaku na konkrétní velikosti genomu v konkrétních ekologických podmínkách. Etablovanou a obecne prijímanou hypotézou je „hypotéza výlucnosti velkých genomu" („Large genomes constraint hypothesis"), jejíž platnost je dokládána údaji o snížené míře speciace druhu s velkými genomy a jejich omezeným výskytem v extrémních podmínkách (Knight et al., 2005), podpořený velkým podílem druhu, patrících mezi ohrožené, mezi druhy s velkým genomem (Vinogradov, 2003). Je však navrhován i opacřný model, který na základeř studia fylogeneze eukaryot (nikoliv pouze rostlin) a velikosti genomu prředpokládá rychlost evoluce velikosti genomu úmeřrnou této velikosti (Oliver et al., 2007). Druhy s velkým genomem se tak pouze rychleji vzdalují od strředních hodnot a jejich velikosti vytvárřejí typické rozložení, výrazneř vychýlené 14 Velikost genomu a nadmořská výška smerem k malým hodnotám, bez nutnosti pUsobení selekčního tlaku. Zdali existuje rovnováha mezi předpokládanými výhodami a nevýhodami prítomnosti nekódující DNA, nebo je pomyslný jazýček vah významne vychýlen jedním smerem, není dosud spolehlive oveřeno. Pokud však rovnováha není, a velké genomy jsou skutečne obecne vyloučeny z extrémních ekologickch podmínek, bude existovat unimodální distribuce velikostí podél ekologických gradientuu (Knight et al., 2005, Knight et Ackerly, 2002) s maximem v optimálních podmínkách (v podmínkách s nejmenší mírou stresu). Pokud představuje akumulace DNA, resp. její minimum, selekcřní výhodu v konkrétních typech podmínek, bude distribuce velikostí genomu ve studovaném modelu lineárne namstat, resp. klesat, smeřrem k prostrředí s optimálními hodnotami teřchto podmínek. Nebude-li existovat zrřejmý vztah, distribuce bude stochastická. Které ekologické promeřnné mohou být prřícřinou selekce neřkterého typu velikosti rostlinného genomu? Faktory omezující trvání vegetacní sezóny jako teplota a dostupnost srážek v ruzných obmenách jsou první volbou. Přehled výsledku velké cásti prací, zkoumajících tuto závislost, nalezneme u Knighta (2005). Je-li distribuce velikostí genomu podél techto gradientu (obecne) skutecne unimodální, pak není prekvapivá přítomnost obou typu záveru, tedy jak pozitivního, tak negativního vztahu. Zvlášteř, je-li pravdeřpodobné, že hypotéza unimodálnosti distribuce nebyla v daných pracech testována. Vliv techto faktoru miůže být dále zesilován fyzikálními vlastnostmi substrátu. Faktory, k nimž je možno vztáhnout teorii výhodnosti nekódující DNA v omezování vlivu exogenních mutageniů, jsou např. expozice UV záření (analogie vztahu popsaného Sparrowem a Mischkem (1961) a recentne dalšími (Ramallo et al., 2008, Willis et al., 2009)), prítomnost težkých kovu v extrémních substrátech nebo prítomnost polutantu (Vidic et al., 2009). Nadmorřská výška a zemeřpisná délka a šírřka mohou sloužit jako zástupné promenné („proxy variables") za efekty konkrétních promenných. Jejich interpretace a zvlášte pak srovnání více výsledku! z nlzných geografických oblastí rrulže však být komplikovaném, jak již bylo zmíneno na str. 9. Pracem zabývajícím se velikostí genomu podél gradientu nadmorřské výšky je veřnována následující kapitola. Samostatnou problematiku pak tvorří vztahy velikosti genomu, životní formy, životní strategie a adaptací k ekologickým podmínkám (Ohri, 2005), kde je zatím obtížné urcit, co je prícinou a co následkem (Hodgson et al., 2010). Tato otázka se vznáší nad všemi studiemi, které zkoumají adaptabilitu velikosti genomu na rodové úrovni a vyšší. Pro vysvetlování variability uvnitr druhu nejsou však tyto 15 Velikost genomu a nadmorřská výška úvahy primárně důležité, proto zde nebudou rozvíjeny. Proč má smysl studovat adaptivitu velikosti genomu uvnitř variabilních populací jednoho druhu? Rozdíly ve velikosti genomu jsou méne fylogenetický závislé, než je tomu mezi ruznými druhy díky reprodukčním bariérám. Jedinci téhož druhu sdílejí obecne tentýž pool genetických a morfologických znaku a adaptací: proto lze od nich abstrahovat a vysveřtlovat nenáhodnost distribuce pouze velikostí genomu. Je třeba však mít na pameti, že tato situace platí pouze v ideální, panmiktické populaci, kde je zabezpeceno, že rozdíly nejsou zpusobeny genetickým driftem. 1.2.4 Stručné shrnutí dosud publikovaných případových studií Práce Knighta et al. (2005) pnnáší přehled prací, hodnotících vztah vnitrodruhové variability velikosti genomu k nadmořské výšce, publikovaných do r. 2005. Reflektuje však jen z cásti údaje o neverohodnosti nekterých odhadli vnitrodruhové variability: tímto krokem se podrobneji zabývá má bakalářská práce (Bártová, 2007). Zde je v tabulce 1 uvedeno pouze strucné shrnutí nezpochybnených prací a doplneřní o nové poznatky. Tabulka 1: Přehled dosud nezpochybnených prací dokumentujících vztah vnitro-druhové variability velikosti genomu a nadmorřské výšky. Druh 2C [pg] Variabilita Regresní koeficient Publikace Arachis duranen- 2,72 5,7 % -G,72 Temsch et Greil- sis huber (2001) Dactylis glomer- 1G,88 33,G % -G,69 Reeves et al. ata (1998) Lagenaria sicer- G,76 6,5 % G,34 Achigan-Dako aria 'Egusi' et al. (2008) Lagenaria sicer- G,68 7,5 % G,35 Achigan-Dako aria 'Gourd' et al. (2008) Festuca pallens 9,41 12,1 % G,5 Šmarda et Bureš (2006) Zea mays 5,8 36,G % -G,32 (A DNA) Poggio et al. (1998) G63 (B DNA) Poggio et al. (1998) U Z. mays je přítomen další dynamický prvek genomu - akcesorické (B) chromozomy, jejichž nestálý pocet je důkazem opakovaného zacleinování a vydelování se 16 Velikost genomu a nadmorřská výška z hlavního chromozómového komplementu. Akcesorické chromozomy se v meioze nepárují, nerekombinují a mohou být snadno ztraceny (Lia et al., 2007). Z práce Pog-gio et al. (1998) a dalších, studujících podobný materiál a mající podobné hypotézy (Rosato et al., 1998, Lia et al., 2007) nicméne není zrejmý vztah celkové velikosti genomu studovaných druhu k nadmorské výšce, nelze ji proto srovnat s ostatními pracemi. Nejvetší variabilitu velikosti genomu při zachování poctu chromozomu vykazují dle práce Reevese et al. (1998) populace Dactylis glomerata, proto se v mé práci pozornost uprře práveř k nim. 1.3 Cíle práce Hlavním úkolem, který si tato práce vytycila, je popis vztahu vnitrodruhové variability velikosti genomu na gradientu nadmořské výšky a zodpovedet tyto otázky: • Existuje ve zvolených modelových druzích variabilita velikosti genomu? • Je zjištená variabilita vysvetlitelná gradientem nadmořské výšky? • Bude mít vztah velikosti genomu a nadmorské výšky analogický priůbeh na riůzných transektech, v riůzných geografických oblastech, v mzných druzích? Lze na základe studovaných druhu a populací navrhnout obecný model vztahu nadmorřské výšky a vnitrodruhové variability velikosti genomu? • Je možné verifikovat závery práce Reevese et al. týkající se variability velikosti genomu u Dactylis glomerata a jejímu vztahu k nadmorřské výšce? Další otázky volne navazují a doplnují problematiku. • Je zjištená variabilita modelových druhu vysvetlitelná krome nadmořské výšky (a tedy faktory s ní nevyhnutelne spojenými) i jinými faktory prostředí s nadmorřskou výškou lokálneř korelovanými? • Je zjištená variabilita vubec vysvetlitelná nekterým z použitých faktoru prostrředí? Existuje obecná závislost pro všechny studované modelové druhy? • Je odpoved' velikosti genomu studovaného druhu k faktoriím prostředí lineární, unimodální, nebo stochastická? • Je distribuce velikostí genomu v populacích studovaných druhu dukazem pů sobení selekcřního tlaku na malé nebo velké genomy? Jsou malé nebo velké genomy v neřkterých typech prostrředí zvýhodneřné? 17 Velikost genomu a nadmorřská výška 2 Materiál a metodika 2.1 Studovaná území K výberu studovaných území bylo možno přistoupit ze dvou smeru • Na vybraném transektu vyhledat v lokálním druhovém spektru druhy vyskytující se na maximálním možném rozsahu nadmořské výšky. Tímto zpusobem koncipovaná studie probehla v pohoří Wiener Schneeberg (Rakousko). Geomorfologický celek se zdvihá nad rovinatou okolní krajinou (500 m n. m.) do výšky prřes 2000 m n. m. na méneř než 10 km. Prředstavuje tudíž velmi krátký a velmi strmý gradient stanovištních podmínek, navíc je geologicky relativneř homogenní (Geologische Bundesanstalt, 2010) - vápencový masiv. Území je zobrazeno v mape 1. Pudy jsou melké, kamenité, typu rendzina. • Pro vybraný druh, nejlépe s potenciálneř variabilní velikostí genomu, nalézt transekt s maximálním možným rozsahem nadmorské výšky. U Hordeum spontaneum byla v minulosti detekována jak variabilita velikosti genomu (Turpeinen et al., 1999, Doležalová et al., 2009), tak variabilita genetická v odpovedi k faktomm prostredí (Ivandic et al., 2002, Huber et al., 2009), tento druh je modelovým prříkladem pro ekologickými faktory podmíneřnou aktivitu transpozonu (Kalendar et al., 2000). Vyskytuje se na Blízkém východe, mj. v oblasti Har Chermon - jihozápadním výbežku Golanských výšin, ležícím na hranici Izraele, Sýrie a Libanonu. Tento geomorfologický celek je geologicky homogenní (Mor, 1987), dominující horninou jsou vápence, převýšení od 100 po 2000 m n. m. lze dosáhnout na 10 km vzdálenosti, jak je zobrazeno v mape 2. Pudy jsou zde melké, kamenité, typu terra rossa. Pro studii na druhu Dactylis glomerata byl výbeřr studovaného území již dán samotným charakterem práce. Reeves & al. zpracovali tri transekty ve třech jiho-evropských horských celcích (vyobrazeno v mapeř 3): • Transekt na Sicílii je pomerne dlouhý (150 km) a geologicky nehomogenní (Cortese et al., 1960): od vápencových podloží na SZ výbežku ostrova po vulkanity a ultrabazické horniny v jeho JV cřásti. • Transekt ve Francii pochází z oblasti asi 40 x 40 km, situován je v oblasti Languedoc-Roussillon, do neřhož zasahuje vulkanické pohorří Massif Central i vápencové plošiny Les Causses. Geologie je proti pestrá, od vulkanitu po bazalt, vápence, dolomity, pískovce a další (GOěR DE HERVE et al., 2006). K tomuto transektu byla ovšem prřidružena i lokalita z 500 km vzdálených francouzských Alp, ležící v údolí rřeky Drac, kde lze nalézt vápence, dolomity, břidlice i amfibolity. 18 Velikost genomu a nadmorřská výška • Transekt ve Španeisku v oblasti Galicie je rozložen na ploše asi 100 x 100 km. Geologické pomery se zdají být také relativne heterogenní (Instituto Geológico y Minero de Espaňa, 2010). 2.2 Materiál 2.2.1 Deschampsia, Sesleria, Ranunculus Po orientacním pmzkumu druhového složení vegetace úpatí i vrcholové partie Wiener Schneebergu byly zvoleny trři druhy, které se vyskytovaly jak v ne-jvyšší, tak v nejnižší nadmořské výšce: Sesleria caerulea, Ranunculus acris, De-schampsia cespitosa. Na každém stupni výškového transektu byly odebírány v co 1234 O 1733 % O 1199 2040o 2076« 1930 © I lOODn, I Obrázek 1: Lokality odberu na transektu Wiener Schneeberg, Rakousko. Lokality jsou oznaceny nadmorskou výškou, podrobný popis v tabulce 2. Data: NASA SRTM, OpenStreetMap, OpenCycleMap; Projekce: EPSG:900913 (varianta Merca-toru); Zpracování map v aplikacích OpenLayers a Inkscape. Autor: D. Bárta možná nejmenší vzájemné vzdálenosti, aby bylo možno vyloucřit prřípadné vlivy rozdílného mikrostanovišteř. Nicméneř, dokonalé splneřní této podmínky bylo velmi nepravdepodobné, již vzhledem k malému poctu druhů spolecných pro vrchol a pro úpatí. Z každého výškového stupne bylo 4. - 5. srpna 2007 odebráno od každého druhu celkem 12 jedinců. Ve výjimecných případech, pokud se nepodarilo nalézt dostatecný pocet jedincu, bylo odebráno méne. Podrobný popis sberu lze nalézt v tabulce 2. 19 Tabulka 2: Design sběru na transektu Wiener Schneeberg Lokalita Zem. šířka Zem. délka Nadmořská Počet jedinců výška (GPS) Deschampsia Ranunculus Sesleria cespitosa actis caerulea Puchberg am Schneeberg 47,783150 15,898500 630 12 Puchberg am Schneeberg 47,784183 15,898133 640 12 Puchberg am Schneeberg 47,780300 15,897633 660 12 Losenheim 47,788900 15,846417 747 12 Losenheim 47,792600 15,833267 845 1 12 Putzwiese 47,793667 15,815267 1199 12 12 Putzwiese 47,798000 15,818667 1234 12 Kaiserstein 47,785250 15,807450 1733 12 12 12 Ochsenboden 47,763100 15,810883 1940 5 Klosterwappen 47,768833 15,804483 2040 12 Klosterwappen 47,766883 15,804483 2076 12 Velikost genomu a nadmorřská výška Rostliny byly odebírány vcetne cásti kořenového systému a trochy původního substrátu do provizorních transportních nádob (serříznutých tetrapakových krabic) a oznaceny unikátním kódem. U klonálního druhu Sesleria caerulea byly jakožto „jed-nici" odebírány cásti polykormonu vzdálené alespon 0,5 m od sebe. Po transportu do CRbyl rostlinný materiál uchováván po dobu 1 týdne pri pokojové teploteř. Vzhledem k odebrání nedostatecřneř velkého množství substrátu, poškození korřenového systému rostlin prři odbeřru a dalším suboptimálním podmínkám kultivace byl po uplynutí této doby stav materiálu natolik neuspokojivý (zejména jedincu druhu Ranunculus acris), že byla kultivace ukoncena. Bohužel s ní byla ukoncřena i meřrření, jelikož byla opomenuta možnost docřasného skladování menších cřástí cřerstvého rostlinného materiálu v plastových zkumavkách v lednici. 2.2.2 Hordeum spontaneum Podél výškového transektu nejvyššího pohorří Izraele bylo 17. - 20. kveřtna 2009 odebráno celkem 6 populací Hordeum spontaneum, vždy ve vzdálenosti alesponř 1 km a 200 m výšky. Pro možnost srovnání výsledku se studiemi ve vetším geografickém meřrřítku a pro potvrzení platnosti prřípadného vlivu nadmorřské výšky byly odebrány také 4 populace na vzdálených lokalitých, Har Meron a Har Tavor (biblická hora Tábor), vždy jedna prři úpatí a jedna ve vrcholové cřásti, jak je zrřejmo z tabulky 3. I tyto lokality se nacházejí na vápencovém podkladu. Vzhledem k rozdílum ve fenologii populací v nízkých a vysokých nadmořských výškách byla nejvýše položená populace na Har Chermon odebrána až v cřervnu 2009 Dr. Tomášem Pavlícřkem. V každé populaci bylo odebráno 12 fertilních rostlin, vzájemne vzdálených alespon 2 m. Nasbíraný materiál byl uložen k usušení do papírových sácku oznacených unikátním kódem. Vzhledem k nevyjasneným technickým problémům pri zjišťování hodnot nad-morřské výšky z GPS (rozptyl až 100 m na téže lokaliteř, nesouhlasící s rozdíly pozorovanými na míste bežným způsobem), byly tyto nahrazeny údaji z DEM ASTER (NASA, 2009). Údaje o zemepisné délce a šířce nevykazují ve vetšine prípadů významné príznaky chybnosti (malé rozdíly v namierených hodnotách a celkoveř dobrá shoda s pozorováním prři jejich promítnutí na ortofotosnímky v aplikaci GoogleEarth (Google, 2010). V zárí 2009 byly vzorky Hordeum spontaneum vysety do plastových kontejneru! naplneřných smeřsí beřžného zahradnického substrátu a rřícřního písku v pomeřru 1 1, oznacřeny unikátním kódem a kultivovány v experimentálním skleníku na zahradeř rodinného domu v Troubsku v laskavé pécři L. Dittrichové. Jednotlivé vzorky byly rozmísteny do kontejneru vždy po šestici z jedné populace, tyto šestice pak náhodne serazeny. Jejich umístení bylo prubežne náhodne obmenováno, aby 21 Velikost genomu a nadmořská výška Obrázek 2: Lokality odběru Hordeum spontaneum v severovýchodním Izraeli. Podrobný popis lokalit je v tabulce 3. Data: NASA SRTM, OpenStreetMap, OpenCy-cleMap; Projekce: EPSG:900913 (varianta Mercatoru); Zpracování map v aplikacích OpenLayers a Inkscape. Autor: D. Bárta nedošlo k případnému jednoznačnému ovlivnění některé cásti vzorkU zastíněním, vzdáleností od obsluhy, nerovností podkladní plochy a podobne. Z nasbíraných 132 vzorkU se podařilo vypestovat celkem 101 rostlin. Merení probehla 24.