ř to m MASARYKOVA UNIVERZITA PRÍRODOVEDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK I f j ^ * ^ o. & V PROSTREDÍ Endokrinně disruptivní potenciál metabolitů sinic a řas Diplomová práce Tereza Procházková VEDOUCÍ PRÁCE: RNDr. Kateřina Nováková, Ph.D. BRNO 2013 BIBLIOGRAFICKÝ ZÁZNAM Autor: Bc. et Bc. Tereza Procházková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Název práce: Endokrinně disruptivní potenciál metabolitů sinic a řas Studijní program: Experimentální biologie Studijní obor: Ekotoxikologie Vedoucí práce: RNDr. Kateřina Nováková, Ph.D. Akademický rok: 2013 Počet stran: 66 Klíčová slova: sinice, řasy, endokrinní disrupce, estrogenita, exudáty, microcystiny, in vitro biotesty, buněčná linie HeLa BIBLIOGRAPHIC ENTRY Author: Be. et Be. Tereza Prochazkova Faculty of Science, Masaryk University Research Centre for Toxic Compounds in the Environment Title of Thesis: Endocrine disruptive potential of cyanobacterial and algal metabolites Degree Programme: Experimental biology Field of Study: Ecotoxicology Supervisor: RNDr. Kateřina Nováková, Ph.D. Academic Year: 2013 Number of Pages: 66 Keywords: cyanobacteria, algae, endocrine disruption, estrogenicity, exudates, microcystins, in vitro bioassays, HeLa cell line ABSTRAKT Sekundární metabolity sinic a řas vykazují různou biologickou aktivitu. Mezi známé mechanismy působení patří např. inhibice proteinfosfatáz nebo inhibice syntézy proteinů. Nedávno však byla popsána i schopnost těchto látek interagovat s estrogenním receptorem. Tím by sinice a řasy mohly přispívat k endokrinně disruptivnímu potenciálu povrchových vod, zejména během jejich masivních rozvojů. V rámci této práce byla stanovována estrogenní aktivita extracelulárních metabolitů (exudátů) sinic a řas pomocí in vitro testu s buněčnou linií HeLa. V prvním experimentálním bloku byla hodnocena vnitrodruhová variabilita v produkci estrogenních látek u 2 druhů sinic a 1 druhu zelené řasy. Druhý experimentální blok byl zaměřen na hodnocení mezidruhové variability estrogenního potenciálu exudátů 11 kultur sinic a 4 kultur zelených řas. V jednotlivých vzorcích byla také stanovena koncentrace microcystinů. Estrogenní aktivita byla detekována ve všech vzorcích exudátů sinic i řas. Pozorovaná vnitrodruhová variabilita byla značná, hodnoty estrogenních ekvivalentů se obvykle pohybovaly v rozmezí desítek až stovek pg/1 i v rámci jednoho druhu. Při hodnocení mezidruhové variability byly patrné velké rozdíly v odpovědích indukovaných jednotlivými kmeny. Nejvyšší účinek byl pozorován u exudátů sinice Sphaerospermum aphanizomenoides, který způsoboval až 177 % maximální odpovědi estradiolu. Naopak nejnižší účinek byl pozorován u sinice Cylindrospermopsis raciborskii, který v testovaných koncentracích indukoval jen 19 % maximální odpovědi estradiolu. Mezi estrogenní aktivitou a koncentrací microcystinů ve vzorcích nebyla pozorována žádná korelace. ABSTRACT Secondary metabolites of cyanobacteria and algae show various biological activity. Known mechanisms of action include for example inhibition of protein phosphatases or inhibition of protein synthesis. Recently, the ability of these substances to interact with estrogen receptor was also described. Cyanobacteria and algae could therefore contribute to endocrine disruptive potential of surface waters, especially during algal blooms. In this work, estrogenic activity of cyanobacterial and algal extracellular metabolites (exudates) was evaluated by in vitro assay with HeLa cell line. In the first experimental block, intraspecific variability in the production of estrogenic substances by 2 species of cyanobacteria and 1 species of green algae was assessed. Second experimental block focused on interspecific variability in the estrogenic potential of exudates of 11 strains of cyanobacteria and 4 strains of green algae. Concentrations of microcystins were also measured in all samples. Estrogenic activity was determined in all samples of exudates of cyanobacteria and algae. Observed intraspecific variability was significant, estrogen equivalents were usually in a range of tens to hundreds pg/1 even within the same species. Big differences