-25. a 30. 10.-1. 11. 2009, poté byl rostlinný materiál uchováván v interiérových kultivačních prostorách ÚBZ. Kultivace byla ukoncena v breznu 2010. Žádná z rostlin v prubehu kultivace nevykvetla. 2.2.3 Dactylis glomerata Materiál byl získán ze sbírek Institute of Grassland and Environmental Research - Genetic Ressources Unit (IGER GRU), Aberystwyth, UK (z drívejších publikací známých pod názvem Welsh Plant Breeding station) s laskavým prispením kurátora sbírek I. D. Thomase. Sbírkový materiál je dlouhodobe skladován (5% vlhkost, při teplote 0 °C je materiál životaschopný po dobu 20 let, pri -20 °C je předpokládáno až 100 let) a mul-tiplikován za kontrolovaných podmínek (naprř. zabranřování prřenosu pylu mezi riůznými vzorky, snaha o omezení genetického driftu a selekce ve vzorku nebo kontaminace patogenními organismy), více v kapitole Diskuse. Kódová oznacení do- 22 Velikost genomu a nadmořská výška Tabulka 3: Design sberu Hordeum spontaneum v Izraeli Kód Lokalita Zem. šírka Zem. délka Nadmorská výška (ASTER) PoCet jedinců Ramat ha Golan A Emek ha 35,640222 33,216139 87 8 Chula B Banias 35,675222 33,235333 295 9 D Qala'at 35,718139 33,245472 602 9 Namrud C Qala'at 35,725167 33,252500 803 9 Namrud 2 E Majd al 35,751889 33,257472 970 5 Shams F Majd al 35,754833 33,268000 1236 10 Shams 2 G Har Cher- 35.769382 33,307541 1670 10 mon Har Tavor TB úpatí 35,380028 32,692111 267 9 TT vrchol 35,389778 32,685194 521 12 Har Meron MB úpatí 35,436556 32,999361 677 9 MT vrchol 35,414222 32,991972 1117 11 23 Velikost genomu a nadmořská výška daných vzorku a uvedené souřadnice odberu odpovídala oznacením uvedeným v Reevesove práci (Reeves et al., 1998). Byl k nim priložen i výpis informací z databáze IGER, týkajících se zejména charakteru lokality odberu 4. Bohužel, již z teřchto údaju jsou zrřejmé odlišné primární úcřely sbeřru na jednotlivých lokalitách a rozdílné prístupy jednotlivých sberatelu, jejichž výsledkem soubor dat navzájem srovnatelných pouze dle parametru nadmorské výšky a zemepisných souradnic. Obrázek 3: Lokality puvodu všech vzorku - JZ Evropa, strední Evropa, Izrael. Data: NASA Blue Marble NG (Global MODIS derived image); Projekce: ETRS 1989 LCC. Zpracování map v aplikacích OpenLayers a Inkscape. Autor: D. Bárta Vzorky byly vysety 2. kvetna 2009 do plastových sadbovacu naplnených smeřsí beřžného zahradnického substrátu a rřícřního písku v pomeřru 1:1, oznacřeny unikátním kódem a kultivovány ve skleníku v Troubsku. Z duvodu omezení prřípadného vlivu nehomogennosti kultivacřních podmínek (viz výše) byly vzorky po trojicích usporádány do bloku analogických latinskému ctverci, viz obrázek 7. Rozmístení jednotlivých bloku pak bylo prubežne náhodným zpusobem ob-menováno. K získání požadovaných 12 jedincu na populaci bylo vyseto trojnásobné množství semen. Vzhledem k nízké klícivosti (15 % po 8 dnech u všech rostlin, 24 Velikost genomu a nadmořská výška Obrázek 4: Lokality puvodu vzorku Dactylis glomerata v Galicii, provincii SZ Španel-ska. Lokality jsou oznaceny nadmorskou výškou, podrobný popis v tabulce 4. Data: NASA SRTM, OpenStreetMap, OpenCycleMap; Projekce: EPSG:900913 (varianta Mercatoru); Zpracování map v aplikacích OpenLayers a Inkscape. Autor: D. Bárta v populaci 07 do této doby nevyklícila žádná rostlina.) byly chybející vzorky 11. den dosety vetším množstvím semen. 23. den byla opet doseta populace 07, ani tak se z ní však nepodařilo získat více než 3 jedince. 23. den kultivace uhynul 1 semenácek z populace 04. Kultivaci semenácku provedla L. Dittrichová. První série merení probehla 27.-30. 6. 2009, poté byly rostliny presazeny do rozmernejších kvetinám a umísteny na venkovní kultivacních plochu v areálu ÚBZ v Reckovicích k dlouhodobé kultivaci. Žádná z rostlin v prubehu kultivace v roce 2009 nevykvetla. Nebylo proto možné determinovat prříslušnost rostlin k infraspecifickým taxonomickým kategoriím Dactylis glomerata, které jsou krome ploidní úrovne založeny povetšinou na morfologii komponent kvetenství (Stebbins et Zohary, 1959), (Mizianty, 1990). 25 Tabulka 4: Design sběru Dactylis glomerata na tranesektech ve Španělsku, Itálii a Francii podle (Reeves et al., 1998), data pocházejí z databáze IGER GRU. Kód populace Země původu ID IGER Taxon HabitatLokalita status Datum Lat Lon Nadm. výška 07 Francie BC 5734 Dactylis glomerata L. Wild Chanac 44.467 3.3500 450 12 Francie BC 5442 Dactylis glomerata L. Wild Entrayques, 12 km 30.7.1962 44.5667 2.9833 800 03 Francie BC 5449 Dactylis glomerata L. Wild Viarouges 31.7.1962 44.2500 2.8333 975 18 Francie BC 5545 Dactylis glomerata L. Wild Laguole, 4 km 30.7.1962 44.6833 2.8333 1040 16 Francie BC 5446 Dactylis glomerata L. Wild Aubrac, 1 km W 30.7.1962 44.6000 2.9833 1320 10 Francie BC 5471 Dactylis glomerata L. Wild Orcieres, road end 4.8.1961 44.68333 6.3333 2500 17 Itálie BC 7216 Dactylis glomerata L. Semi-natural Montevago 16.6.1986 37.7167 12.9333 80 02 Itálie BC 7226 Dactylis glomerata L. Wild Monterosso 20.2.1986 37.100 14.7667 520 13 Itálie BC 7227 Dactylis glomerata L. Wild Ferla, 1 km 21.2.1986 37.1333 14.9167 700 19 Itálie BC 7245 Dactylis glomer- Semi- Mistretta, 10 km S 17.7.1986 37.8667 14.3833 1050 ata ssp.hispanica natural Roth(Nyman) 04 Itálie BC 7246 Dactylis glomer- Semi- Polizzi Generosa, 10 18.7.1986 37.8667 14.0167 1430 ata ssp.hispanica natural kmN Roth(Nyman) 06 Španělsko BC 6930 Dactylis glomerata L. Semi-natural Santiso, reservoir 29.7.1977 42.8667 -8.05 350 05 Španělsko BC 7041 Dactylis glomerata Semi- Ribadavia, 7,6 km SW 26.7.1977 42.2500 -8.2167 400 forma galicia natural 01 Španělsko BC 6924 Dactylis glomerata L. Semi-natural Herrida, 11,7 km S 28.7.1977 42.5333 -8.1 550 15 Španělsko BC 7003 Dactylis glomerata L. Wild Linares, 1,1 km S 26.7.1977 42.4667 -8.2667 650 08 Španělsko BC 6922 Dactylis glomerata L. Semi-natural Herrida, 1,8 km E 28.7.1977 42.5333 -8.1 740 09 Španělsko BC 6925 Dactylis glomerata L. Semi-natural Requeiro 28.7.1977 42.4667 -8.2667 920 11 Španělsko BC 6949 Dactylis glomerata L. Wild Cela, Reserva 3.8.1977 42.7333 -7,0167 1000 National de Ancares 14 Španělsko BC 6974 Dactylis glomerata L. Wild Pto. De Outeiro de 6.8.1977 42.0167 -7,9833 1120 Aguas í o Crq (D o 3 o i-i< < C/X 0\ Velikost genomu a nadmořská výška 1430 1050 O O 80 Obrázek 5: Lokality puvodu vzorkU Dactylis glomerata na Sicílii. Lokality jsou označeny nadmořskou výškou, podrobný popis v tabulce 4. Data: NASA SRTM, Open-StreetMap, OpenCycleMap; Projekce: EPSG:900913 (varianta Mercatoru); Zpracování map v aplikacích OpenLayers a Inkscape. Autor: D. Bárta 2.3 Měření velikosti genomu Merení probíhala v Laboratori prutokové cytometrie ÚBZ metodou prutokové cytometrie. Merení relativní velikosti genomu za použití AT selektivního barviva DAPI byla provedena na prutokovém cytometru PA-1 (Ploidy-Analyser 1, Partec) nebo na CyFlow ML (Multi-Laser, Partec), oba vybaveny HBO lampou o výkonu 100 W. Absolutní velikost genomu za použití interkalárního barviva PI byla stanovena na prutokovém cytometru CyFlow ML (Multi-Laser, Partec) nebo CyFlow SL (Single-Laser), u obou typu je zdrojem budicího zárení Laser Cobolt Samba, 100 mW, o vlnové délkce 532 nm. Specifikace použití pro konkrétní druhy a použité standardy jsou uvedeny v tabulce 5. Standardy pocházely bud' z vlastního sberu a následné kultivace (F. rupicola) nebo byly vypestovány z osiva druhu doporucených pro prutokovou cytometrii (Lysák et al., 2000, Doležel et al., 1998), dodaného Laboratoří experimentální botaniky AVCR v Olomouci (P. sativum, Z. mays). Standardy byly vybrány na základeř vhodnosti velikosti genomu (vzájemný 27 Velikost genomu a nadmorřská výška Obrázek 6: Lokality puvodu vzorku Dactylis glomerata na území Francie. Lokality jsou oznacřeny nadmorřskou výškou, podrobný popis v tabulce 4. Data: NASA SRTM, OpenStreetMap, OpenCycleMap; Projekce: EPSG:900913 (varianta Merca-toru); Zpracování map v aplikacích OpenLayers a Inkscape. Autor: D. Bárta pomer standardu a vzorku od 0,3 po 3,0, vyjma pomeru blízkých 0,5 a 2 vzhledem k prřekryvu s histogramy cřástic v G2 fázi), aktuální dostupnosti a dobrých vlastností z hlediska cytometrické metody (prředevším nízkého CV). Pro každý vzorek i standard bylo použito obvykle cca 0,5 cm2 plochy listu. Tato velikost byla prizpiisobena množství DNA v tkáni konkrétního druhu tak, aby histogramy standardu i vzorku obsahovaly srovnatelné množství cřástic (tzn. jevily se stejneř vysoké). U P. sativum byla proto použita výrazneř menší cřást listu (cca 0,15 cm2) pro spolecnou analýzu s cca 1,5 cm2 listu D. glomerata a asi 5 cm nit'ovitého listu F. rupicola na obvyklé množství D. glomerata. Pro meřrření byly používány listové cřepele co nejmladší cřásti rostliny (bylo-li to možné, neplatí však pro P. sativum, kde se osvedcil až 3.-5. list pod nlstovým vrcholem), v nichž je předpokládán minimální obsah sekundárních metabolitu, endopolyploidie stárnoucích pletiv a podobneř. Rovneřž nebyly používány listy jevící známky infestace parazitem (naprř. Puccinia graminis). Pro standardizaci byla používána vždy jedna rostlina, v prřípadeř 28 Velikost genomu a nadmořská výška Obrázek 7: Rozmístení jedincu Dactylis glomerata pri kultivaci, napodobující latinský cřtverec. Vzorky z téže populace jsou vždy v trojicích za sebou. Foto: L. Dittrichová Z. mays dokonce vždy týž list. Prři studiu D. glomerata a H. spontaneum byl materiál urcřený k meřrření odebrán do uzavíratelných plastových zkumavek, zalit vodou, oznacen unikátním kódem a skladován při 5 °C. U ostatních druhu byl odebírán vždy prímo z jednotlivých exempláru. Ackoliv je doporucováno stanovování velikosti genomu jako prumeru ze trí merení (Doležel et al., 1998), z casových, rodinných a jiných duvodu bylo u vetšiny modelových druhu provedeno jen jedno. Behem experimentu s H. spontaneum bylo zvýšení pocřtu opakování kompenzováno nižším pocřtem cřástic zahrnutých do meřrření jednotlivého vzorku (3000 oproti obvyklým 5000), vhodnost tohoto postupu byla orientacne prozkoumána na pocátku merení srovnáním tří vzorku meřených pri ruuzném poctu cástic (data neuvedena). Aby byly omezeny fluktuace nastavení prřístroje, zahrřátí HBO lampy a další vlivy spojené s jeho vypnutím a zapnutím, probíhala meřrření kontinuálneř (prřípadneř se strřídala s jinými experimenty) po dobu uvedenou v tabulce 5. Prřesto byly prřístroje beřhem této doby odstaveny v prřípadeř poruchy, zanesení, ci potřeby „naladení" vzájemné pozice zdroje budícího zárení a 29 Velikost genomu a nadmorřská výška Tabulka 5: Použité standardy a další detalily prubehu meření velikosti genomu pru-tokovou cytometrií. Význam symbolu: * Doporucený standard (Doležel et al., 1998), ** Doporucený standard (Lysák et al., 2000), *** vlastní sber, **** pocet opakování meřrření jednotlivého vzorku Druh FluorescenCní Standard Pocet Pocet Délka barvivo, castic opakovaní merení zařízení **** Deschampsia ce- DAPI, PA-1 Zea mays CE- 5000 1 5 dnu spitosa, Ranun- VVV* culus acris, Ses- leria caerulea Zea mays CE- 5000 1 1 den VVV* Dactylis glom- DAPI, PA-1 Pisum sativum 5000 1-2 4 dny erata 'Ctirad'** DAPI, Cy-Flow Pisum sativum 5000 1-2 4 dny ML 'Ctirad'** 5000 1 4 dny PI, Cy-Flow ML 5000 1 4 dny Hordeum spon- DAPI, PA-1 Festuca rupi- S000 S 1+2 dny taneum cola*** S0 Velikost genomu a nadmorřská výška proudu cřástic. Pokud byla porucha konstatována v nocřních hodinách, byl prřístroj vypnut z duvodu úspory omezené životnosti HBO lampy. Tento druh komplikací se týká především studie D. cespitosa, R. acris a S. caerulea. Pro zajištení neprerušeného provozu byly do meřrření navzdory doporucřenému postupu (Doležel et al., 1998) zapojeny další osoby: Lucie Horová, Jakub Šmerda, Ivana Hralová, Dita Blažková a Jana Procházková. Vzorky byly k analýze zarřazovány v náhodném porřadí. Beřhem soucřasného merení více rostlinných druhu bylo dbáno na jejich náhodné strídání. Pokud bylo meřrření provádeřno ve více opakováních, pak byly vzorky náhodneř vybírány vždy v rámci jedné série. Standard i vzorek byly spolecřneř sekány ostrou žiletkou v plastové Petriho misce v 0,5 ml roztoku Otto-I pufru (0,1M kyselina citronová, 0,5% Tween 20), dle modifikované dvoustupňové Ottovy procedury (Otto, 1990). Poté bylo pridáno dalších 0,5 ml téhož roztoku a smes prefiltrována pres nylonovou filtracní tkaninu o velikosti ok 50 um, umístenou do filtracní nálevky na zpusob filtracního papíru, nebo pomocí pipety prřes cřtverecřek téže tkaniny asi 3 x 3 cm prřímo do zkumavky, nebo přes Cell-Tricks filtr. Takto získaná suspenze byla doplnena 1 ml Otto-II pufru (0,4M Na2HPO4 . 12 H2O) s fluorescencním barvivem DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol) nebo PI (propidium iodid). Vzorek byl pripraven vždy cca 20-40 minut prřed samotným meřrřením a skladován za omezeného prřístupu sveřtla. V prřípadeř stanovování obsahu GC bazí byly vzorky pro meřrření absolutní i relativní velikosti genomu prřipraveny z dvojnásobného množství rostlinného materiálu a dvojnásobného objemu Otto-I pufru, po filtraci rovnomerne rozdeleny do dvou zkumavek, doplneny odpovídajícím fluorescencním barvivem a analyzovány v co nejmenším cřasovém rozestupu. V problematických prřípadech byl vzorek pred pridáním fluorescencního barviva centrifugován 5 min při 1400 RPM a pelet znovu rozpušteřn ve 2 ml Otto-I pufru. Do doby meřrření byly roztoky již obsahující fluorescencní barvivo uchovávány za neprístupu svetla. Relativní velikost genomu byla vypoctena jako pomer: GS = prumer vzorku / prumer standardu. Získané hodnoty byly zaznamenávány do tabulkového procesoru a jsou k nahlédnutí v elektronické příloze vcetne odpovídajících parametru nastavení cytometrick-ého software. Jedná se především o hodnoty „Gain" (tj. hodnoty, urcující pomeru velikosti standardu a vzorku na stupnici detektoru fluorescence, kde je doporucená hodnota menšího z nich 100 a. u., L. Horová in verb.) a rychlosti prutoku cástic (doporucená hodnota 5-10 cástic/s, P. Šmarda in verb.). Pro D. glomerata byla opakování meření provedena na dvou nlzných prístrojích, hodnoty nameřrřené na obou z nich byly následneř porovnány (data a test neuvedeny). Vzhledem ke statisticky významné odlišnosi velikostí vzorku z nlzných prístroju byla použita jen jedna série merení (na přístroji PA-1), pro pet chybejících 31 Velikost genomu a nadmorřská výška exempláru bylo použito meření na ML cytometru a korigováno na prumerný rozdíl mezi obeřma prřístroji. Potvrzení rozdílu ve velikosti genomu jedincu téhož druhu bylo provedeno simultánním merením obou jedincu bez přítomnosti standardu. Tímto zpusobem nelze oveřit rozdíly pod technicky daný limit cca 3,5 % velikosti. Oveření stability obsahu GC bazí bylo provedeno soucřasným nameřrřením a porovnáním absolutní a relativní velikosti genomu cásti vzorku. Pro orientacní stanovení možnosti prítomnosti akcesorických chromozomů u jedincu D. glomerata byla provedena simultánní meřrření vzorku listové cřepele a vzorku korřene, kdy u rostlin bez akcesorických chromozomů není předpokládán rozdíl v hodnotách velikosti genomu obou tkání (Ohta, 1995). 2.4 Další morfologické charakteristiky 2.4.1 Meření velikosti průduchových bunek Pro druh Dactylis glomerata byly sejmuty otisky struktury listové epidermis, jednak pro zjišťování velikosti průduchových bunek, ale i pro možnost pozorování výrazneřjších odchylek ve stavbeř epidermis (naprř. papily, krřemicřitá teřlíska), které by bylo možno využít pri determinaci infraspecifických taxonů ve sterilním stavu. Byly používány vždy listy cřerstveř odebrané z plneř hydratovaných rostlin. Byl odebírán vždy třetí list pod růstovým vrcholem, otisky snímány z jeho strední cásti. Po nanesení bezbarvého laku a jeho zaschnutí byl otisk prřenesen na lepicí pásku a umísteřn na podložní sklícřko, poté byl analyzován prři 600násobném zveřtšení na mikroskopu Olympus SZH10 vybaveném videokamerou Color View II a softwarem Cell F (Olympus). Meřeným parametrem byla délka sverací bunky průduchu (tvar průduchu na ilustracním obrázku 8), která je nezávislá na otevrenosti resp. za-vřenosti průduchové bunky. Zmeřeno bylo celkem 3949 bunek, z abaxiální strany listu 88 rostlin a z adaxiální strany listu 80 rostlin. Každá populace byla zastoupena 2-6 jedinci, populace 05 a 17 deseti jedinci. 2.4.2 Herbárové položky Pro druhy D. cespitosa, R. acris a S. caerulea byly z každého stupne transektu pořízeny herbárřové položky. Pro D. glomerata nebyly položky porřízeny, jelikož jsou rostliny dosud v kulturře. U H. spontaneum nebyla položka porřízena. 2.5 Datové soubory a environmentálni faktory Orientacní hodnoty faktorii prostredí, které byly využity k popisu stupnů výškových transektu, byly získány ze souboru volne dostupných globálních klimat- 32 Velikost genomu a nadmořská výška Obrázek 8: Příklad meření délky svěrací bunky prUduchu Dactylis glomerata. Krome prUduchU jsou na obrázku patrné i epidermální bunky s ostnitými výrUstky, které Ciní listy drsnými. Barva není skuteCná. ických dat WORLDCLIM 1.4 (Hijmans et al., 2005). Pro každou lokalitu tak byly získány prostřednictvím aplikace GRASS GIS (GRASS Development Team, 19992007) hodnoty priůmerných, maximálních a minimálních teplot pro každý mesíc v roce, mesícní úhrn srážek a z nich odvozených 19 tzv. bioklimatických promen-ných 6. Všechny hodnoty, s nimiž bylo podtáno, jsou uvedeny v elektronické příloze v datových souborech pro R. Údaje o nadmorské výšce pro lokality H. spontaneum a D. glomerata byly získány z DEM ASTER (NASA, 2009), pro druh H. spontaneum, kde jsou známy přesném lokalizace, byl z DEM použit i sklon svahu a jeho orientace. Z techto údaju byl vypocten index tepelného požitku a ozárení, dle práce McCune & Keon (McCune et Keon, 2002) pomocí šablony vytvorené M. Chytrým (Chytrý, 2010). 2.6 Statistická analýza Základní zpracovávání dat bylo provádeřno v beřžných tabulkových procesorech (MS Excel, OpenOffice Calc). Normalita rozložení dat byla overována Shapiro-Wilk testem. Jednotlivé populace byly vzájemne porovnávány analýzou homogenity rozptylu (Fligner-Kileen test) a poté odpovídající analýzou rozptylu (obecný lineární model, tj. ANOVA, ANCOVA). V prřípadeř nenormálního rozložení dat byl proveden pokus o transformaci dat (logaritimickou, odmocninovou, mocninnou), 33 Velikost genomu a nadmorřská výška Tabulka 6: Bioklimatické promeřnné modelu WORLDCLIM Kód promeřnné Charakteristika BIO1 Prumerná rocní teplota BIO2 Teplotní promenlivost - Pmmer rozdílu maximální a min- imální teploty BIO3 Teplotní promenlivost - Prumerná rocní teplota I prumer rozdílu minimální a maximální mesícní teploty („isothermal- ity") BIO4 Teplotní promeřnlivost - Smeřrodatná odchylka meřsícřních teplot („temperature seasonality") BIO5 Max teplota nejteplejšího meřsce BIO6 Min teplota nejchladneřjšího meřsíce BIO7 Rocřní rozsah teplot (kontinentalita) BIO8 Prumerná teplota nejvlhcího ctvrtletí BIO9 Prumerná teplota nejsuššího ctvrtletí BIO10 Prumerná teplota nejteplešího ctvrtletí BIO11 Prumerná teplota nejchaldnejšího ctvrtletí BIO12 Rocřní úhrn srážek BIO13 Úhrn srážek v nejvlhcřím meřsíci BIO14 Úhrn srážek v nejsušším meřsíci BIO15 Srážková promenlivost - CV měsícních úhrnu srážek („precip- itation seasonality") BIO16 Úhrn srážek v nejvlhcřím cřtvrtletí BIO17 Úhrn srážek v nejsušším cřtvrtletí BIO18 Úhrn srážek v nejteplejším cřtvrtletí BIO19 Úhrn srážek v nejchladneřjším cřtvrtletí namísto regrese použit neparametrický Spearmanuv korelacní koeficient, pro vzájemné porovnání skupin neparametrická Kruskal-Wallis ANOVA. V prípade statisticky významných rozdílu v analýze variance byly populace dále porovnány post-hoc Tukey HSD testem, neparametrickým Wilcoxonovým Rank Sum testem s Holmovou korekcí, nebo analýzou kontrastu v R. Pokud se v populacích vyskytovalo více ploidních úrovní (D. glomerata), byly obeř analyzovány separátneř. Byla-li data meřrřena ve více opakováních, byla tato opakování navzájem porovnána pomocí párového t-testu s Holmovou korekcí, prípadne Pearsonovým korelačním koeficientem. Každá populace byla charakterizována priimernou relativní velikostí genomu nebo mediánem relativní velikosti genomu (GS). Pro testování platnosti „Large genomes constraint hypothesis" byla smerodatná odchylka každé populace (SD) a rozptylem (VAR). Rozložení genomu! v populaci bylo popsáno indexem IVR = index 34 Velikost genomu a nadmořská výška vyšikmení rozložení, vypocteným jako IV R = (median — min)/(max — median) Hodnota > 1 znací rozložení dat vyšikmené více k velkým hodnotám, hodnota < 1 k malým(rozložení velikostí genomu v populacích jsou vizualizována v příloze ,,, .) Podobnný význam má prumer trí nejvetších, resp. trí nejmenších genomu v populaci (oznacovaný jako „LARGE", resp. „SMALL", velkým zjednodušením principu kvantilové regrese). Vztah velikosti genomu populace k nadmorřské výšce byl zkoumán pomocí obecného lineárního modelu. V nem byl uvažován jak lineární, tak kvadratický prubeh nezávislé promenné, z duvodu testování teorie možné unimodální odpovedi velikosti genomub k promenným prostředí (Knight et al., 2005). Krome nadmorské výšky byly testovány i faktory prostředí získané z modelu Worldcim, mnoho z nich je však z podstaty veci korelovaných. Vzhledem k pomerne malým poctum populací u všech druhu je nebylo možno z analýzy vyrazovat na základe korelací parametru modelu ve vícenásobné regresi (pocet parametru muže dosahovat přibližne třetiny poctu pozorování (Crawley et al. in Pekár et Brabec (2009), nicméneř pocřet dostupných promeřnných zde byl mnohem vyšší). Redundantní promeřnné postrádají smysl pro interpretaci. Soubor dostupných promeřnných prostrředí byl proto zjednodušen analýzou hlavních komponent (PCA - v R implementovanou funkcí prcomp() (Venables et Ripley, 2002)). Tři promeřnné, které meřly nejteřsneřjší vztah k první, druhé a trřetí komponenteř (a byly tudíž navzájem nekorelované), byly vybrány jako zástupné promeřnné za celý gradient ekologických podmínek. Byly testovány jak hlavní efekty vybraných promeřnných, tak jejich vícenásobné interakce v lineárním prubehu. V kvadratickém prubehu byly zarazeny pouze hlavní efekty. Statisticky nevýznamné efekty a interakce byly odebírány dle pravidla marginality. Veřrohodnost výsledného modelu byla oveřrřována vizuální inspekcí diagnostických grafu (distribuce reziduí, závislost rezidí na strední hodnote, závislost rozptylu na strřední hodnoteř a Cookova vzdálenost hodnotící vlivnost jednotlivých pozorování). Promeřnné, které vysveřtlovaly rozdíly ve velikosti genomu byly použity jako kovariáty v analýze kovariance velikosti genomu a nadmorřské výšky. V analýze velikosti genomu Hordeum spontaneum byly pro výpocet indexu tepelného požitku a ozárřenosti jednotlivé populace rozdeřleny do sub-populací podle podobnosti v expozici stanovište. Tyto subpopulace se vyznacují riizným poctem vzorku (1 -10), pro výpocet byly použity jen ty, které obsahovaly alespon tři jedince. Zpiůsob rozrazení jednotlivých exempláru do subpopulací popisuje tabulka 15 v prříloze. Prostorová autokorelace velikosti genomu byla testována Mantel testem. Geografická vzdálenost byla vypoctena jako přepona pravoúhlého trojúhelníku, se zanedbáním zakrřivení geoidu a rozdílu mezi vzdálenostmi odpovídajícími 35 Velikost genomu a nadmořská výška jednomu stupni zemeřpisné šírřky a jednomu stupni zemeřpisné délky. Za statisticky pmkazné byly považovány všechny výsledky na hladine významnosti a=0.05. Výpocty všech statistik a grafické výstupy byly provedeny v prostředí R (R Developement Core team, 2010) nebo v aplikaci Statistica CZ 7.0-9.0 (StatSoft, 2010). Vstupní data, formule a výstupní informace prostredí R jsou uvedeny v elektronické prříloze, ve stejném porřadí, v jakém jsou zminřovány v textu práce. 36 Velikost genomu a nadmorřská výška 3 Výsledky 3.1 Deschampsia, Ranunculus, Sesleria Výsledky měření velikosti genomu druhu z transektu Wiener Schneeberg jsou shrnuty v tabulce 7. Prumerný CV všech vzorku byl 2,11, prumerný CV všech standardu byl 2,23. Variabilita jednotlivých populací je pak zobrazena v grafu 9. Acko-liv se nameřené relativní velikosti genomu jedinciů uvnitř druhu lišily až o 7 %, simultánní cytometrickou analýzou jedincu rozdílné velikosti se nepodarilo tento rozdíl potvrdit (CV simultánních meření: 1,5 - 2,3). Data vetšinou nemají normální rozložení (Shapiro-Wilk test, R. acris: p = 0,02, S. caerulea: p = 0,01, D. cespitosa: p = 0,37). Pro analýzu potenciálních rozdílu velikosti genomu mezi populacemi byl proto použit neparametrický Kruskal-Wallis test, jehož výsledek ukazuje, že mezi populacemi jednotlivých druhu není statisticky významný rozdíl: R. acris: x24 = 8,6886, p = 0,07, S. caerulea: x24= 7,0167, p = 0,13, D. cespitosa: x24 = 7,1036, p = 0,14. Tabulka 7: Prumerná relativní velikost genomu druhu v populacích studovaných na transektu Wiener Schneeberg. Nadmořská Relativní velikost genomu výška [m n. m.] Deschampsia cespi-tosa Ranunculus acris Sesleria caerulea 630 1,8497 640 1,7413 660 2,2724 747 1,7353 845 1,8410 2,2682 1199 1,8450 2,2672 1234 1,7193 1733 1,8147 2,2423 1,7290 1940 2,2693 2040 1,7402 2076 1,8214 PřUmeř: 1,834356 2,263880 1,733012 37 Velikost genomu a nadmořská výška Deschampsia cespitosa Seslería caerulea 8 o —i— -1-1-1-1-r~ 640 747 1234 1733 2076 Nadmořská výška Nadmořská výška Ranunculus acrís O (0 — g 00 E _ o c ^ 8 ^ o o o *°cgo ° o o —I-1-1-1-^ 0.740 0.745 0.750 0.755 1. Obrázek 10: Srovnání sérií opakování měření Hordeum spontaneum. Jak soubor jednotlivých měření (Shapiro-Wilk test, W = 0,9898, p = 0,6419), tak jednotlivé populace (podrobně v příloze týkající se R), tak soubor průměrů populací mají normální rozdělení (Shapiro-Wilk test, W = 0,9817, p = 0,1760). 39 Velikost genomu a nadmořská výška Populace vykazují homogenitu variance v neparametrickém Flinger testu (Median-X2io=12,5644, p = 0,2491). Rozdíly ve velikosti genomu mezi populacemi byly testovány parametrickou analýzou variance (ANCOVA, F10= 3,9362, p < 0,001), kde byl prokázán statisticky významný rozdíl. Tukey HSD testem byly na hladineř významnosti a = 0,05 prokázány rozdíly mezi populacemi TT a A, G a B, TT a C, MB a G, TT a G. Analýza kontrastu poukázala na statisticky významný rozdíl velikosti genomu rostlin z transektu na Har Chermon oproti rostlinám z ostatního území (p = 0,009), nikoli však na rozdíl mezi Har Tabor a ostatními a Har Meron a ostatními.1. Velikosti genomu v popualcích H. spontaneum nejsou prostoroveř autokorelované (Mantel test, Spearmanuv korelacní koeficient, p = 0,26927 pro 10 000 permutací.) Vztah prumerné velikosti genomu populací Hordeum spontaneum a nadmořské výšky není signifikantní ani v lineární, ani kvadratické podobte. Toto platí jak pro celý datový soubor, tak pro samotný transekt Har Chermon, Har Tavor a Har Meron. Nebyl nalezen žádný významný vztah nadmorřské výšky s rozptylem, směrodatnou odchylkou, ani vyšikmeností rozdelení. Pouze vztah průmerné velikosti tří nejvetších genomu v populaci je blízko hranice signifikance. Skóre promenných v PCA uvádí tabulka 9, první tři osy vycerpaly 87,3 %, 6,43 % a 3,07 % variability. Gradient podmínek nejlépe popisuje prumerná rocní teplota (bio1, a s ní korelované další charakteristiky teploty, srážek), rocřní rozsah teplot (bio7) a srážky v meřsíci zárří (prec9). Promeřnné bio1 a bio7 a mají normální rozdeřlení (Shapiro-Wilk test, bio7: W = 0,8944, p = 0,1578, bio1: W = 0,9523, p = 0,6739), promeřnná prec9 nikoliv. Žádná z nich nemá k velikosti genomu signifikantní vztah. Signifikatní je vztah indexu vyšikmenosti rozdelení k rozsahu teplot (Pearsonuv korelacní koeficient, r = 0,7764006, N = 11, t = 3,6957, df = 9, p = 0,004953). Nadmorřská výška je také velmi silneř korelována s první osou. 1Více typů kontrastů nebyl duvod testovat, ve výpisu sumarizacní tabulky v pnloze jsou však ješte programem náhodne generované kontrasty (4-10), nemající význam pro interpretaci, nicméne jsou statisticky významné 40 Tabulka 8: Průměrná velikost genomu v populacích Hordeum spontaneum. LARGE a SMALL odkazují na průměrnou velikost tří největších, resp. tří nejmenších genomů na lokalitě. IQR - rozdíl hodnoty na 25% a 75% kvantilu. MAD - medián rozdílů od mediánu, IVR - index vyšikmení rozložení kapitola 2.6, SD - směrodatná odchylka. Populace Kód Nadm. výška Rel. vel. genomu LARGE SMALL Rozptyl IQR MAD IVR SD Emek ha A 87 0,743585 0,749356 0,738502 0,000032 0,007017 0,006268 1,024808 0,005615 Chula Har Tavor TB 267 0,747400 0,751020 0,743194 0,000012 0,002702 0,002503 1,312198 0,003417 Banias B 295 0,748358 0,750154 0,746848 0,000002 0,002359 0,001995 0,589964 0,001528 Har Tavor TT 521 0,749377 0,752126 0,747070 0,000007 0,002031 0,001521 0,510393 0,002575 Qala'at D 602 0,747580 0,750881 0,744243 0,000009 0,004541 0,003677 0,771644 0,003062 Namrud Har MB 677 0,747971 0,753108 0,743681 0,000015 0,004729 0,003905 0,515402 0,003848 Meron Qala'at C 803 0,743916 0,746527 0,741246 0,000007 0,002903 0,002192 1,141300 0,002622 Namrud 2 Maj d al E 970 0,745521 0,746636 0,744370 0,000004 0,001435 0,001196 0,759459 0,001977 Shams Har MT 1117 0,746388 0,748584 0,744857 0,000003 0,002953 0,000845 0,135941 0,001790 Meron Maj d al F 1236 0,746976 0,749863 0,744407 0,000006 0,003585 0,002761 0,792823 0,002349 Shams 2 Har Cher- G 1670 0,743544 0,746452 0,740276 0,000007 0,004733 0,003860 1,273268 0,002604 mon Velikost genomu a nadmorřská výška Tabulka 9: Skóre promenných prostředí relevantních ke všem populacím Hordeum spontaneum v PCA. „prec" znací úhrn srážek v príslušném mesíci, „tmean" priimernou teplotu, „tmax" resp. „tmin" maximální, resp. minimální teplotu v prříslušném meřsíci, „bio" odkazuje k bioklimatickým promeřnným 6, „lat" je zemeřpisná šírřka, „lon" zemeřpisná délka. Proměnné Skóre PCI Proměnné Skóre PC2 Proměnné Skóre PC3 87 % 6,4 % 3,0 % bio2 -0.115131117 bio3 -0.1020457362 bio15 -0.1027371710 bio3 -0.125974833 prec4 -0.1202748336 bio17 -0.2503221457 tmin11 -0.127590649 prec5 -0.1718358509 prec6 -0.2503221457 tmin3 -0.128334599 bio17 -0.2004299339 bio16 0.1013126920 bio5 -0.128407721 prec6 -0.2004299339 prec2 0.1092551170 tmax8 -0.128407721 bio2 -0.2196963387 bio12 0.1113642315 tmin2 -0.128890024 bio18 -0.2894858692 bio19 0.1306758768 tmin10 -0.128946848 lat -0.3677935155 prec11 0.1398454931 tmin4 -0.129136364 lon -0.4092085748 bio13 0.1685564828 tmin12 -0.129286456 bio7 -0.4708058800 prec1 0.1685564828 tmax9 -0.129344184 bio4 0.1201125333 lat 0.1702415099 tmax3 -0.129379864 prec12 0.1300552341 prec4 0.1723545703 tmax7 -0.129525710 prec11 0.1763933003 prec10 0.2547240940 tmin7 -0.129557749 bio15 0.2504951977 bio18 0.3357986216 tmean3 -0.129560582 prec9 0.6423141666 bio6 -0.129625553 tmin1 -0.129625553 tmin8 -0.129625651 tmax6 -0.129669972 tmin9 -0.129707045 tmin5 -0.129735369 tmax5 -0.129928063 tmean5 -0.129936889 tmean4 -0.129937583 tmean8 -0.129983881 tmin6 -0.130020890 tmean7 -0.130086021 tmax4 -0.130087127 tmean9 -0.130125522 tmean11 -0.130140650 tmax12 -0.130170363 tmax2 -0.130171105 bio10 -0.130204453 tmax10 -0.130247987 tmax1 -0.130260392 tmean6 -0.130307799 bio9 -0.130358615 tmax11 -0.130382197 bio5 -0.130392255 Tabulka pokracřuje na následující straneř. 