in responses induced by individual species were apparent during the assessment of interspecific variability. The biggest effect was observed for the exudate of cyanobacterium Sphaerospermum aphanizomenoides, which induced up to 177 % of the maximal estradiol effect. In contrast, the lowest effect was observed for the exudate of cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, which induced only 19 % of the maximal estradiol effect in a tested range of concentrations. No correlation between estrogenic activity and concentration of microcystins was observed. / ^ " V V i Centrum pro výzkum !toxických látek M V V / / ' v prostředí Kamenice 126/3, 625 0 0 Brno. fax +420 549 49 2840. www.recetox.cz ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE Jméno studenta/ky: Tereza Procházková UČO: 324068 Studijní program/Obor: Biologie/Obecná biologie Název práce: Endokrinně disruptivní potenciál metabolitů sinic a řas Název práce anglicky: Endocrine disruptive potential of cyanobacterial and algal metabolites Vedoucí: Konzultant(i): RNDr. Kateřina Nováková Mgr. Klára Hilscherová, Ph.D. Datum zadání: Datum odevzdání: 2. listopadu 2011 květen 2013 (bude upřesněno) Postup a zásady pro v y p r a c o v á n í : V současné době byl dokumentován estrogenně disruptivní potenciál nejen odpadních vod, ale i povrchových vod. Existuje řada chemických látek, které vykazují estrogenní aktivitu (hormonální léčiva nebo některé antropogenní polutanty)a mohou vysvětlovat tento fenomén. Nicméně aktuální stuide poukazují na to, že i fotoautotrofní organismy (zejména sinice a řasy) mohou produkovat metabolity s estrogenním potenciálem a tím působit v prostředí jako endokrinní dísruptory. Cílem této práce je výzkum metabolitů obsažených uvnitř buněk sinic a řas i aktivně vylučovaných do prostředí a jejich estrogenního potenciálu.Dalším cílem této práce bude mechanismus působení těchto endokrinně aktivních metabolitů. Pokyny k vypracování DP: Práce bude členěna na teoretickou a experimentální část. Teoretická část bude tvořena aktuální a přehlednou literární rešerší zaměřenou na estrogenitu metabolitů fotoautotrofních organismů, jejich produkci a mechanismy účinku. V experimentální části se studentka zaměří zvláště na možné ovlivnění signálních drah vybraných vnitrobuněčných receptoru, zejména estrogenního receptoru, který bude hodnocen v in vitro buněčných modelech. Důležitou součástí bude podrobná charakterizace růstových křivek sledovaných organismů a zavedení sledování parametrů podrobně charakterizujících danou populaci. Bude sledována rovněž vnitrodruhová variabilita v produkci látek se specifickými účinky i vliv faktorů ovlivňujících růst populace. V rámci DP si studentka osvojí pravidla práce s in vitro buněčnými liniemi a také bude optimalizovat zpracování získaných vzorků sinic a řas. Dosažené výsledky budou diskutovány s aktuálními literárními informacemi. V Brně dne: 2. listopadu 2011 Podpis vedoucí práce: K-rr>f Cr~r^ Podpis student/ka: 0\^fyJ^^mJ Podpis pedagogický zástupce ředitele Centra: Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala RNDr. Kateřině Novákové, Ph.D. za trpělivost a cenné rady a připomínky poskytnuté při vypracovávání této práce. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Kláře Hilscherové, Ph.D. za odborné konzultace, Mgr. Veronice Buráňové, Mgr. Elišce Sychrové a Mgr. Jiřímu Kohoutkovi, Ph.D. za poskytnutá data a pomoc při zpracovávání vzorků. V neposlední řadě bych ráda poděkovala i celému kolektivu laboratoří Centra pro výzkum toxických látek v prostředí za ochotu a veškerou pomoc. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 15. května 2013 Tereza Procházková SEZNAM ZKRATEK AhR arylhydrokarbonový receptor DDT dichlordifenyltrichlorethan D M E M kultivační médium pro buňky DMSO dimethylsulfoxid DNA deoxyribonukleová kyselina E2 17P-estradiol EC20, EC50 koncentrace způsobující 20%, resp. 50% efekt EEQ estrogenní ekvivalent ELISA analýza s enzymem vázaným na imunosorbent ER estrogenní receptor ERE estrogen responsivní element FBS fetální bovinní sérum GPER estrogenní receptor vázaný na G-protein LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MAPK mitogenem aktivované proteinkinázy MC-LR, RR, YR strukturní varianty microcystinů NOD-R strukturní varianta nodularinu PAH polycyklické aromatické uhlovodíky PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok PCB polychlorované bifenyly PCDD polychlorované dibenzodioxiny RNA ribonukleová kyselina SPE extrakce na tuhou fázi UV ultrafialové (záření) ZBB směs Zehnder média a Bristol modifikovaného Bold média OBSAH 1. Úvod H 2. Teoretická část 12 2.1. Endokrinní disrupce 12 2.1.1. Endokrinní disrupce u živočichů ve volné přírodě 13 2.1.2. Estrogenita 15 2.1.2.1 Estrogenní receptor 16 2.1.2.2. Mechanismy estrogenní odpovědi 16 2.1.2.3. Hodnocení estrogenity 18 2.1.2.4. Estrogenita povrchových vod 20 2.1.3. Ovlivnění dalších hormonálních drah 21 2.2. Sinice a řasy 21 2.2.1. Systematické rozdělení sinic 22 2.2.2. Systematické rozdělení řas 24 2.2.3. Eutrofizace a masivní rozvoje 25 2.2.4. Metabolity sinic a řas 26 2.2.4.1. Endokrinně disruptivní potenciál metabolitů sinic 29 2.2.4.2. Endokrinně disruptivní potenciál metabolitů řas 31 3. Materiály a metody 32 3.1. Design experimentů 32 3.1.1. Vnitrodruhová variabilita 32 3.1.2. Mezidruhová variabilita 32 3.2. Kultivace řas a sinic 34 3.2.1 Stanovení počtu buněk 35 3.2.2. Optimalizace délky kultivace 36 3.3. Zpracování vzorků 37 3.4. Buněčná linie HeLa 38 9 3.5. Test estrogenity 40 3.6. Vyhodnocení dat 41 4. Výsledky 43 4.1. Estrogenní aktivita kultivačního média 43 4.2. Vnitrodruhová variabilita 43 4.2.1. Koncentrace buněk na konci kultivace 43 4.2.2. Estrogenní ekvivalenty exudátů 45 4.2.3. Koncentrace microcystinů 47 4.3. Mezidruhová variabilita 49 4.3.1. Křivky dávka - odpověď 49 4.3.2. Estrogenní ekvivalenty exudátů 51 4.3.3. Koncentrace microcystinů 52 5. Diskuse 53 6. Závěr 57 7. Použitá literatura 58 8. Přílohy 65 10 l.ÚVOD Sinice a řasy jsou známé svou schopností dominovat ve vodním prostředí a vytvářet tak vodní květy. Známými důsledky těchto masivních rozvojů jsou např. snížení kvality vody (ovlivnění chuti, zápachu), stínění přisedlých vodních rostlin, snížení biodiverzity nebo odčerpávání kyslíku následkem rozkladu biomasy. Sinice a řasy jsou však schopné produkovat i různé bioaktivní metabolity, které mohou být do prostředí uvolňovány rozkladem odumřelých buněk (intracelulární metabolity), ale i aktivně vylučovány do okolí během jejich života (extracelulární metabolity = exudáty). Pouze u malé části těchto látek však byla identifikována jejich chemická struktura a popsány mechanismy působení. Mezi nedávno objevené efekty metabolitů sinic a řas patří i endokrinní disrupce, zejména pak jejich estrogenní účinky. Endokrinní disrupce popisuje schopnost látky narušovat v organismech procesy zprostředkované hormonální signalizací. Mohou tak ovlivňovat např. vývoj a diferenciaci buněk a způsobovat nevratné změny na úrovni jedinců a následně i populací. Rada těchto účinků byla pozorována i ve volné přírodě a endokrinně disruptivní aktivita byla zjištěna v různých typech povrchových vod. Na těchto účincích se mohou podílet různé chemické látky antropogenního i přírodního původu a pravděpodobně to mohou být i metabolity sinic a řas, zvláště na lokalitách, kde dochází k rozvoji vodních květů. Cílem této diplomové práce bylo: • vytvořit rešerši o endokrinně disruptivním působení metabolitů sinic a řas s důrazem na estrogenitu těchto látek • kultivace vybraných laboratorních kmenů řas a sinic a zpracování jejich exudátů • určení vnitrodruhové variability produkce látek s estrogenní aktivitou u tří vybraných druhů sinic a řas pomocí in vitro testu s buněčnou linií HeLa • určení mezidruhové variability produkce těchto látek u sinic a řas také využitím in vitro testu s buněčnou linií HeLa 11 2. T E O R E T I C K Á Č Á S T 2.1. ENDOKRINNÍ DISRUPCE Endokrinní systém plní v těle integrující a řídící funkci. Hormony v těle ovlivňují řadu důležitých procesů, jako jsou např. růst a vývoj, metabolická aktivita, chování, rozmnožování nebo funkce některých orgánů (ledviny, srdce). Snížení i zvýšení jejich aktivity proto může mít na organismy negativní účinky. Hormony mohou mít různé chemické struktury. Patří mezi ně třeba katecholaminy (př. adrenalin), indolaminy (př. serotonin), peptidy a proteiny (př. inzulin) nebo steroidy (př. estradiol, testosteron), specifickou strukturu s aromatickými jádry substituovanými jódem mají thyroidní hormony. Chemická struktura ovlivňuje chování hormonů v organismu. Ty, které jsou ve vodě lépe rozpustné (katecholaminy, indolaminy, peptidy a proteiny), se v krvi obvykle transportují volně a váží se na receptory na povrchu buněk. Oproti tomu hormony, které jsou více lipofilní (steroidy, thyroidní hormony) jsou většinou transponovány vázané na proteiny a jejich receptory bývají intracelulární (Norris and Carr, 2006). Látky, které mohou ovlivňovat hormonální systém, se označují jako endokrinní disruptory. Mohou působit na syntézu, sekreci, transport, vazbu na receptor, aktivitu nebo eliminaci přirozených hormonů (Kavlock et al., 1996). Pokud se váží na receptory, mohou fungovat jako agonisté, antagonisté nebo inverzní agonisté (Orchinik and Propper, 2006). Agonisté po vazbě na receptor způsobují obdobnou odpověď jako přirozené ligandy. Antagonisté se sice váží na receptor, ale nejsou schopny indukovat v buňkách odpověď. Blokují ovšem vazebná místa pro hormony. Inverzní agonisté svou vazbou produkují opačnou odpověď než původní ligandy. Jednotlivé látky mohou způsobovat i smíšené reakce (Orchinik and Propper, 2006). Endokrinně disruptivní vlastnosti byly pozorovány u řady látek přírodního i antropogenního původu, v tabulce 1 jsou uvedeny jejich příklady. Jejich účinky na organismy se mohou různit podle stadia vývoje, ve kterém došlo k expozici těmto látkám. Reakce organismu mohou být také často opožděné. Pokud došlo k expozici během časných fází vývoje, nemusí se účinek projevit až do dospělosti jedince (Colborn et al., 1993) Pozornost je věnována hlavně látkám, které mohou interagovat s intracelulárními receptory. Ty po vazbě ligandu slouží jako transkripční faktory a ovlivňují tak expresi určitých genů a syntézu příslušných proteinů (Norris and Carr, 2006). 12 Tabulka 1: Příklady látek s endokrinně disruptivní aktivitou (Giesy et al., 2002) skupina látka mechanismus účinku farmaceutika tamoxifen antiestrogenní, vazba na ER, antagonista nebo agonista farmaceutika nafoxidin ER agonista farmaceutika ethynylestradiol ER agonista pesticidy insekticidy o,p'-DDT ER agonista, antiandrogennípesticidy insekticidy p,p'-DDT ER agonista, estrogenní pesticidy insekticidy endosulfan ER agonista pesticidy insekticidy chlordan ER agonista pesticidy insekticidy methoxychlor po metabolizaci ER agonista pesticidy fungicidy vinclozolin antiandrogenní pesticidy fungicidy biphenyl estrogenní pesticidy herbicidy atrazin estrogenní, antiestrogenní pesticidy herbicidy alachlor ER agonista pesticidy herbicidy tributylcín androgenní průmyslové chemikálie dibutylftalát ER agonistaprůmyslové chemikálie nonylfenol ER agonista, estrogenní průmyslové chemikálie bisfenol A ER agonista průmyslové chemikálie PCDD antiestrogenní - různé mechanismy průmyslové chemikálie PCB ER agonisté, antagonisté nebo další mechanismy (závisí na substituci) průmyslové chemikálie PAH ER agonisté - estrogenní antiestrogenní - různé mechanismy těžké kovy kadmium snížení hladiny testosteronu v plazmětěžké kovy olovo suprese biosyntézy pohlavních steroidů fytoestrogeny genistein ER agonistafytoestrogeny daidzein ER agonista, estrogenní fytoestrogeny biochanin A ER agonista, estrogenní fytoestrogeny P-sitosterol ER agonista, po metabolizaci androgenní mykoestrogeny zearalenon ER agonista 2.1.1. Endokrinní disrupce u živočichů ve volné přírodě Pozorování volně žijících živočichů, u kterých byly zjištěny změny hormonálního systému vyvolané vnějšími podmínkami, vedla vědce ke zkoumání endokrinní disrupce (Sumpter and Johnson, 2005). Tyto efekty byly pozorovány u různých taxonomických skupin. U mořských měkkýšů byl po expozici tributylcínem pozorován imposex. Při tomto jevu dochází k vyvinutí samčích pohlavních orgánů (penisu, chámovodu) u samic. Následkem imposexu pak došlo v populaci Nucella lapillus ke změně poměru pohlaví, snížení počtu juvenilů a celkově nižšímu počtu jedinců. Kromě imposexu byl u měkkýšů popsán i intersex 13 (u jedince dochází k vývoji