42 Velikost genomu a nadmořská výška Proměnné Skóre PC1 Proměnné tmeanlO -0.130455241 bio8 -0.130499203 bioll -0.130499203 tmean12 -0.130506277 tmeanl -0.130519518 biol -0.130522782 bio4 0.102644286 precll 0.117511177 preclO 0.119165927 precl2 0.120665609 prec4 0.120823841 prec5 0.121239477 biol3 0.121793372 precl 0.121793372 biol9 0.122621773 biol6 0.124555829 prec2 0.126919613 biol2 0.127104706 alt 0.128940054 prec3 0.129298978 Skóre PC2 Proměnné Skóre PC3 Pro testování vlivu ozárřenosti a tepelného požitku byly populace prřerozdeřleny do subpopulací, homogenních vzhledem k expozici, pro které byly získány nové hodnoty klimatických promenných. Skóre na osách PCA techto promenných jsou podobná jako v prředchozím prřípadeř, pouze hodnoty jsou numericky jiné. První osa vysvetlila 82 % variability, je korelována s prumernou rocní teplotou. Na druhé a trřetí ose jsou významné promeřnné ozárřenost (RAD) a kontinentalita (bio7). Promenné GS, bio1 a RAD mají normální rozdelení. (Shapiro-Wilk test: GS: W = 0,9443, p = 0,2424, RAD: W = 0,9527, p = 0,3561, bio1: W = 0,9259, p = 0,1008), promenná bio 7 nemá ani po transformaci (bio7: W = 0,8373, p = 0,002040). Do lineárního modelu lze proto použít jen první dveř, nicméneř žádná z nich nemá k velikosti genomu signifikantní vztah. Index vyšikmenosti, smerodatná odchylka a rozptyl byly pocřítány pouze pro subpopulace cřítající alesponř trři jedince. Index vyšikmenosti rozdelení negativne koreluje s ozářeností (Pearsonuv korelacní koeficient: r = -0,6310252, R = 0,397, df = 12, p = 0,01552, podobná hodnota pro druhou mocninu ozárenosti), prumer trí nejvetších genomu subpopulace (LARGE) pozitive koreluje s prumernou rocní teplotou (Pearsonuv korelacní koeficient, r = 0,634624, R = 0,39, t = 2,8446, df = 12, p = 0,01477, podobná hodnota pro druhou mocninu vysveřtlující promeřnné). Po použití Bonferroniho korekce by ovšem všechny hodnoty p byly na hranici signifikance. Bio7 nevysvetluje neparametricky žádnou promennou. V analýze kovariance s promennou bio1 jakožto kovariátou je významnost nadmořské výšky na hranici signifikance (p = 0.07). 43 Velikost genomu a nadmorřská výška 3.3 Dactylis glomerata Pnumerný CV standardů při meření relativní velikosti genomu D. glomerata je uveden v tabulce 10. Variabilita velikosti genomu v populacích je zobrazena v grafu 15. Mediány velikostí genomu jsou uvedeny v tabulce 11, pocházejí z meřrření se standardem P. sativum. Jedinci z populace 05 vykazovali prřibližneř polovicřní obsah DNA oproti ostatním, jedná se tedy zrřejmeř o diploidní typy. Ve veřtšineř zobrazení a dalších analýz jsou uvažovány už pouze tetraploidní typy. V populaci 07 se též vyskytoval 1 exemplárř s polovicřním obsahem DNA, do mediánu v tabulce není zahrnut. Celá populace 07 byla vyrazena z vetšiny analýz pro malý pocet jedincu. Rozdíl ve velikosti genomu nejmenšího a nejveřtšího jedince byl potvrzen simultánním merením obou vzorku, viz obrázky 12 a 13. Rozdíly mezi hodnotami ze simultánních merení a z jednotlivých meření jsou korelované (Pearsonuv korelacní koeficient, df = 7, N = 10, r = 0,928, R = 0,861, p = 0,0003), což svedcí o velké presnosti jednotlivých meřrření - viz graf 14. Simultánní meřrření tkáneř listu a tkáneř korřene u 4 vzorku s nejmenší a nejvetší velikostí genomu nepotvrdilo rozdíl v obsahu DNA obou tkání. Celý soubor merení jednotlivých vzorku nemá normální rozdelení (Shapiro-Wilk test, W = 0,9776, p = 0,0105), ješteř méneř po transformaci (naprř. logaritmické: Shapiro-Wilk test, W=0,9752, p=0,006), v populacích má homogenní rozptyl (Flinger-Killeen test, median x216 = 16,3789, p = 0,4268). Soubor byl analyzován netransformovaný, neparametrickou analýzou variance, která potvrdila statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými populacemi (Kruskal-Wallis test, X216=107,5781, p < 0,0001), specifikace konkrétních odlišných populací byla provedena neparametrickým Wilcoxonovým testem s Holmovou korekcí. Z tabulky 16, uvedené v prříloze, je patrné, že zcela odlišná je pouze populace 17, ostatní tvorí víceméne fragmenty kontinua. Detailní výsledky testu vcetne jednotlivých pravdepodobnostních koeficientů jsou uvedeny v elektronické príloze. Statisticky významný rozdíl byl též prokázán mezi soubory populací z jednotlivých zemí (Kruskal-Wallis test, x22 = 53,1509, p < 0,0001), dle Wilcoxonova testu se od zbylých oblastí odlišují populace ze Španeřlska. (Francie - Itálie: p = 0,2, Itálie - Španelsko: p < 0,0001, Francie - Španelsko: p < 0,0001). Velká geografická vzdálenost je též mezi populací 10 a ostatními populacemi ve Francii, vzájemné srovnání populací celého francouzského transektu potvrdilo její statisticky významnou odlišnost (ANOVA, F4 = 20,201, p < 0,0001, Tukey HSD test; data mají normální rozdelení). Prostorovou autokorelaci dat naznacuje i Mantel test (Spearmanuv korelacní koeficient, p = 0,049 pro 10 000 permutací) 44 Velikost genomu a nadmořská výška Tabulka 10: Koeficienty variance měrení Dactylis glomerata Metoda, standard CV standard vzorek DAPI, P. sativum 1,94 1,92 DAPI, F. rupicola 1,56 1,48 PI, F. rupicola 3,47 3,42 Za úcřelem vyloucření možnosti, že je variabilita velikosti genomu jednotlivých exempláru spojena s variabilitou obsahu GC bazí, a je tudíž artefaktem mierení AT selektivním barvivem, bylo v září 2009 provedeno meření 42 vzorku (náhodne vybraných naprřícř populacemi). Byla srovnána absolutní velikosti genomu získaná z meřrření s neselektivním barvivem PI s relativní velikostí genomu, získané se selektivním barvivem DAPI. Použitým standardem byla Festuca rupicola. Tento podsoubor již má normální rozdeřlení velikostí genomu (hodnoty uvedeny v prříloze), proto byly tetraploidní vzorky obou sérií navzájem porovnány Pearsovoným korelacním koeficientem (r = 0,9248, R = 0,85542, N=38, df = 36, p < 0,0001), který potvrdil velmi silný vztah obou velicin - absolutní a relativní velikosti genomu. Srovnání série meřené s DAPI s puvodní sérií dat z cervna 2009, meřené se standardem Pisum sativum, potvrdilo verohodnost výsledku (Pearsonuv korelacní koeficient, r = 0,916168, R = 0,8393, N = 38, df = 36, p < 0,0001). Diploidní jednici se statisticky liší v obsahu GC bazí od tetraploidních jedincu (T-test, t = 3,2907, df = 3,707, p = 0,03379, prumer diploidu: 43,92250, prumer tetraploidu: 43,59963). 3.3.1 Velikost genomu a nadmořská výška Z dalších analýz jsou vynaty populace 05 („forma galicia") a 07 (pro malý pocet tetraploidních jedincu) a také populace 17, která se krome výrazne nižší velikosti genomu liší i habituálne (pro jemné, témer nit'ovité listy), a u níž je tudíž nejvetší pravdeřpodobnost odlišného taxonomického statutu vzhledem k ostatním populacím. Populace 04 a 19, údajne náležející k subsp. hispanica, se od zbylých neodlišují ani habituelneř, ani velikostí genomu. Datový soubor mediánu velikostí genomu všech populací (vyjma 05, 07 a 17) má normální rozdeřlení (Shapiro-Wilk test, W = 0,9257, p = 0,20840). Nad- morřský výška celého souboru má po logaritmické transformaci taktéž normální rozdelení. Další charakteristiky populací (SD, IVR, LARGE, SMALL) jsou použity netransformované, rozptyl (VAR) je logaritmicky transformovaný. V podsouborech geografických oblastí bylo ohledne transformací postupováno analogicky, např. ve 45 Velikost genomu a nadmořská výška Tabulka 11: Medián velikosti genomu v populacích Dactylis glomerata. I - transekt Itálie, F - transekt Francie, S - transekt Španeisko. Median GS - medián velikostí genomu, Reeves GS - prumerná absolutní velikost genomu dle Reeves et al., SD - smerodatná odchylka populace, SD Reeves - smerodatná odchylka populace dle Reeves et al._ Populace Nadm. Oblast Median Reeves SD Reeves výška [m GS [a. u.] GS [pg] SD n. m.] 17 80 I 0,714047 4,99 0,003246 0,07 06 350 S 0,761065 5,39 0,015287 0,04 05 400 S 0,391563 5,46 0,002700 0,04 07 450 F 0,756725 5,35 0,004833 0,1 02 520 I 0,740951 4,74 0,006984 0,07 01 550 S 0,766842 5,6 0,007893 0,04 15 650 S 0,762903 5,27 0,009067 0,03 13 700 I 0,743213 5 0,010632 0,07 08 740 S 0,766832 5,32 0,014072 0,05 12 800 F 0,747825 5,03 0,012606 0,08 09 920 S 0,767136 5,46 0,004395 0,03 03 975 F 0,746419 5,1 0,009377 0,1 11 1000 S 0,749364 4,98 0,010299 0,03 18 1040 F 0,735393 4,7 0,007399 0,01 19 1050 I 0,753826 4,51 0,007595 0,06 14 1120 S 0,757062 4,88 0,015183 0,02 16 1320 F 0,731319 4,56 0,006638 0,11 04 1430 I 0,742526 4,49 0,008597 0,05 10 2500 F 0,761967 4,37 0,006521 0,2 46 Velikost genomu a nadmořská výška španělském a italském transektu mohlo být použito netransformované nadmořské výšky. Vztah velikosti genomu k nadmořské výšce není statisticky prUkazný ani napríc všemi populacemi, ani uvnitr jednotlivých oblastí. Pouze na transektu Itálie prUkazne koreluje rozptyl relativních velikostí genomu s druhou mocninou nadmořské výšky (Pearsonuv korelační koeficient, r=0.960, R=0.9216, p=0,038) a na transektu Francie neparametricky smerodatná odchylka s druhou mocninou transformované nadmořské výšky (Spearmanuv korelacní koeficient,p = -0,70, p = 0,017). Ostatní korelacní koeficienty a hodnoty pravdepodobnosti jsou uvedeny v prříloze). 3.3.2 Velikost genomu a další faktory prostředí Promenné prostredí, získané z modelu WORLDCLIM byly standardizovány, centrovány a srovnány v PCA. První 3 osy vycerpaly 87 % variability. S PC 1 koreluje nejsilneji prumerná ríjnová teplota (tmean10), s PC 2 rocní úhrn srážek (bio12), s PC 3 prumerná teplota nejvlhcího ctvrtletí (bio8), pro výpocet však byl poslední faktor nahrazen druhým v pořadí - prumerným mesícním rozsahem denních teplot (bio2), jelikož bio8 byl slabe korelovaný s faktorem bio12 na PC 2 (a zpiůsoboval potíže s ko-linearitou vysvetlujících promenných lineárního modelu). Nadmořská výška koreluje s rříjnovou teplotou na první ose. Další promeřnné, korelované s teřmito osami a procenta variability, vycřerpaná jednotlivými osami, uvádí tabulka 12. Tabulka 12: Skóre promenných prostredí relevantních ke všem populacím Dactylis glomerata v PCA.„prec" znací úhrn srážek v príslušném mesíci, „tmean" pnlmernou teplotu, „tmax" resp. „tmin" maximální, resp. minimální teplotu v príslušném mesíci, „bio" odkazuje k bioklimatickým promenným 6, „lat" je zemepisná šírka, „lon" zemepisná délka. Proměnné Skóre PC1 Promenné Skóre PC2 Promenné Skóre PC3 62% 25,5 % 8,7 % tmeanlO 0.150623462 bio12 0.233831423 bio9 0.249751181 bio1 0.150605256 prec4 0.232497579 bio15 0.184218267 tmean11 0.150196796 prec3 0.221723837 prec1 0.152462619 tmin4 0.149204334 prec12 0.220717568 prec10 0.150354805 tmin12 0.149060711 bio16 0.217988390 prec11 0.146815693 tmean12 0.148638374 bio13 0.216149667 prec2 0.132943165 tmin5 0.148618125 bio19 0.216146748 bio19 0.123684974 tmin10 0.148596692 prec2 0.213040101 alt 0.120530512 bio6 0.148108029 prec11 0.212131136 bio8 -0.298274977 tmin1 0.148016285 prec1 0.202663120 bio2 -0.267967277 tmin11 0.147836062 bio3 0.192141011 tmax4 -0.222609636 Tabulka pokracuje na následující strane. 47 Velikost genomu a nadmorřská výška Proměnné Skóre PC1 Proměnné Skóre PC2 Promenné Skóre PC3 tmean9 0.147835612 prec5 0.190412046 bio3 -0.210678411 tmax11 0.147596490 prec10 0.182375619 prec8 -0.210421275 tmean5 0.146064458 prec9 0.160682121 tmax5 -0.205102054 tmin9 0.144820881 lat 0.141346447 bio18 -0.194879060 bio11 0.144658260 prec6 0.136863638 lat -0.187776897 tmean8 0.144132356 tmax3 0.128793848 prec7 -0.177300130 tmin2 0.144042736 lon -0.226840692 tmax3 -0.167951693 tmean1 0.143862404 bio4 -0.210893629 bio14 -0.164456188 tmin6 0.143004419 bio7 -0.117480094 tmax6 -0.159743204 tmax12 0.142893922 bio8 -0.096561183 prec6 -0.149106275 bio10 0.142702678 bio17 -0.135816037 tmean6 0.141982932 tmax9 -0.135058483 tmax10 0.141697956 tmax10 -0.128750830 tmin3 0.140598382 tmax7 -0.127342751 tmin8 0.140537713 prec9 -0.122470495 tmax9 0.139941894 bio7 -0.121625409 tmean2 0.138563898 tmean4 -0.120459415 tmean4 0.138504981 bio5 -0.112652191 tmin7 0.137645097 tmean7 0.137358140 tmax8 0.136604539 tmax1 0.133659085 bio5 0.131391705 bio15 0.130725952 tmean3 0.130521204 tmax5 0.128818865 tmax2 0.127966356 tmax6 0.127217255 tmax7 0.121084527 tmax3 0.109924147 tmax4 0.109554257 bio9 0.108220499 prec7 -0.123425712 bio14 -0.121139445 prec8 -0.121022960 alt -0.118182358 bio17 -0.115965563 bio18 -0.111415782 prec6 -0.109175736 bio7 -0.104425288 lat -0.098014332 Pokud byly do lineárního modelu zarřazeny i kvadratické cřleny, byly ve výsledném modelu významné jak všechy 3 hlavní efekty, tak kvadratický cřlen bio2 a interakce tmean10 a bio2. Nicméne tento model nevyhovel požadavkům nezávislosti reziduí na predikovaných hodnotách, byl založen na prříliš silném vlivu 48 Velikost genomu a nadmorřská výška neřkterých pozorování (hodnoceném mírou Cookovy vzdálenosti) a navíc obsahoval navzájem korelované koeficienty svých složek. Pokud byly z modelu vynechány kvadratické cřleny, pak bylo možno vysveřtlující promeřnné redukovat pouze na promennou bio12 (a model je pak analogický Pearsonovu korelacnímu koeficientu, GS = 0,72 + 0,00003*bio12 +e, p=0,0022). Jednodušší model lze též upřednostnit na základeř požavaku parsimonie a snažší interpretovatelnosti. Podobný výsledek také dá veřtšina ostatních promeřnných korelovaných s 2. osou PCA, uvedených v tabulce 12 (krome: bio3, bio7, bio8, zemepisné šírky, srážkového úhrnu v 5., 6. a 9. mesíci v roce). Konkrétní hodnoty regresních koeficientu a smernic trendu lze najít v prříloze). Pro vysvetlovanou promennou LARGE (prumer tří nejvetších genorrm v populaci) se jeví významná interakce všech trří vysveřtlujících promeřnných i neřkteré dvojné interakce, avšak taktéž nevyhovuje v prředpokladu nezávislosti rozptylu na predikovaných hodnotách, nerovnomeřrném vlivu všech pozorování a neko-relovanosti koeficientu!. Proto se omezím pouze na analýzu hlavních efektu, kde je bezesporu signifikantní promenná bio12 (LARGE = 0,735 + 0,000027 * bio12, p = 0,0048). Velmi podobná je situace u promenné SMALL (SMALL = 0,717 + 0,00003 * bio12, p = 0,0029). Vztah LARGE a SMALL k dalším promenným je podobný jako u mediánu velikosti genomu populace (s nímž jsou promeřnné LARGE a SMALL silneř korelované). Promeřnnou bio12 lze použít jako kovariátu pro analýzu kovariance ve vztahu nadmorřské výšky a velikosti genomu, tato však neprřinesla statisticky významný výsledek. Pro promeřnné popisující variabilitu velikosti genomu uvnitrř jednotlivých populací (smeřrodatná odchylka, rozptyl, index vyšikmenosti rozdeřlení) se nepodarřilo nalézt žádný signifikantní vztah s promennými prostredí. V populacích 01,02,04,06,08,09,13,15, u nichž byly v databázi IGER k dispozici údaje o expozici a sklonu svahu, byl vypocřten index ozárřenosti a tepelného požitku. Ze standardizovaných a centrovaných hodnot všech promenných prostredí byla vypocřtena skóre komponent PCA. S prvními trřemi osami korelovaly promeřnné (v tomto porřadí): minimální teplota v listopadu (tmin11), isotermalita (bio3) a index tepelného požitku (HEAT), více v tabulce 13. Pouze promenná bio3 nemá normální rozdeřlení, a to ani po transformaci, byla proto nahrazena v porřadí druhou s druhou osou nejsilneřji korelovanou promeřnnou, smeřrodatnou odchylkou rocřních teplot (bio 4), která již normální rozdeřlení má (Shapiro-Wilk test: median GS: W = 0,9257, p = 0,2084; tmin11: W = 0,8708, p = 0,1536; HEAT: W = 0,9042, p = 0,3152; bio 4: W = 0,8671, p = 0,1412; nadm. výška: W = 0,8829, p = 0,2005). Promenná HEAT nemela signifikantní vztah k velikosti genomu, ani v interakci s ostatními faktory, 49 Velikost genomu a nadmořská výška ani v kvadratickém prubehu, na rozdíl od proměnné bio4 (R=0.82, p=0,00192), nicméně dle diagnostických grafU není ani tento vztah zcela věrohodný. Tabulka 13: Skóre promenných prostředí relevantních ke populacím Dactylis glomerata, u nichž byly k dispozici údaje o sklonu a orientaci svahu, v PCA.„prec" znací úhrn srážek v príslušném mesíci, „tmean" pnůmernou teplotu, „tmax" resp. „tmin" maximální, resp. minimální teplotu v príslušném mesíci, „bio" odkazuje k bioklimatickým promenným 6, „lat" je zemepisná šírka, „lon" zemeřpisná délka. Proměnné Skóre PC1 Proměnné Skóre PC2 Proměnné Skóre PC3 62% 25,5 % 8,7 % PC1 PC2 PC3 tmean4 0.10199369 alt 0.129068274 lon 3,40E-002 tmax12 0.10649395 lon 0.154589717 tmin12 3,41E-002 bio6 0.11596728 bio7 0.159109439 bio14 3,45E-002 tmin1 0.11740753 bio4 0.172551163 prec7 3,45E-002 tmin4 0.12349071 tmax10 -0.101532246 tmean12 3,59E-002 tmean12 0.12723681 tmax5 -0.102383659 tmin2 3,61E-002 tmax5 0.13201796 tmean12 -0.109453486 bio6 4,07E-002 tmax10 0.13319083 tmin4 -0.115073971 bio8 4,17E-002 bio1 0.14083262 tmin1 -0.120602350 tmin1 4,90E-002 tmax11 0.14268216 bio6 -0.122759528 prec8 5,94E-002 tmean5 0.14434575 prec8 -0.128822964 tmax6 -1,00E-001 bio15 0.14961337 bio14 -0.130438673 tmax7 -1,14E-001 tmin12 0.14963137 prec7 -0.130438673 bio2 -1,26E-001 tmean10 0.15124203 tmax12 -0.133912337 bio7 -1,60E-001 tmin7 0.15294673 bio17 -0.137445683 RAD -6,05E-001 tmax9 0.15317402 tmean4 -0.137633607 HEAT -6,55E-001 tmean11 0.15460439 prec4 -0.140391232 tmin5 0.15583657 prec9 -0.140885103 tmin8 0.15598385 bio11 -0.140950547 tmax7 0.15610925 prec5 -0.141272244 tmean7 0.15674033 prec2 -0.143522152 tmax6 0.15942762 prec6 -0.143537833 tmax8 0.15973169 tmean1 -0.144015506 bio5 0.15983483 bio19 -0.144315639 tmean8 0.16033141 bio12 -0.146621745 bio9 0.16035007 prec3 -0.148021728 bio10 0.16102409 prec11 -0.148076569 tmin6 0.16109152 prec12 -0.148647271 tmean9 0.16154349 lat -0.149495817 tmin10 0.16158187 prec1 -0.149534718 bio8 0.16175130 tmax4 -0.151076787 tmin9 0.16181914 tmin2 -0.151818411 Tabulka pokracuje na následující strane. 50 Velikost genomu a nadmorřská výška Proměnné Skóre PC1 Proměnné Skóre PC2 Proměnné Skóre PC3 tmean6 0.16182875 bio16 -0.152438813 tminll 0.16193232 bio18 -0.154817109 bio17 -0.10316401 tmax1 -0.155467129 bio14 -0.11021743 tmean2 -0.158724346 prec7 -0.11021743 bio13 -0.159622240 prec8 -0.11106148 tmax2 -0.162565440 tmin3 -0.162859259 tmean3 -0.164497687 tmax3 -0.165981554 prec10 -0.167033125 bio2 -0.172233706 bio3 -0.177060563 Ordinacní analýza (PCA) popisuje rozdíly v podmínkách jednotlivých transektu, jak je zobrazeno na diagramech 16,17,18. Kvadratické vztahy promenných prostředí a velikosti genomu nebudou testovány vzhledem k velmi malým poctum pozorování, z téhož duvodu nejsou testovány ani interakce promenných. Ke srovnání transektu byly použity promenné významné v PCA pro všechny lokality, a to jak v kladných, tak v záporných hodnotách. Pokud s puvodní promennou silne korelovala neřkterá z „bioklimatických" promeřnných (a tak tomu veřtšinou bylo), byla uprřednostneřna. Na francouzském transektu je nejvlhcím obdobím léto, gradient vlhkosti je podobný gradientu nadmorské výšky. Geograficky odlehlá lokalita ve výšce 2 500 m n. m. se vymyká trendu ostatních cřtyrř. Velikost genomu vysveřtluje promeřnná bio7 (Pearsonuv korelacní koeficient, r = 0,916659, t = 3.9725, df = 3, p = 0,02852). Podobný výsledek lze získat pro promenné LARGE a SMALL, tato shoda předjímá, že žádná z charakteristik rozdeřlení velikostí genomu nebude v tomto podsouboru významná. Všechny promenné mají normální rozdelení. Je-li promenná bio7 použita v analýze kovariance, signifikance vztahu velikosti genomu k nadmořské výšce vzroste na p = 0.08. Transekt ve Španelsku je charakteristický suchým létem a vlhkou zimou, první osa rovnobežná s kontinentalitou a s úhrnem srážek v zimním období. Promenné bio1 a prec8 nemají normální rozdeřlení, všechny jsou proto testovány neparametricky: Velikost genomu je nejsilneji spojena se zemepisnou délkou, (Spearmanuv korelacní koeficient: p = -0,91, p = 0,005), index vyšikmenosti rozdelení s množstvím srážek v nejsušším cřtvrtletí (Spearman Rank: rho = 0,93, p = 0,003), poztivní vztah velikosti genomu a srážek v zimeř je na hranici významnosti. Analýza kovariance nepoukázala na žádný signifikantní výsledek. Transekt v Itálii nejlépe popisuje prumerná rocní teplota (spolu s kontinentalitou) a srážky v obdobích mezi létem a zimou. Všechny promeřnné mají normální rozdeřlení. 51 Velikost genomu a nadmorřská výška Nejtesnšjší vztah je mezi rozptylem a srážkami v nejsušším ctvrtletí (Pearsonův korelacní koeficient, r = 0,96, p = 0,011), ostatní jsou na hranici signifikance. Vztah rozptylu velikostí genomu a nadmorřské výšky a srážkami v nejsušším cřtvrtletí jako kovariátou je na hladineř významnosti p = 0,07. 3.3.3 Velikost genomu a velikost pruduchových bmnek Variabilita délky sveracích bunek průduchů v jednotlivých populacích je zobrazena v grafech 19 a 20. Žádný ze studovaných parametrů nemá normální rozdelení, jsou proto srovnávána neparametricky. Jednotlivé populace se navzájem statisticky významneř liší, na svrchní i na spodní straneř listu (Kruskal-Wallis test, svrchní strana: x2ie = 334,067, p < 0,0001; spodní strana: x2ie = 227,257, p < 0,0001), dle výsledků mnohonásobného porovnání (Wilcoxonova testu s Holmovou korekcí) je rozdíl nejen mezi diploidní populací a veřtšinou ostatních, ale i mezi populacemi tetraploidů navzájem. Zde však žádný z parametri! není korelovaný s velikostí genomu populace. Na svrchní strane listu se průduchy subsp. hispanica statisticky významneř liší, na spodní straneř to však zrřejmé není. 52 Velikost genomu a nadmořská výška LO 1"^ O d LO c Ž o ro CĽ d LO d n-1-1-1-1-1-1-1-r 94 239 294 502 653 693 817 982 1129 1709 Nadmořská výška [m n. m/ Obrázek 11: Variabilita velikosti genomu u populací Hordeum spontaneum. Písmena vyjadřují kódová označení lokalit. A-G se vztahují k transektu na Har Chermon, TT a TB jsou populace na hoře Tábor a MT a MB na hoře Meron. B značí populaci na úpatí („bottom"), T při vrcholu („top"). Tlustá čára uprostřed boxu značí průměr, horní a spodní hranice boxů 75%, resp. 25% kvantil. 53 Velikost genomu a nadmorřská výška Obrázek 12: Histogram simultánního meření exemplářů D. glomerata s nejvetší a nejmenší velikostí genomu. Rozdíl 11 %. Na svislé ose jsou zobrazeny pocty cástic, na vodorovné ose arbitrární jednotky. Obrázek 13: Histogram simultánního merení exempláru D. glomerata. Nejmenší rozdíl ve velikosti uvnitř populace, prokázaný tímto zpUsobem, byl 3,8 %. Na svislé ose jsou zobrazeny poCty Cástic, na vodorovné ose arbitrární jednotky. 54 Velikost genomu a nadmořská výška ,-' o o o oo q - o .-' 0 o,-' CD q - o o q - o 1.04 1.06 1.08 1.10 1. Jednotlivá měření Obrázek 14: Vztah mezi poměrem relativních velikostí genomu dvou vzorků naměřených jednotlivě a simultánně. Pearsonův korelační koeficient, N = 10, R = 0,861, p = 0,0003 55 Velikost genomu a nadmořská výška 350 650 920 1120 800 975 1320 80 520 700 1430 [m n.m.] [m n.m.] [m n.m.] Obrázek 15: Variabilita velikosti genomu u populací Dactylis glomerata, rozděleno podle oblastí. Tlustá čára uprostřed boxu značí průměr, horní a spodní hranice boxů 75%, resp. 25% kvantil. Zářezy v boxech naznačují interval spolehlivost odhadu průměru: o dvou boxech, jejichž y souřadnice uvnitř zářezů nemají společný průnik, lze orientačně říci, že zobrazují signifikantně rozdílné populace. Zobrazení zářezu může přesahovat délku boxu. Diploidní populace není zobrazena. Populace přičítané k subsp. hispanica jsou v nejvyšších výškách na italském transektu. 56 Velikost genomu a nadmořská výška Charakteristika klimaty francouzského transektu - 1320 — CM Letni srážky 1040 Srážky v nejvlhóřfknšfci — o Zimnf srat^^// ^^Sr-Srážky v nejsuššrmjSvrtlett ^rocnt teplota Zeměpisná délka 2500 Rozsah teplot 800 — v _ y I I I -1.0 -0.5 0.0 I 0.5 I 1.0 PC1 Obrázek 16: Popis transektu ve Francii na základě průměrné roční teploty, ročního rozsahu teplot a srážkového úhrnu v nej sušším čtvrtletí, v nej vlhčím měsíci, v létě, v zimě. Číselným údajem je označena nadmořská výška lokality. S první osou nejsilněji koreluje průměrná roční teplota. 57 Velikost genomu a nadmořská výška Charakteristika klimatu španáského transektu -5 0 5 _I_I_I_ 1000 Srážky v nejsuššlm čtvrtletí Letni srážky Zeměpisnájdélka Rozsab tcpjoť Srazky v nejvlnam mesic / 350 -Z^_^580 i ^Zjftmt srážky Prim roml teplota eso 1120 ~~i-1-r -0.5 0.0 0.5 PC1 Obrázek 17: Popis transektu ve Španělsku na základě průměrné roční teploty, ročního rozsahu teplot a srážkového úhrnu v nej sušším čtvrtletí, v nej vlhčím měsíci, v létě, v zimě. Číselným údajem je označena nadmořská výška lokality. S první osou koreluje nejtěsněji proměnná rozsah teplot (kontinentalita). 58 Velikost genomu a nadmořská výška Charakteristika klimatu italského transektu -4 -2 0 2 4 80 1430 Zimní srážky Srážky ^^|%f|^)avrtlett Pnjfn^očhl teplota _ / i Zemepisná délka Srážky v nej^n měsíci ^-1-1-1-r -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 PC1 Obrázek 18: Popis transektu v Itálii na základě průměrné roční teploty, ročního rozsahu teplot a srážkového úhrnu v nej sušším čtvrtletí, v nej vlhčím měsíci, v létě, v zimě. Číselným údajem je označena nadmořská výška lokality. S první osou koreluje průměrná roční teplota. 59 Velikost genomu a nadmořská výška 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16 Kód populace Obrázek 19: Variabilita velikosti průduchů na svrchní straně listu v populacích Dactylis glomerata s různou velikostí genomu. Jsou zahrnuty jak diploidní populace (05), tak tetraploidní (ostatní). K subsp. hispanica náležejí populace 04 a 15. Kód populace Obrázek 20: Variabilita velikosti průduchů na spodní straně listu v populacích Dactylis glomerata s různou velikostí genomu. Jsou zahrnuty jak diploidní populace (05), tak tetraploidní (ostatní). K subsp. hispanica náležejí populace 04 a 15 60 Velikost genomu a nadmorřská výška 4 Diskuse 4.1 Deschampsia, Ranunculus, Sesleria: Hodnocení experimentu Cytometrické meřrření velikosti genomu Ranunculus acris, Deschampsia cespitosa a Sesleria caerulea poukazovalo na existenci až 7% variability uvnitr jednotlivých druhu. Tuto variabilitu však nebylo možné potvrdit v simultánních meřeních, jejichž výsledkem byly jednoznacřné unimodální histogramy s nízkým CV. Otázka, kterou je treba nyní si položit, se týká možných metodických pochybení v prubehu experimentu. Již v kapitole Materiál a metodika byly naznacřeny neřkteré kritické momenty, z nichž nejveřtším je zrřejmeř absence opakování meřrření jednotlivých rostlin, spojená s vypínáním cytometru mezi dílcřími bloky meřrření. Acř je prři každém meřrření používán týž interní standard, bylo prokázáno, že meřrření téhož vzorku v ruzné dny se mohou o trochu lišit (Suda, 2004), procež je výhodné chybu eliminovat opakováním meřrření, v náhodném porřadí, nebo zpracovat celý experiment „na jedno zapnutí". Za této situace zřejme nelze výsledky studovaných druhu spolehliveř interpretovat (nicméneř lze vyslovit domneřnku, že se jednotlivé populace navzájem ve velikosti genomu neliší, vzhledem k prřekryvu variability). 4.2 Dactylis glomerata: Hodnocení experimentu a srovnání s výsledky původní studie Srovnání mnou namierených mediánu velikosti genomu populace s prumernými velikostmi genomu populací, uvedenými v práci (Reeves et al., 1998) ukázalo, že hodnoty jedincu, v mé práci považovaných za tetraploidy, jsou korelované (Pearsonuv korelacní koeficient, r = 0,472476, R = 0,223, N = 18, df = 16, p = 0,04771, oba soubory mají normální rozdelení: Shapiro-Wilk test, p = 0,620, p = 0,167). Reevesova práce udává variabilitu hodnot 33 % oproti zde nameřrřeným 11 % a publikované smeřrodatné odchylky jsou rřádoveř veřtší. Tyto rozdíly v nameřrřených hodnotách postacřují, aby podporřily domneřnku existence vztahu velikosti genomu vzorku k nadmorské výšce. Statistickou významnost tohoto vztahu udává Reeves p = 0,001, ackoliv používá pravdepodobne parametrickou statistiku navzdory nenormálnímu rozložení dat v promeřnné nadmorřská výška, kde se hodnota 2 500 m n.m. populace 10 jeví jako výrazneř odlehlá (Shapiro-Wilk test, bez transformace: W = 0.8353, p=0.008334 ; po logaritmické transformaci: W = 0,9784, p = 0,95). Je-li pro hodnocení významnosti vztahu použita logaritmicky transformovaná promeřnná nadmorřské výšky, klesá významnost vztahu o rřád, na hodnotu p = 0,029. Obeř opakování experimentu srovnává obrázek 21. Má-li být provedeno kompetentní srovnání výsledku obou prací, je třeba se zameřrřit i na srovnání použité metody. V Reevesoveř práci byla použita metoda 61 Velikost genomu a nadmořská výška Obrázek 21: Porovnání vztahu velikosti genomu Dactylis glomerata a nadmořské výšky u Reevese & al. 1998 (červené křížky) a v této práci (černá kolečka). Velikosti genomu jsou standardizovány na jednotnou škálu (navzdory ztrátě části informace o různém rozptylu hodnot) a centrovány na průměr rovný 0. Plná červená čára značí regresní přímku signifikantního vztahu u Reevese et. al, čárkovaná čára směrnici nesignifikantní regrese dat v této práci. Graf A obsahuje všechny populace považované za tetraploidní (tj. bez 05 a 07), graf B neobsahuje populaci 17 (pravděpodobně jiný taxon), která potenciálně ovlivňuje smysl vztahu. 