sexuálně charakteristických znaků opačného pohlaví). V tomto případě byla pozorována modifikace orgánů u samic a jejich struktura se blížila samčím. Imposex i intersex mohou způsobovat sterilitu jedinců (Damstra et al., 2002). Další zkoumanou skupinou živočichů je hmyz. Některé insekticidy byly vytvořeny tak, aby působily na hormonální systém cílového druhu. Mohou ale působit i na další, necílové druhy. Ovlivňují svlékání a způsobují různé vývojové vady (Damstra et al., 2002). Ze skupiny obratlovců jsou v souvislosti s endokrinní disrupcí často zkoumány ryby. U těchto organismů je velmi různorodý systém determinace pohlaví (u různých skupin může záviset na chromozomech, ale i na environmentálních a sociálních faktorech) a steroidní hormony mohou s těmito procesy interferovat. Nepříznivé efekty vyvolané chemickým znečištěním prostředí byly pozorovány u obou pohlaví. Byla popsána změna poměru pohlaví, redukce hmotnosti pohlavních orgánů nebo indukce syntézy vitellogeninu u samců, často je také dokumentován intersex. Ten však byl pozorován i u ryb z oblastí s nízkou kontaminací a určitá míra tohoto efektu by mohla být přirozená. Při sledování přírodních populací je proto třeba znát tyto pozaďové hodnoty (Scholz and Kliiver, 2009). U aligátorů z jezera Apopka byla popsána řada vývojových vad, které byly spojeny s expozicí endokrinním disruptorům. Patří mezi ně abnormální vývoj pohlavních orgánů a jejich deformace, pozměněná syntéza steroidů a změna koncentrací pohlavních steroidů (snížená hladina testosteronu u samců a zvýšená hladina estradiolu u samic) (Damstra et al., 2002). Kromě těchto pozorování přírodních populací, u kterých nemusí být vždy jasný původce sledovaného efektu, byl uspořádán i dlouhodobý experiment, který hodnotil dopad ethynylestradiolu na jezerní ekosystém. Tento estrogen byl po 3 roky přidáván do jednoho jezera (výsledné koncentrace v jednotlivých letech byly 6,1 + 2,8; 5,0 + 1,8 a 4,8 + 1,0 ng/1) a dvě další jezera byla stanovena jako referenční. Po sedmi týdnech od prvního přídavku ethynylestradiolu bylo u ryb Pimephales promelas z exponovaného jezera pozorováno zvýšené množství vitellogeninu a tento efekt přetrval po celou dobu, kdy byl do jezera přidáván ethynylestradiol. U samců byly dále pozorovány poruchy spermatogeneze a vývoje varlat a objevil se u nich intersex. Na úrovni populace byl u tohoto druhu zaznamenán konstantní pokles a po dvou letech expozice došlo ke kolapsu, nevyskytovali se zde juvenilní 14 jedinci. Chronická expozice estrogenům tak vedla téměř k vyhynutí tohoto druhu ve sledovaném jezeře (Kidd et al., 2007). 2.1.2. Estrogenita Významnými hormony, které interagují s intracelulárními receptory, jsou estrogeny. Tyto látky patří mezi steroidní hormony, jejichž společným prekurzorem je cholesterol. Pří syntéze estrogenů dochází nejprve k odštěpení bočního řetězce cholesterolu a vzniku pregnenolonu. Ten se může dále dehydrogenovat na progesteron, po jehož hydroxylaci a opětovném odštěpení bočního řetězce vzniká androstendion. Alternativně může docházet k hydroxylaci a odštěpení řetězce přímo u pregnenolonu a vzniká tak dehydroepiandrosteron. Androstendion a dehydroepiandrosteron pak mohou být přeměněny na testosteron. Posledním krokem biosyntézy estrogenů je pak přeměna testosteronu na estradiol, respektive androstendionu na estron účinkem enzymu aromatázy (Ganong, 2005). Mezi estrogenní hormony se řadí estradiol, estron a estriol. Jejich zastoupení se může v organismu během života měnit. Estradiol je nejúčinnějším hormonem z této skupiny, koncentrace estronu jsou zvýšeny u žen po menopauze a estriol je ve větší míře vylučován během těhotenství (Watson et al., 2011). Estrogeny ovlivňují dělení a diferenciaci buněk, vývoj reprodukčních orgánů a sekundárních pohlavních znaků, působí ovšem i na tvorbu kostí, kardiovaskulární systém a snižují obsah lipidů v krvi. Jedná se především o ženské hormony, ale v malém množství jsou syntetizovány i u mužů (Janošek et al., 2006; Ganong, 2005). Estrogeny kolují v těle převážně vázané na specifické proteiny - albuminy a globulín vázající pohlavní hormony, pouze malá část je volná (Ganong, 2005). To zabraňuje rychlé