62 Velikost genomu a nadmořská výška Feulgenovy denzitometrie, ve své dobe nenahraditelný prostředek pro studim kvantitativních charakteristik bunečných jader. V roce 1998, kdy byla práce publikována, se však tato metoda blížila svému zenitu pro tento typ experimentu, mj. vzhledem k casové nárocnosti jednotlivého merení, potrebe precizního dodržení trvání nekterých kroku, udržování presné a stabilní reakcní teploty, kontrastující s potřebou získání velkého množství dat ((Greilhuber, 1998), (Hardie et al., 2002), (Greilhuber, 2008). Mé výsledky jsou založeny na meření na prutokovém cytometru, které je považováno za metodicky robustnejší, nemá príliš specifické nároky na laboratorní podmínky a na nacřasování experimentu, lze jím proto snáze vyprodukovat statisticky relevantní datové soubory. Ackoliv denzitometrickou metodou lze získat spolehlivé výsledky, indicie, že tomu tak v této práci nemusí být, byly publikovány již v roce 1999. Autorským týmem optimalizovaný protokol spolu s první cástí výsledku vyšel separátne v roce 1994 (Creber et al., 1994), při publikaci kompletních výsledku všech transektu v roce 1998 (Reeves et al., 1998) již byl pouze citován. V roce 1999 publikoval Greilhuber krátkou analýzu použitého protokolu na vlastním materiálu D. glomerata a poukázal na pravdeřpodobné narušení podmínek reakce a vynechání podstatných kroku, vedoucí k nestabilnímu výsledku (Greilhuber et Baranyi, 1999). Vlastní výsledek opřel Greilhuber o srovnání s cytometrickým meřením. Stín pochybnosti, vržený na separátne publikovanou metodiku (?)creber1994), nicméne nedosáhl finálního clánku (Reeves et al., 1998), který byl v následujícíh letech cetne citován jako veřrohodný prříklad adaptivity velikosti genomu, naposled v kveřtnu 2010 (Chen et al., 2010). Jako diskutabilní je uváden jen výjimecne (Leitch et Bennett, 2005). Bylo by zajisté možno argumentovat, že rozdíly výsledcích obou studií (Reeves, Bártová) jsou zpusobeny použitím rozdílných tkání (pro Feulgenovu denzitometrii se používají bunřky korřene, pro cytometrické meřrření zde byla použita listová cřepel), které se mohou lišit jak v obsahu sekundárních metabolitu, tak v obsahu DNA (z důvodu neprítomnosti akcesorických chromozomu v bunkách kořenu). Pro cást vzorku však Reeves & al. udává ješte vyšší hodnotu, než byla namerena v této práci. Navíc byl u cásti vzorku experimantálne oveřen shodný obsah DNA v korenových i listových bunřkách. Ale at' už by chyba byla sebevetší, je velmi nepravdepodobné, že by byl kvuli ní setren rozdíl ve velikosti genomu diploidního a tetraploidního jedince, jsou-li výsledky navíc doplneny stanovením chromozomových poctil pro 6 rostlin z populace. Diploidní populace 05 nemá v datech publikovaných Reevesem et al. obdoby, vzorek odpovídající uvedenému kódu (BC 7041) je po celou dobu své existence v databázi IGER veden jako diploidní (I. Thomas, in corresp.). Nejjednodušší vysveřtlení, které se nabízí, je zámeřna kódového oznacření vzorku s jinými, tetraploidními, pocházejícími z téže lokality (BC 6905). Pro populaci 07, která taktéž obsahuje cást diploidních jedincu, nicméne v databázi IGER není o takových vzorcích zmínka. 63 Velikost genomu a nadmořská výška Tímto se obrací pozornost ke zdroji použitých vzorku, sbírkám IGER. Acko-liv, jak již bylo zmíneřno, je jejich personálem vyvíjena snaha udržovát materiál v maximální kvalite, u nekterých taxonu a životních forem není metodika dovedena k takové dokonalosti, aby genetickému posunu ve vzorcích úplneř zamezila. Nejmarkantneřjšími prřípady jsou víceleté rostliny, jejichž genotypy v jedné a téže populaci se mohou vzájemneř odlišovat: dobou dormance semen, nacřasováním jejich dozrávání, prřípadneř jejich produkovaným množstvím. Je proto problematický jak samotný odber jejich vzorku v terénu (tedy v case a prostoru - vždy bude totiž zachycena jen cřást celkové variability), tak udržení genetické integrity vzorku v laboratorních podmínkách v její puvodní podobte. Dalším úskalím jsou druhy alogamické které nemohou být ve sbírce zastoupeny jako jednotlivé rostliny, nýbrž jako celá populace vzájemne se křížící, což vede k dalšímu nárustu a promíenlivosti genetické variability vzorku (Sackville Hamilton et al., 1997). Bylo by možné tedy rříci, že neřkteré experimenty založené na takovýchto druzích se stanou po jisté dobe svým zpusobem nezopakovatelnými (a tedy nefalzifikovatelnými), a to jak prři použití rostlinného materiálu téže populace odebraného na téže lokaliteř, tak prři použití multiplikovaného materiálu z genetické banky. Dactylis glomerata, jakožto vytrvalý a témeř obligátne alogamický druh (Lundquist, 1969) má pro vznik takovéto situace mnohé prředpoklady. Kurátor sbírky I. D. Thomas je si teřchto úskalí zrejme vedom, nabídl proto k dalším prípadným experimentum zbytky puvodního materiálu, nasbíraného prřímo na konkrétních lokalitách. I kdyby meření byla provedena s vysokou přesností, zustává otázka, zdali lze v experimentu s tímto designem interpretovat rozdíly ve velikosti genomu pomocí samotného parametru nadmorřské výšky. Acřkoliv je s gradienetm nad-morřské výšky bezpochyby spojen silný gradient abiotického stresu, je nutné, aby bylo jeho vliv možno separovat od dalších vlivu, které potenciálne mohou tvorřit jinou ekologickou niku (a favorizovat tak rostliny jiné genetické konstituce nebo velikosti genomu). Takovými parametry jsou naprř. abiotické faktory s nad-morřskou výškou primárneř nesouvisející (naprř. pH, substrát, osluneřní stanovišteř). Dalším podstataným parametrem je geografická vzdálenost populací, s níž klesá pravdeřpodobnost prříslušnosti dvou populací k téže metapopulaci a tím pádem je mezi nimi omezen genový tok a dochází ke genetickém driftu. Design tohoto experimentu k faktoriím vyjma nadmořské výšky nepřihlíží, je tvořen populacemi vzájemneř vzdálenými až 500 km v rámci jednoho transektu. S tímto problémem je sdružen problém taxonomie druhu Dactylis glomerata v Evropeř, kde lze prředpoklá-dat specifické adaptace a specifickou historii lokálních typů (subspecií, ekotypu), která muže zastřít jednotnou odpoved' taxonomického komplexu k faktoru prostrředí. K této možnosti poukazuje i zjišteřná slabá závislost velikosti genomu na geografické vzdálenosti. Nezanedbatelný je v této otázce i lidský vliv, který cíleným šířením specifických 64 Velikost genomu a nadmořská výška kultivaru tohoto druhu vnáší další promenlivost. Domnívám se ovšem, že i na rostliny kulturního puvodu piisobí stejný selekcní tlak, jako na typy autochtonní. Lze u nich ale též predpokládat relativne zvýšenou odolnost, upevnenou v prubehu šlechtení. 4.3 Dactylis glomerata, Hordeum spontaneum, velikost genomu U obou studovanných druhu byla prokázána vnitrodruhová variabilita ve velikosti genomu. U Dactylis glomerata je výrazne většího rozsahu (11 %) proto byla prokázána nejspolehlivejším možným zpusobem - simultánním mierením vzorku s odlišnou velikostí genomu. Simultánně naměřené rozdíly byly navíc potvrzeny korelací s jednotlivě nameřenými hodnotami. O absenci vlivu sekundárních metabolitu svedcí symterické histogramy s nízkými hodnotami CV. Jak již bylo zmíneno, rozsah nameřené variability není v souladu se zjišteními, která publikovali Reeves et al. (1998), Creber et al. (1994), Vilhar et al. (2002). Poslední zmínená práce uvádí variabilitu pouze 2,1 %, studovaný vzorek z hory Krvavec ve Slovinsku je pravdepodobne taxonomicky homogenní, nicméně jeho status v rámci agregátu subspecií D. glomerata není jednoznacřný. Rostliny meřly tetraploidní pocřet chromozomu, avšak vykazovaly charakteristický morfologický znak pro diploidní D. glomerata subsp. aschersoniana (plevy na ploše lysé). Morfologická intermedier-nost je v tomto agregátu castá (Lumaret et Barrientos, 1990, Gauthier et al., 1999). Více studií o vnitrodruhové variabiliteř velikosti genomu tohoto druhu není známo, avšak jsou známa jednotlivá měrení ruzných autoru - i ta se významně liší, ackoliv by se ve všech prípadech mělo jednat o tetraploidní typy, důvody mohou být ruzné. Prřehed uvádí Vilhar et al. (2002). Variabilita u Hordeum spontaneum je podstatneř nižší (2,9 %), nedosahuje rozlišo-vancí schopnosti prutokového cytometru, byla však ověřena opakovaným měrením týchž vzorku. CV těchto měrení jsou taktéž velmi nízké a svědcí o spolehlivosti výsledku. Zjištěná variabilita je o něco nižší, než 4,5 % které publikoval Turpeinen et al. (1999), tato měrení se však vztahují k vzorkum z většího území a podstatně delšího gradientu podmének prostredí (od Har Chermon po Negevskou poušt'). Ještě nižší variabilitu uvádí Kalendar et al. (2000) z Nahal Oren (tzv. Evolution canyon), ale zato v souvislosti se stanovením poctu kopií BARE-1 transpozonu, odpovídajícího odlišným mikroklimatickým poměrum stanoviště. Jako invariabilní hodnotí H. spontaneum i práce Jakob et al. (2004) zabývající se celým rodem Hordeum. Soleimani et al. (2005) vysveřtlují variabilitu ve velikosti genomu u H. spontaneum a H. vulgare zvýšenou rekombinací repetitivních elementu, která zpusobuje ztráty krátkých úseku DNA. 65 Velikost genomu a nadmorřská výška 4.4 Dactylis glomerata, Hordeum spontaneum, adaptivita Pomocí dat z GIS bylo možné pokusit se interpretovat adaptivitu rozdílných velikostí genomu jinými faktory, než nadmořskou výškou. Je nutné zdůraznit fakt, že data, získaná z modelu Worldclim jsou pouze daty interpolovanými, a velmi pravdeřpodobneř i na základeř nadmorřské výšky. Tudíž jimi nelze jednoznacřneř popsat mikroklima stanovišteř, ale pouze urcřit orientacřní hodnoty. O neřco exaktneřjší informaci může prinést údaj o expozici a sklonu svahu, díky nemuž je možné se pokusit o mezoklimatickou a topoklimatickou charakteristiku lokality. Zrno DEM ASTER je v horizontální rovineř 10 x 10 m, v ve vertikálním smeřru 30 m (NASA, 2009), hodnoty nadmorřských výšek se pomeřrneř dobrře shodují s oveřrřeným, starším modelem SRTM (zrno 30 x 30 m), rozdíly jsou patrné až ve vyšších výškách. Bohužel u velké cřásti lokalit D. glomerata nebylo možno sklon a expozici získat, vzhledem k pomeřrneř málo prřesnému odhadu zemeřpisných sourřadnic (databáze IGER uvádí, že byl proveden odecřtem z mapy, což byl v dobeř sbeřru obvyklý postup), kde prřesnost daná zvoleným meřrřítkem se pohybuje kolem 1 km. Ale ve skutecřnosti bude chyba ješteř veřtší, což lze ilustrovat na prříkladu lokality 10 (Francie, udáváno 2 500 m n. m., od dotycného místa do této výšky zbývá alespon 3 km vzdušnou cřarou). Navíc se tato informace neshoduje se strucřným slovním popisem v IGER databázi („Orciěres, end of the road"), jelikož silnice ani v dnešním rozsahu nedosahují v této oblasti do 2 000 m n.m. Dve dvojice lokalit na španel-ském transektu, dle popisu vzdáleny až 10 km od sebe navzájem, jsou oznaceny identickými sourřadnicemi. Krom toho jsou v publikaci sourřadnice prezentovány v ne zcela obvyklém typografickém provedení (celé stupne a vteřiny oddelené tecřkou, která neznacří tecřku desetinnou, jak je tomu v beřžném dekadickém zápisu) může být zdrojem konfúze. Z techto důvodu nemelo význam zarazovat do analýz faktor geologický, jelikož se cřást lokalit nachází v geologicky pestrých oblastech. Pro srovnání s daty z modelu Worldclim je prřesnost lokalizace postacřující (má zrno taktéž 1 x 1 km (Hijmans et al., 2005)). Dalším nevyhnutelným úskalím jsou vlastnosti datového souboru z hlediska statistických interpretací. V souboru dat o velikosti genomu u Dactylis glomerata lze použít celý soubor (17 mediánů populací) najednou, jehož vlastnosti však mohou být zatíženy geografickou vzdáleností populací. Druhou možností je analyzovat každý transekt separátneř, nicméneř s velmi malým pocřtem pozorování (minimum jsou 4 populace, maximum 6). Takovýto datový soubor je problematické interpretovat vetším poctem promenných, nebot' dosažitelné hodnoty pravdepodobnosti jsou (kromeř prřípadu dokonale lineární závislosti) za hranicí danou korekcí pro mnohonásobná porovnání. Malý pocet pozorování je také důvodem, proc témer žádná z pozorovaných závislostí nevyhovuje požadavkům na lineární model kladeným (nezávislost reziduí na strřední hodnoteř, Cookova vzdálenost aj.). 