ztrátě těchto hormonů z krve a zároveň to zaručuje jejich vyšší koncentraci (Norris and Carr, 2006). Zároveň estrogeny vázané na proteiny nemohou přecházet do buněk a interagovat s receptory (Colborn et al., 1993). Estrogenní aktivitu však mají kromě endogenních hormonů i různé další látky, které se pak označují jako xenoestrogeny. Patří mezi ně například přírodní sloučeniny, farmaceutické přípravky, průmyslové chemikálie nebo různé pesticidy (viz tabulka 1). Tyto látky mohou mít nepříznivé účinky na zdraví jedinců, jako jsou rozvoj rakoviny prsu nebo varlat, feminizace a demaskulinizace samců nebo poruchy reprodukce (Giesy et al., 2002). 15 Xenoestrogeny se také nemusí vázat na plazmatické proteiny jako endogenní hormony. Mohou pak volně vstupovat do buněk a interagovat s receptory, což může způsobit vyšší efektivitu xenoestrogenů in vivo oproti přirozeným estrogenům, které se navázané na proteiny do buněk nedostanou (Colborn et al., 1993). 2.1.2.1 Estrogenníreceptor Účinky estrogenních látek v organismu zprostředkovávají estrogenní receptory (ER), které patří do rodiny nukleárních receptoru. V buňkách působí jako transkripční faktory a regulují specifické geny (Bjôrnstrôm and Sjôberg, 2005). Mohou indukovat odpovědi nejen v reprodukčních orgánech, ale i v těch ostatních, např. v mozku, plicích, střevech, prostatě nebo kardiovaskulárním systému (Shanle and Xu, 2011). ER byly popsány u všech skupin obratlovců, u bezobratlých zatím nebyly objeveny (Lange et al., 2002). Bylo identifikováno několik subtypů ER. Ty mohou vázat ligandy i DNA s různou afinitou a jsou i jiným způsobem exprimovány v různých tkáních. U savců byly identifikovány subtypy ERa a ERp, u ryb byl navíc popsán i subtyp ERy (Sabo-Attwood et al., 2004). Ve struktuře DNA vázající domény se ERa a ERP shodují v 97 %. V doméně vázající ligand se struktura těchto subtypů shoduje jen v 59 %. Oba receptory však váží estradiol s podobnou afinitou. Nejnižší podobnost (18 %) je ve struktuře domény s aktivační funkcí, která interaguje s kofaktory (Shanle and Xu, 2011). ERy se s ostatními subtypy také z velké části shoduje v DNA vázající doméně, v ligand vázající doméně se více shoduje s ErP (Sabo-Attwood et al., 2004). Kromě nukleárních receptoru byl popsán i estrogenní receptor vázaný na G-protein (GPER). Ten se podílí na negenetických účincích estrogenů (Watson et al., 2011). Rychlá signalizace přes GPER však může regulovat i expresi genů (Prossnitz and Bartoň, 2009). 2.1.2.2. Mechanismy estrogenní odpovědi Estrogeny a xenoestrogeny interagují s ER a mohou tak v buňkách vyvolat různými mechanismy genetické a negenetické účinky. První mechanismus spočívá v přímé vazbě na DNA a regulaci transkripce specifických genů. Ligand se váže na ER a poté dochází k dimerizaci receptoru. Dimer následně interaguje se specifickou sekvencí D N A - estrogen responsivním elementem (ERE), který se nachází 16 v oblasti promotoru regulovaných genů. Zároveň dochází ke změně konformace receptoru, která umožňuje vazbu dalších koaktivátorů (Bjôrnstrôm and Sjôberg, 2005). ER mohou také interagovat s dalšími transkripčními faktory a jejich změnou regulovat transkripci genů, které neobsahují ERE. Tento mechanismus nevyžaduje přímou vazbu receptoru na DNA (Bjôrnstrôm and Sjôberg, 2005). Estrogenní odpověď může být také indukována nezávisle na ligandu. Aktivace receptoru je v tomto případě způsobena jejich fosforylací. Signalizaci ER tak mohou ovlivňovat proteinkinázy nebo různé extracelulární signály, jako jsou růstové faktory, cytokiny nebo neurotransmitery (Nilsson et al., 2001). Některé účinky estrogenů se však dostavují tak rychle, že nemohou záviset na transkripci RNA a následné syntéze proteinů. Tyto efekty se proto označují jako negenetické. Patří mezi ně mobilizace intracelulárního vápníku, stimulace aktivity adenylát cyklázy nebo aktivace signální kaskády M A P K (mitogenem aktivované proteinkinázy) (Bjôrnstrôm and Sjôberg, 2005). Estrogenní látky mohou způsobovat také komplexní odpovědi, jako jsou dělení buněk nebo jejich apoptóza (programovaná smrt buňky). Na těchto efektech se podílí genetické i negenetické mechanismy signalizace (Watson et al., 