66 Velikost genomu a nadmorřská výška Otázkou ziůstává, zdali vubec lze navrhnout pro studium vztahu velikosti genomu rostlinného druhu a nadmorřské výšky takový experiment, aby poskytl dostatecřný pocřet pozorování pro statistickou relevanci, ekologické podmínky podél gradientu byly vyhodnotitelné (vycíslitelné, homogenní) a bylo by možné vylouät genetický drift populací. Design experimentu na Hordeum spontaneum akcentuje homogenitu ekologických podmínek populací (která prřesto není dokonalá), ale potýká se s nízkým poctem pozorování. Nebyla však potvrzena prostorová autokorelace, proto byly do zahrnuty i vzdálenejší lokality. Práce o velikosti genomu predchudcu kulturní kukuřice Zea mays ssp. mays v Jižní Americe ukazují, že je možné u tohoto druhu obsáhnout gradient až 3 000 m nadmorřské výšky, homogenita podmínek je ovšem nejistá, podobne jako homogenita taxonomická (Poggio et al., 1998),(Lia et al., 2007). Další studium toho fenoménu by bezpochyby vyžadovalo nalezení nového modelového druhu. Jinou možností je navýšení poctu vzorku sberem ve více transektech v téže oblasti v mzných stupních nadmorské výšky. Pri vyšším poctu vzorku by pak mohla být možná napr. analýza kvantilovou regresí pro oveření ruuzného sklonu regresní křivky v mzných velikostních ketgoriích. Ordinacřní analýza ukazuje, že pomocí dat, která jsou k dispozici, lze interpretovat rozdíly v podmínkách jednotlivých transektu. Především promenné spojené se srážkami mají podél geograficky vzdálených gradientu nadmořské výšky ruzný prubeh. Shrnutí výsledku je uvedeno v tabulce 14, již zde nejsou rozlišovány jednotlivé vysveřtlované promeřnné (medián velikostí genomu, index vyšikmenosti rozdelení, prumer trí nejvetších genomu). Výsledek v prípade transektu v Itálii, kde s nadmořskou výškou koreluje rozptyl velikostí genomu v populaci je možné interpretovat pomocí „Large genome constraint hypothesis". Úhrn srážek v nejsušším období (letním období, tedy vegetacní sezóne) a teplota (tj. vetšina promenných korelovaných s 1. osou PCA pro D. glom-erata) jsou zde mírou stresu, která omezuje podíl velkých genomu v populacích. A tento stres je korelovaný s nadmorřskou výškou: cřím výše v horách se populace nacházejí, tím méneř je letní sucho a výpar omezuje. Podobný výsledek dává index vyšikmenosti rozdelení na transektu ve Španelsku -populace, v nichž prřevažují velké genomy nad malými se nacházejí v podmínkých vyšších srážek a nižších letních teplot. Roli vhkosti akcentuje i korelace velikosti genomu se zemeřpisnou délkou, která v lokálním meřrřítku znamená vzdálenost atlantského pobrřeží. Je sice zdánliveř pozitivneř korelována s kontinentalitou, což je ale pouze numerický artefakt, jelikž se pohybujeme v záporných hodnotách „("za) Greenwichským nultým poledníkem. Parametry srážek nejsou na španelském transektu korelované s nadmorřskou výškou. Na francouzském transektu piisobí obtíže v interpretaci odlehlá alpská lokalita, která má výrazne jiné hodnoty promenných prostředí, než zbylé lokality v Massif Central. Rozdílům ve velikosti genomu však odpovídají hodnoty spojené se stabilitou teplot v pubehu roku - kontinentalita (rozdíl maximální a minimální 67 Velikost genomu a nadmořská výška teploty) a s ní korelovaná smeřrodatná odchylka rocřních teplot. Velké genomy zde (možná paradoxne) preferují stanovište s vetší mírou stresu, zpusobeného teplotní promeřnlivostí prostrředí. Populace s nejveřtším genomem totiž pochází práveř z odlehlé lokality alpské lokality, která by meřla mít nejveřtší prředpoklad pro omezení zpusobená zkrácenou vegetacní sezónou. Je škoda, že nejsou známy o této lokalite známy podrobnejší stanovištní podmínky. Nemužeme však vyloucit ani fylogenetický puvod této odlišné velikosti. U zbylých ctyr populací by velikost genomu dobrře, negativneř korelovala s nadmorřskou výškou a se všemi promeřnnými na 1. ose PCA. Pro francouzský transekt je zrřejmý lineární vztah vysveřtlující a vysveřtlované promeřnné, poukazující k možnosti prřímé selekce konkrétního výhodného typu a eliminaci ostatních nevýhodných (na rozdíl od modelu s omezením („large genome constraint"), na jaký by bylo možno usuzovat na základe transektu italského. Na všech trřech transektech D. glomerata je s nadmorřskou výškou korelována teplota (prumerná rocní, prumerná v éte a podobne), což je do jisté míry vlastností dat klimatického modelu. Tepelný požitek a ozárření jsou však na modelu nezávislé a v žádné z provedených PCA nebyly korelovány s první osou. Prřesto prřispeřly k vysvetlení variability velikosti genomu pouze u H. spontaneum. Prítomnost druhu! s velkými genomy nebyla koncentrována na lokalitách svyšším stupneřm ozárření, nesignalizuje proto možnou výhodnost nekódující DNA v reakci na UV zárření nebo prřehrřívání, spíše naopak. Z tabulky je zřejmo, že se nepodařilo nalézt obecný spolecný jmenovatel pro ekologické podmínky, které by korelovaly s velikostí genomu obdobným zpusobem v obou studovaných druzích. Pro H. spontaneum jsou relevantní parametry spojené s teplotou, kdežto u D. glomerata jsou to prředevším parametry srážek. Pouze na francouzském transektu se projevuje významneř teplotní promeřnná (kontinentalita), její vliv však nebylo možno potvrdit v ostatních transektech ani na celém souboru dat. Je nutno znovu podotknout, že dosavadní záveřry jsou obrovsky zatížené malým pocřtem pozorování, a prřesto, že v neřkterých lze spatrřovat jasnou lineární závislost, může i ona být jen výberem z ve skutecnosti stochastické distribuce velikostí genomu. Pokud bychom prřesto chteřli zjišteřné záveřry zobecnit, pak by bylo možné rříci, že jedinci s veřtší velikostí genomu preferují stanovišteř s menším abiotickým stresem, který lze v rozmeřrech této studie popsat jako nedostatek srážek a chladné klima. Korelace velikosti genomu H. spontaneum se shodují s údaji, které publikoval Turpeinen et al. (1999), který popsal korelaci s prumernou rocní teplotou a lednovou teplotou, žádné další faktory nebyly významné. K k podobnému záveřru speřjí i výsledky nových meření v Nahal Oren (Doležalová et al., 2009). Další příklady druhu, jejichž velikosti genomu jsou korelované s teplotou, lze nalézt např. v práci 68 Tabulka 14: Proměnné prostředí vysvětlující distribuci velikosti genomu u obou studovaných druhů, na hladině a < 0,02._ Proměnné Korelace Hlavní gradient prostředí Dactylis glomerata celkově Roční úhrn srážek biol2 + PC 2 transekt Francie Rozsah teplot (kon- bio7 + kontinentalita titnentalita) transekt Španělsko Zem. délka Ion + oceanita PC2 Úhrn srážek v nej- biol7 + vlhkost sušším čtvrtletí Úhrn srážek v pros- precl2 + vlhkost PC2 inci transekt Itálie Úhrn srážek v nej- biol7 + vlhkost PCI sušším čtvrtletí, Teplota biol - PCI populace subpopulace Hordeum spontaneum Roční průměrná biol teplota Rozsah teplot (kon- bio7 titnentalita) Ozářenost RAD + teplota + PCI kontinentalita + Ion, + biol5,-biol7 ozářenost On Velikost genomu a nadmořská výška Knight et al. (2005), jsou to však již jen studie interspecifické. 4.5 Dactylis glomerata, velikost přUduchových bunek Acřkoliv nukeleoskeletální teorie prředpokládá prřímou úmeřru, pozorovaná variabilita velikosti pruduchových buniek přesahuje variabilitu velikosti genomu. Je možné témeřrř jisteř vyloucřit vliv podmínek kultivace i vliv vzdálenosti místa odbeřru otisku od rustových pletiv. Přesto že je rozlišovací schopnost použitého zarízení velká, zrřejmeř není možné velikost buneřk meřrřit dostatecřneř prřesneř, aby byl zachycen rozdíl v 10 % velikosti genomu, odpovídající 4,5 % rozdílu v délce bunřky. Podobnou situaci lze nalézt v práci Vilhar et al. (2002), kde velikost pruduchových bunek taktéž nekoreluje s maloškálovou variabilitou velikosti genomu, na 2,1% variabilitu velikosti genomu je rozsah pozorovaných velikostí pruduchu 25-35 um, kdežto v této práci rozsah meření dvojnásobný (od 25 do 45 um) při petinásobné variabilite velikosti genomu. 4.6 Dactylis glomerata, Hordeum spontaneum, nadmořská výška V žádném ze studovaných druhu se nepodařilo prokázat vztah velikosti genomu k nadmorřské výšce lokality, a to ani pro strřední hodnotu velikosti genomu, ani pro variabilitu uvnitrř populace. Pouze lokálneř, na transektech Itálie a Francie uD.glomerata je velikost genomu korelována s kvadratickým prubehem nadmořské výšky. Tento výsledek je však zatížen malým pocřtem pozorování. Analýzy kovari-ance však ukazují, že jistá cřást variability prřece jen s nadmorřskou výškou spojena je, acřkoliv ji svým významem zastinřuje jiná vysveřtlující promeřnná a nedovoluje jí prřekonat hladinu statistické významnosti. V prředchozích studiích na týchž druzích, vyjma výše komentovaného prřípadu D. glomerata v práci Reeves et al. (1998), také nebyl potvrzen vztah nadmořské výšky k velikosti genomu. U vetšiny případu dalších druhu, kde je prokázána vnitrodruhová variabilita, nemá nadmorřské výška význam pro její vysveřtlení. Je tedy pravdeřpodobneřjší, že pozorovaná, nenáhodneř distribuovaná variabilita velikosti genomu je (i) adaptací k jiné envrionmentální promeřnné nebo kombinaci promenných (ii) výsledkem náhodných procesu, prvkem plasticity druhu bez významu pro adaptivitu Doležel et al. (2007) (iii) dusledkem evolucní historie populací, napr. jejich hybridogenním puvodem. 70 Velikost genomu a nadmorřská výška 5 Záver Observacní studie zkoumala na peti geograficky vzdálených transektech význam nadmorřské výšky pro interpretaci variability velikosti genomu v populacích studovaných druhu. Ve trřech modelech se variabilitu velikosti genomu nepodarřilo prokázat, ve dvou modelech, Dactylis glomerata a Hordeum spontaneum, ano. Zjišteřná variabilita nebyla významneř spojena s nadmorřskou výškou, ani obecným zpusobem, ani napříc populacemi každého druhu. Práce tak falzifikovala doposud prijímané závery studií, které provedli Reeves et al. (1998) a Creber et al. (1994), s týmiž vzorky prřírodních populací D. glomerata. Krome nadmořské výšky bylo možno vysvetlit distribuci nuzných velikostí genomu v duchu „Large genome constraint hypotheis". Jedinci s vetší velikostí genomu byli koncentrování v lokalitách, jejichž podmínky byly pro druh prřízniveřjší: pro D. glomerata s vyšší vlhkostí, pro H. spontaneum s vyšší teplotou. Ackoliv obecne je odpoved' rostlinných druhů k faktorum prostředí unimodální, v rozsahu této studie se druhy chovají vzhledem k vysveřtlujícím promeřnným lineárneř, nebo stochasticky. 71 Velikost genomu a nadmořská výška Reference Achigan-Dako, E. G., Fuchs, J., Ahanchede, A., Blattner, F. R., 2008. Flow cytometric analysis in lagenaria siceraria (cucurbitaceae) indicates correlation of genome size with usage types and growing elevation. Plant Systematics and Evolution 276 (1-2), 9-19. Balao, F., Casimiro-Soriguer, R., Talavera, M., Herrera, J., Talavera, S., 2009. Distribution and diversity of cytotypes in dianthus broteri as evidenced by genome size variations. Annals of Botany 104 (5), 965-973. Bennett, M. D., 1972. Nuclear dna content and minimum generation time in herbaceous plants. Proceedings ofthe Royal Society ofLondon Series B-Biological Sciences 181 (1063), 109-120. Bennett, M. D., Leitch, I. J., 2005. Rbg kew plant dna c-value database. URL http://data.kew.org/cvalues/ Bennetzen, J. L., Ma, J. X., Devos, K., 2005. Mechanisms of recent genome size variation in flowering plants. Annals of Botany 95 (1), 127-132. Brookfield, J. F. Y., 2005. The ecology of the genome - mobile dna elements and their hosts. Nature Reviews Genetics 6 (2), 128-136. Bártová, D., 2007. Velikost genomu a nadmorská výška. Bakalárská práce. Cavalier-Smith, T., Beaton, M. J., 1999. The skeletal function of non-genic nuclear dna: new evidence from ancient cell chimaeras. Genetica 106 (1-2), 3-13. Chen, G. Q., Guo, S. L., Yin, L. P., 2010. Applying dna c-values to evaluate invasiveness of angiosperms: validity and limitation. Biological Invasions 12 (5), 1335-1348. Chytrý, M., 2010. Šablona pro výpocet relativního ozárení a tepelného požitku na svazích ruuzného sklonu a orientace. URL http://www.sci.muni.cz/botany/chytry/teaching.htm Cortese, E., Novarese, V., Aichino, C., 1960. Carta Geologica d'ltalia alla scala 1:100 000. SERVIZIO GEOLOGICO D'lTALIA, Firenze, listy: Sicilia. URL http://www.apat.gov.it/Media/carta_geologica_italia/ default.htm Creber, H. M. C., Davies, M. S., Francis, D., Walker, H. D., 1994. Variation in dna c-value in natural-populations of dactylis-glomerata l. New Phytologist 128 (3), 555561. 72 Velikost genomu a nadmořská výška Devos, K. M., Brown, J. K. M., Bennetzen, J. L., 2002. Genome size reduction through illegitimate recombination counteracts genome expansion in arabidopsis. Genome Research 12 (7), 1075-1079. Doležalová, I., PavlíCek, T., Hammerová, I., Gasmanová, N., Nevo, E., Lebeda, A., 2009. Microgeographic genome size differentiation in wild barley, hordeum spon-taneum, nepublikováno. Doležel, J., Greilhuber, J., Lysák, M., Nardi, l., Obermayer, R., 1998. Plant genome size estimation by flow cytometry : Inter-laboratory comparison. Annals of Botany 82,17-26. Doležel, J., Greilhuber, J., Lysák, M., Nardi, l., Obermayer, R., 2007. Adaptive versus non-adaptive phenotypic plasticity and the potential for contemporary adaptation in new environments. Functional Ecology 21, 394-407. Francis, D., Davies, M. S., Barlow, P. W., 2008. A strong nucleotypic effect on the cell cycle regardless of ploidy level. Annals of Botany 101 (6), 747-757. Gauthier, P., Lumaret, R., Bedecarrats, A., 1999. Genetic introgression between tetraploid dactylis glomerata subspp. reichenbachii and glomerata in the french alps. insight from morphological and allozyme variation. Plant Systematics and Evolution 214 (1-4), 219-234. Geologische Bundesanstalt, 2010. Geologische karten von osterreich online. URL http://geomap.geolba.ac.at/GEO/GEO_main.cfm GOe'R DE HERVE, A., BOGDANOFF, S., COUTURIÉ, J., 2006. Carte géologique de la France 1:50 000. BRGM - Service Geologie National, Orleans, listy: Mende, Es-palion, Salles-Curan, Nasbinals, Entraygues-sur-Truyere, Orcieres. URL http://infoterre.brgm.fr/viewer/MainTileForward.do Google, 2010. Google maps. URL http://maps.google.com GRASS Development Team, 1999-2007. Geographic resources analysis support system. URL http://www.grass.itc.it/index.php Greilhuber, J., 1998. Intraspecific variation in genome size: A critical reassessment. Annals ofBotany 82, 27-35. Greilhuber, J., 2005. Intraspecific variation in genome size in angiosperms: Identifiv-ing its existence. Annals of Botany 95 (1), 91-98. 73 Velikost genomu a nadmořská výška Greilhuber, }., 2006. Smallest angiosperm genomes found in lentibulariaceae with chomosomes of bacterial size. Plant Biology 8, 770-778. Greilhuber, J., 2008. Cytochemistry and c-values: The less-well-known world of nuclear dna amounts. Annals of Botany 101 (6), 791-804. Greilhuber, J., Baranyi, M., 1999. Feulgen densitometry: Importance of a stringent hydrolysis regime. Plant Biology 1 (5), 538-540. Greilhuber, J., Doležel, J., Lysák, M., Bennett, M., 2005. The origin, evolution and proposed stabilization of the terms 'genome size' and 'c-value' to describe nuclear dna contents. Annals of Botany 95 (1), 255-260. Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. N., 2002. From pixels to picograms: A beginners' guide to genome quantification by feulgen image analysis densitometry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 50 (6), 735-749. Hawkins, J. S., Grover, C. E., Wendel, J. F., 2008. Repeated big bangs and the expanding universe: Directionality in plant genome size evolution. Plant Science 174 (6), 557-562. Hijmans, R. J., Cameron, S. E., Parra, J. L., Jones, P. G., Jarvis, A., 2005. Very high resolution interpolated climate surfaces for global land areas. International Journal of Climatology 25 (15), 1965-1978. Hodgson, J. G., Sharafi, M., Jalili, A., Diaz, S., Montserrat-Marti, G., Palmer, C., Cer-abolini, B., Pierce, S., Hamzehee, B., Asri, Y., Jamzad, Z., Wilson, P., Raven, J. A., Band, S. R., Basconcelo, S., Bogard, A., Carter, G., Charles, M., Castro-Diez, P., Cornelissen, J. H. C., Funes, G., Jones, G., Khoshnevis, M., Perez-Harguindeguy, N., Perez-Rontome, M. C., Shirvany, F. A., Vendramini, F., Yazdani, S., Abbas-Azimi, R., Boustani, S., Dehghan, M., Guerrero-Campo, J., Hynd, A., Kowsary, E., Kazemi-Saeed, F., Siavash, B., Villar-Salvador, P., Craigie, R., Naqinezhad, A., Romo-Diez, A., Espuny, L. D., Simmons, E., 2010. Stomatal vs. genome size in an-giosperms: the somatic tail wagging the genomic dog? Annals of Botany 105 (4), 573-584. Huber, S., Hoffken, M., Oren, E., Haseneyer, G., Stein, N., Graner, A., Schmid, K., Fridman, E., 2009. Strong correlation of wild barley (hordeum spontaneum) population structure with temperature and precipitation variation. Molecular Ecology 18 (7), 1523-1536. Instituto Geológico y Minero de Espaňa, 2010. Mapa geológico de espaňa 1:25 000. URL http://cuarzo.igme.es/geoveo2/Default.aspx 74 Velikost genomu a nadmorřská výška Ivandic, V., Hackett, C. A., Nevo, E., Keith, R., Thomas, W. T. B., Forster, B. P., 2002. Analysis of simple sequence repeats (ssrs) in wild barley from the fertile crescent: associations with ecology, geography and flowering time. Plant Molecular Biology 48 (5), 511-527. Jakob, S. S., Meister, A., Blattner, F. R., 2004. Considerable genome size variation of hordeum species (poaceae) is linked to phylogeny, life form, ecology, and specia-tion rates. Molecular Biology and Evolution 21 (5), 860-869. Jovtchev, G., Schubert, V., Meister, A., Barow, M., Schubert, I., 2006. Nuclear dna content and nuclear and cell volume are positively correlated in angiosperms. Cytogenetic and Genome Research 114 (1), 77-82. Kalendar, R., Tanskanen, J., Immonen, S., Nevo, E., Schulman, A. H., 2000. Genome evolution of wild barley (hordeum spontaneum) by bare-1 retrotransposon dynamics in response to sharp microclimatic divergence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97 (12), 6603-6607. Kirik, A., Salomon, S., Puchta, H., 2000. Species-specific double-strand break repair and genome evolution in plants. Embo Journal 19 (20), 5562-5566. Knibbe, C., Coulon, A., Mazet, O., Fayard, J., Besslon, G., 2007. A long-term evolutionary pressure on the amount of non-coding dna. Knight, C. A., Ackerly, D. D., 2002. Variation in nuclear dna content across environmental gradients: a quantile regression analysis. Ecology Letters 5 (1), 66-76. Knight, C. A., Molinari, N. A., Petrov, D. A., 2005. The large genome constraint hypothesis: Evolution, ecology and phenotype. Annals of Botany 95 (1), 177-190. Körner, C., 1998. Physiological Plant Ecology. Blackwell, Kap. Alpine Plants: stressed or adapted?, pp. 297-311. Körner, C., 2003. Alpine plant life. Springer Verlag, Berlin Heidelberg. Körner, C., 2007. The use of 'altitude' in ecological research. Trends in Ecology and Evolution 22 (11), 569-574. Leitch, I., Bennett, M., 2005. The evolution of the Genome. Elsevier, Kap. Genome size evolution in plants, p. 139. Leitch, I. J., Beaulieu, J. M., Cheung, K., Hanson, L., Lysak, M. A., Fay, M. F., 2007. Punctuated genome size evolution in liliaceae. Journal ofEvolutionary Biology 20 (6), 2296-2308. 75 Velikost genomu a nadmořská výška Leong-Škorničková, J., Šída, O., Jarolímová, V., Mamyil, S., Fér, T., Trávníček, P., Suda, J., 2007. Chromosome numbers and genome size variation in indian species of Curcuma (zingiberačeae). Annals of Botany 100,505-526. Lia, V. V., Confalonieri, V. A., Ratto, N., Hernandez, J. A. C., Alzogaray, A. M. M., Poggio, L., Brown, T. A., 2007. Mičrosatellite typing of ancient maize: insights into the history of agriculture in southern south američa. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences 274 (1609), 545-554. Lumaret, R., Barrientos, E., 1990. Phylogenetič-relationships and gene flow between sympatrič diploid and tetraploid plants of dačtylis-glomerata (gramineae). Plant Systematics and Evolution 169 (1-2), 81-96. Lundquist, A., 1969. Self-inčompatibility in dačtylis glomerata. Heredity 61 (15). Luo, L., 2009. Law of genome evolution direction: Coding information quantity grows. Frontiers ofPhysics in China 4 (2), 241-251. Lysák, M. A., Rostkova, A. R., Dixon, J. M., Rossi, G., Doležel, J., 2000. Limited genome size variation in sesleria albicans. Annals of Botany 86 (2), 399-403. MčCune, B., Keon, D., 2002. Equations for potential annual direct incident radiation and heat load. Journal of Vegetation Science 13 (4), 603-606. Mizianty, M., 1990. Biosystematič studies on dačtylis. 1. review of previous studies 1.2 cytology, experimental studies and evolution. Acta Societatis Botanicorum Poloniae 59 (1-4), 105-118. Mor, D., 1987. Har odem. URL http://www.geology-israel.co.il/WEBPAGE/HARODEM.HTML Mosčone, E. A., Baranyi, M., Ebert, I., Greilhuber, J., Ehrendorfer, F., Hunziker, A. T., 2003. Analysis of nučlear dna content in čapsičum (solanačeae) by flow cytometry and feulgen densitometry. Annals of Botany 92 (1), 21-29. Muroveč, J., Kasteleč, D., Vilhar, B., Cop, J., Bohaneč, B., 2009. High variability of nučlear dna čontent in čultivars and natural populations of poa pratensis l. in relation to morphologičal čharačters. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 51 (2), 45-52. NASA, 2009. Aster global digital elevation model. URL http://www.ersdac.or.jp/GDEM/E/index.html Noirot, M., Barre, P., Duperray, C., Hamon, S., De Kočhko, A., 2005. Investigation on the čauses of stoičhiometrič error in genome size estimation using heat experiments: Consequenčes on data interpretation. Annals ofBotany 95 (1), 111-118. 76 Velikost genomu a nadmořská výška Ohri, D., 2005. Climate and growth form: The consequences for genome size in plants. Plant Biology 7 (5), 449^58. Ohta, S., 1995. Distinct numerical variation among different tissues in Aegilops mutica boiss. Japanese Journal of Genetics 70,93-101. Oliver, M. J., Petrov, D., Ackerly, D., Falkowski, P., Schofield, O. M., 2007. The mode and tempo of genome size evolution in eukaryotes. Genome Research 17 (5), 594601. Otto, F., 1990. Methods in Plant Biology: Flow cytometry. Vol. 33. Academic Press Inc., Kap. DAPI staining of fixed cells for High-Resolution flow cytometry of nuclear DNA, pp. 105-110. Parisod, C., Holderegger, R., Brochmann, C., 2010. Evolutionary consequences of autopolyploidy. New Phytologist 186 (1), 5-17. Patrushev, L. I., Minkevich, I. G., 2008. The problem of the eukaryotic genome size. Biochemistry-Moscow 73 (13), 1519-1552. Pekár, S., Brabec, M., 2009. Moderní analýza biologických dat. Scientia, Praha. Poggio, L., Rosato, M., Chiavarino, A. M., Naranjo, C. A., 1998. Genome size and environmental correlations in maize (zea mays ssp. mays, poaceae). Annals ofBotany 82, 107-115. Price, H. J., 1998. Environmentally correlated variation in 2c nuclear dna content measurements in Helianthus annuus l. Annals ofBotany 82, 95-98. R Developement Core team, 2010. R. URL http://www.r-project.org/ Ramallo, E., Kalendar, R., Schulman, A. H., Martinez-Izquierdo, J. A., 2008. Reme1, a copia retrotransposon in melon, is transcriptionally induced by uv light. Plant Molecular Biology 66 (1-2), 137-150. Reeves, G., Francis, D., Davies, M. S., Rogers, H. J., Hodkinson, T. R., 1998. Genome size is negatively correlated with altitude in natural populations of dactylis glom-erata. Annals ofBotany 82, 99-105. Rosato, M., Chiavarino, A. M., Naranjo, C. A., Hernandez, J. C., Poggio, L., 1998. Genome size and numerical polymorphism for the b chromosome in races of maize (zea mays ssp. mays, poaceae). American Journal ofBotany 85 (2), 168-174. 77 Velikost genomu a nadmořská výška Sackville Hamilton, N. R., Chorlton, K. H., Thomas, I. D., 1997. Guidelines for the regeneration of accessions in seed collections of the main perennial forage grasses and legumes of temperate grasslands: background considerations. In: Maggioni, L., Marum, P., Sackville Hamilton, N. R., Thomas, I., Gass, T., Lipman, E. (Eds.), Report of a Working Group on Forages, Sixth Meeting, Beitostolen, Norway, 6-8 March 1997. p. 17. Sanmiguel, P., Bennetzen, J. L., 1998. Evidence that a recent increase in maize genome size was caused by the massive amplification of intergene retrotrans-posons. Annals of Botany 82, 37-44. Slovak, M., Vit, P., Urfus, T., Suda, J., 2009. Complex pattern of genome size variation in a polymorphic member of the asteraceae. Journal ofBiogeography 36 (2), 372-384. Soleimani, V. D., Baum, B. R., Johnson, D. A., 2005. Genetic diversity among barley cultivars assessed by sequence-specific amplification polymorphism. Theoretical and Applied Genetics 110 (7), 1290-1300. Soltis, D. E., Soltis, P. S., Schemske, D. W., Hancock, J. F., Thompson, J. N., Husband, B. C., Judd, W. S., 2007. Autopolyploidy in angiosperms: have we grossly underestimated the number of species? Taxon 56 (1), 13-30. StatSoft, 2010. Statistica 9. Stebbins, G. L., 1985. Polyploidy, hybridization, and the invasion of new habitats. Annals ofthe Missouri Botanical Garden 72 (4), 824-832. Stebbins, L., Zohary, D., 1959. Cytogenetics and evolutionary studies in the genus Dactylis. University of California Press, Berkeley, Kap. Morphology, distribution and interrelationships of the diplois subspecies, p. 1. Suda, J., 2004. An employment of flow cytometry into plant biosystematics. Dizer-tacní práce. Swift, H., 1950. The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant cells. Proceedings ofthe National Academy ofSciences 36, 643-654. Temsch, E., Greilhuber, J., 2001. The genetic organization of chromosomes. Genome 44 (5), 826-930. Thomas, C., 1971. The genetic organization of chromosomes. Annual Review of Genetics 5, 237-256. Turpeinen, T., Kulmala, J., Nevo, E., 1999. Genome size variation in hordeum spon-taneum populations. Genome 42 (6), 1094-1099. 78 Velikost genomu a nadmorřská výška Van't Hoi, J., Sparrow, H., 1963. A relationship betweeen dna content, nuclear volume and minimum mitotic cycle time. Proceedings of the National Academy of Sciences 49,897-902. Veitia, R. A., Bottani, S., 2009. Whole genome duplications and a 'iunction' ior junk dna? iacts and hypotheses. Plos One 4 (12). Venables, S., Ripley, B. D., 2002. Modern Applied Statistics with S. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, non vidi. Vidic, T., Greilhuber, J., Vilhar, B., Dermastia, M., 2009. Selective significance oi genome size in a plant community with heavy metal pollution. Ecological Applications 19 (6), 1515-1521. Vigouroux, Y., Matsuoka, Y., Doebley, J., 2003. Directional evolution ior microsatel-lite size in maize. Molecular Biology and Evolution 20 (9), 1480-1483. Vilhar, B., Vidic, T., Jogan, N., Dermastia, M., 2002. Genome size and the nucleolar number as estimators oi ploidy level in dactylis glomerata in the slovenian alps. Plant Systematics and Evolution 234 (1-4), 1-13. Vinogradov, A., 2003. Selfish dna is maladaptive: evidence irom the plant red list. Trends in Genetics 19 (11), 609-614. Vinogradov, A. E., 1998. Buiiering: a possible passive-homeostasis role ior redundant dna. Journal of Theoretical Biology 193 (2), 197-199. Vinogradov, A. E., 2005. Noncoding dna, isochores and gene expression: nucleo-some iormation potential. Nucleic Acids Research 33 (2), 559-563. Vitte, C., Panaud, O., 2003. Formation oi solo-ltrs through unequal homologous recombination counterbalances amplifications oi ltr retrotransposons in rice oryza sativa l. Molecular Biology and Evolution 20 (4), 528-540. Walker, D. J., Monino, I., Correal, E., 2006. Genome size in bituminaria bituminosa (l.) c.h. stirton (iabaceae) populations: separation oi "true" diiierences irom environmental eiiects on dna determination. Environmental and Experimental Botany 55 (3), 258-265. Willis, K. J., Bennett, K. D., Birks, H. J. B., 2009. Variability in thermal and uv-b energy fluxes through time and their influence on plant diversity and speciation. Journal of Biogeography 36 (9), 1630-1644. Ziehe, M., Demetrius, L., 2005. Directionality theory: an empirical study oi an en-tropic principle in liie-history evolution. Proceedings ofthe Royal Society B-Biological Sciences 272 (1568), 1185-1194. 79 Velikost genomu a nadmořská výška Šmarda, P., Bureš, P., 2006. Intraspecific dna content variability in festuca pallens on different geographical scales and ploidy levels. Annals of Botany 98 (3), 665-678. Šmarda, P., Bureš, P., 2010. Understanding intraspecific variation in genome size in plants. Preslia 82 (1), 41-61. 80 Velikost genomu a nadmořská výška 6 Přílohy Tabulka 15: Zařazení exempláři! Hordeum spontaneum do subpopulací pro výpočet tepelného požitku a ozářenosti. Kód subpopulace Exempláře G všechny exempláře A10 A10, A11, A12, A3, A4, A7, A9 A02 A2 B11 B11, B12, B2, B3, B4, B9 B06 B6, B7, B8 C01 všechny exemplářře D03 všechny exemplářře E10 E10,E11 E08 E8, E5, E4 F01 F1 F12 F3, F4, F6 F04 F7, F8, F9, F10 F08 F11, F12 MB10 MB1, MB3, MB4, MB5, MB6, MB7, MB05 MB 8, MB9, MB10, MB11, MB12 MT01 MT1 MT12 MT2, MT12 MT07 MT10, MT11, MT3, MT4, MT7, MT8, TB10 všechny exemplářře TT10 TT10, TT11, TT12, TT8, TT9 TT02 TT1, TT2 TT04 TT5, TT4 81 Tabulka 16: Výsledky Wilcoxonova testu - porovnaní populací Dactylis glomerata. Pro mnohonásobné porovnaní použita Holmova korekce, zvýrazněné rozdíly na hladině a=0,05. Ôl 02 03 04 06 08 09 ÍÔ íl 12 13 14 15 16 17 18 02 0,0090 0 00000000000000 03 0,23601,0000 0 0000000000000 £f 04 0,01561,00001,0000 0 000000000000 S-06 1,0000 0,23601,0000 0,3019 0 00000000000 g 08 1,0000 0,30181,0000 0,1701 1,0000 0 0000000000 g 09 1,0000 0,0048 0,0439 0,00481,00001,0000 0 000000000 10 1,0000 0,0089 0,6580 0,00901,00001,0000 1,0000 0 00000000 * 11 0,05651,00001,0000 1,0000 0,6203 0,3889 0,0048 0,0166 0 0000000 » 12 0,02001,00001,0000 1,0000 0,7631 0,5894 0,0028 0,01561,0000 0 0 0 0 0 0 0 13 0,08821,00001,0000 1,00001,0000 0,5894 0,0565 0,23601,00001,0000 0 0 0 0 0 0 §< 14 1,0000 0,22041,0000 0,38891,00001,0000 1,00001,00001,00001,0000 0,9811 0 0 0 0 0 £ 15 1,0000 0,02671,0000 0,02681,00001,0000 1,00001,0000 0,2953 0,3019 0,23601,0000 0 0 0 0 4 16 0,0015 0,0244 0,0049 0,6383 0,0342 0,0200 0,0028 0,0028 0,2360 0,1234 0,0083 0,0049 0,0028 0 0 0 ^ 17 0,0015 0,0028 0,0028 0,0028 0,0008 0,0015 0,0028 0,0028 0,0028 0,0049 0,0015 0,0028 0,0028 0,0200 0 0 * 18 0,0051 1,0000 0,0507 1,0000 0,0675 0,1138 0,0090 0,0090 1,0000 0,9013 0,7110 0,0166 0,0090 1,0000 0,0179 0 19 0,3019 0,8373 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0166 0,3889 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,0028 0,0028 0,0300 00 Velikost genomu a nadmořská výška j_i_i_L 0.71 0.72 0.73 0.74 0.75 0.76 0.77 _LJ_I_I_I_I_I_L 1050 1430 - 6 - 4 - 2 - 0 80 520 700 6 - 4 - 2 - 0 - 1-1-1-1-1-1-TT 0.71 0.72 0.73 0.74 0.75 0.76 0.77 r~i—i—i—i—i—i—r 0.71 0.72 0.73 0.74 0.75 0.76 0.77 Relativní VG transektu Itálie Obrázek 22: Rozložení velikostí genomu v populacích D. glomerata na italském transektu. 83 Velikost genomu a nadmořská výška 0.72 0.74 0.76 0.78 i,_I_I_I_L 1320 2500 - 6 - 5 - 4 - 3 2 - 1 - 0 800 975 1040 6 -5 4 -3 -2 -1 -0 - T" T T" T" T T" T T" T 0.72 0.74 0.76 0.78 0.72 Relativní VG transektu Francie 0.74 0.76 0.78 Obrázek 23: Rozložení velikostí genomu v populacích D. glomerata na francouzském transektu. 84 Velikost genomu a nadmořská výška 6 - 2 - 0 - 6 - 4 - 2 - 0 - 1120 740 350 T-1-1-1— 0.72 0.74 0.76 0.78 920 550 1000 650 I-1-1-1— 0.72 0.74 0.76 0.78 - 6 - 4 - 2 - 0 Relativní VG transektu Španěsko Obrázek 24: Rozložení velikostí genomu v populacích D. glomerata na španělském transektu. 85 Velikost genomu a nadmořská výška 60 - 40 - 20 - 0 - .o O i_