2011). Funkce ER může být také ovlivněna účinkem dalších receptoru, což se označuje jako cross-talk. Významným receptorem, který reguluje účinky ER, je arylhydrokarbonový receptor (AhR). Tento receptor a jeho ligandy mohou interagovat s estrogenní odpovědí různými mechanismy. AhR je součástí proteinového komplexu, který označuje proteiny k degradaci a funkce tohoto komplexu je zřejmě závislá na ligandu. Některé ligandy AhR tak působí antiestrogenně snížením koncentrace ER jejich degradací v proteazomu (komplex, který štěpí proteiny). AhR může také ovlivňovat metabolismus estrogenů. Enzymy, které jsou odpovědné za jejich syntézu i odstraňování jsou totiž kódovány geny, které jsou pod kontrolou AhR. K interferenci mezi těmito receptory může dojít i na DNA. Aktivovaný AhR se váže v blízkosti míst pro vazbu ER a tak negativně ovlivňuje aktivaci transkripce regulovaných genů. Kromě toho může mezi jadernými receptory docházet ke kompetici o koaktivátory (Swedenborg et al., 2009). 17 2.1.2.3. Hodnocení estrogenity K hodnocení estrogenity jsou využívány různé metody. Mohou využívat chemické analýzy nebo biologické testy, které využívají in vitro a in vivo systémy. Jednotlivé techniky mají své výhody i nevýhody, proto bývají kombinovány dohromady. In vitro biotesty Tyto testy jsou relativně rychlé, citlivé a levné. Umožňují odhad celkové biologické aktivity všech látek ve vzorku, které působí stejným mechanismem, a zahrnují i případné interakce mezi nimi (Giesy et al., 2002). Často se využívají kvasinky nebo lidské buňky. Oproti lidským buňkám nemají kvasinky žádný endogenní ER, gen pro tento receptor musí být nejprve vložen do jejich genomu (Campbell et al., 2006). Příklady buněčných linií, které se využívají pro stanovení estrogenity, jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka 2: Buněčné linie používané pro stanovení estrogenní aktivity (Janošek et al., 2006; OECD, 2009) buněčná linie původ měřený efekt BG-1 lidské buňky adenokarcinomu vaječníku aktivita liciferázy (reportérovy gen) HeLa lidské buňky karcinomu děložního čípku aktivita reportérového genu (luciferázy) KPL-1 lidské buňky karcinomu prsu proliferace MCF-7 lidské buňky karcinomu prsu proliferace, aktivita luciferázy (reportérovy gen) T47D lidské buňky karcinomu prsu proliferace, aktivita luciferázy (reportérovy gen) ZR-75 lidské buňky karcinomu prsu proliferace Mezi nej starší patří test buněčné proliferace, který je založen na ER-závislé proliferaci určitých buněčných linií (př. lidské buňky karcinomu prsu MCF-7). Sleduje se přitom inkorporace H-thymidinu do DNA, metabolická aktivita nebo se buňky barví fluorescenčními barvivy (Janošek et al., 2006). Pro hodnocení estrogenní aktivity bylo také vytvořeno několik testů založených na aktivaci reportérového genu. Po vazbě ligandu na ER dochází k dimerizaci receptoru, dimer poté interaguje s ERE reportérového genu a indukuje jeho transkripci. Následně dochází k syntéze kódovaného proteinu/enzymu, jehož množství je na konci testu měřeno. Takto se využívají 18 např. enzymy luciferáza a P-galaktosidáza nebo zelený fluorescenční protein (Campbell et al., 2006; Janošek et al, 2006). Z hodnot získaných pří těchto testech lze vyjádřit relativní estrogenní potence jednotlivých látek jako podíl EC50 17P-estradiolu a EC50 dané látky (Oziol and Bouáícha, 2010). Příklady látek a jejich relativních potencí jsou uvedeny v tabulce 3. Tabulka 3: Relativní estrogenní potence látek určené v in vitro testu na buňkách M V L N (linie odvozená od buněk MCF-7) (Gutendorf and Westendorf, 2001) látka relativní potence 17P-estradiol 1 estriol 0,083 estron 0,01 ethynylestradiol 1,25 nonylfenol 1,25 x 10"5 bisfenol A 2,5 x 10"5 genistein 1,32 x 10"4 P-sitosterol 1,0 x 10"4 tamoxifen 8,33 x 10"6 In vitro testy však nezahrnují kinetiku a biotransformaci testovaných látek a jejich distribuci v různých tkáních. Také neidentifikují látky, jejichž aktivita je nezávislá na ER (Giesy et al., 2002). In vivo biotesty Testy in vivo využívají celých organismů. Jejich výhodou je, že poskytují celkový účinek testované látky na daný druh a postihují všechny možné mechanismy účinku. Tyto testy jsou zaměřeny hlavně na poškození reprodukčního systému. Patří sem např. uterotrofické testy nebo testy vaginální kornifikace, které se provádějí na hlodavcích. Dalšími parametry, které mohou být sledovány in vivo u vejcorodých živočichů (ryby, obojživelníci, plazi, ptáci, někteří savci, ale i bezobratlí), jsou produkce vitellogeninu (žloutkový protein) a proteinů zona radiata (obal vajíčka). Syntéza těchto proteinů je indukována estrogeny. Normálně jsou tvořeny u samic během oogeneze, jejich produkce samci je spojena s expozicí estrogenním látkám (Janošek et al., 2006). 19 Nevýhodou in vivo testů je jejich časová a finanční náročnost. Také jsou s nimi spojeny etické problémy. V současné době je snaha uplatňovat princip tří R (replacement, reduction, refinement). Ten zahrnuje nahrazování testů s živými obratlovci metodami, které využívají necítící materiál (replacement), snižování počtu zvířat nutných pro získání požadované informace (reduction) a snižování četnosti a vážnosti nehumánního zacházení se zvířaty, která musí být při testování použita (refinement) (Smith, 2001). V souladu s tímto principem se používají in vitro testy pro screening estrogenní aktivity zprostředkované vazbou na ER u jednotlivých látek nebo komplexních vzorků (Janošek et al., 2006). Chemické analýzy Známé xenoestrogeny mohou být sledovány chemickými analytickými metodami, které mohou využívat např. kapalinovou a plynovou chromatografii s hmotnostní detekcí nebo techniky založené na imunologické reakci (ELISA) (Campbell et al., 2006). Umožňují zjistit přesnou koncentraci stanovovaných látek. Pokud jsou z biologických testů známy relativní potence těchto látek, mohou být jejich koncentrace přepočítány na estrogenní ekvivalent (EEQ) podle následujícího vzorce (Gutendorf and Westendorf, 2001): Nevýhodou však je, že sledují pouze omezené množství sloučenin, ke kterým jsou dostupné standardy a jejichž biologická aktivita musí být předem známá. Navíc nepostihují interakce mezi jednotlivými látkami. Naměřené hodnoty pak nemusí korelovat s biologickou aktivitou (Schlenk et al., 2012; Tang et al., 2012). 2.1.2.4. Estrogenita povrchových vod Přítomnost estrogenních látek v povrchových vodách byla zaznamenána už v 80. letech 20. století. Za jejich hlavní zdroje jsou považovány odpadní vody z průmyslu a domácností (Miěge et al., 2009). Rada studií se proto orientovala na měření estrogenity u výpustí čistíren odpadních vod. Na těchto lokalitách byla zjištěna vyšší estrogenní aktivita, která se snižovala se vzdáleností od výpusti (Miěge et al., 2009). Zároveň však byla nízká aktivita zjištěna i na místech, která byla vybrána jako referenční a kde nebyl předpokládán vliv čistíren (Sellin et al, 2009). EEQ= relativní potence x koncentrace látky 20 Estrogenní aktivita byla měřena i na dalších lokalitách. V sanfranciském zálivu, kde byl pozorován i úbytek rybích populací, je tato aktivita zřejmě účinkem směsi pesticidů s alkylfenoly a alkylfenolethoxyláty (Schlenk et al., 2012). In vitro estrogenita spolu s chemickou analýzou 4 estrogenů byla také měřena na 9 lokalitách v povodí řeky Tiaoxi. Jedinou detekovanou látkou byl estron, který byl zjištěn ve 4 vzorcích. Biologickou aktivitu však vykazovaly všechny vzorky (Tang et al., 2012). 2.1.3. Ovlivnění dalších hormonálních drah Kromě estrogenů mohou endokrinní disruptory narušovat i signalizaci dalších hormonů (např. androgenů, thyroidních hormonů nebo retinoidů) a způsobovat tak nepříznivé efekty u exponovaných organismů. S estrogeny jsou úzce spjaty androgeny. Hlavní endogenní androgen, testosteron může být účinkem enzymu aromatázy přeměněn na estradiol. Také jejich účinky u samců jsou obdobné jako účinky estrogenů u samic (Janošek et al., 2006). Příklady látek s anti/androgenními účinky jsou uvedeny v tabulce 1. V závislosti na vývojové fázi organismu během expozice mohou tyto látky způsobovat u samců např. malformace pohlavních orgánů nebo oligospermii (snížený počet spermií) (Janošek et al., 2006). Thyroidní hormony trijodthyronin a thyroxin významně ovlivňují metabolismus organismů, růst a vývoj některých tkání (př. pohlavní orgány, kosti) a působí také na aktivitu dalších hormonů, např. inzulínu, glukagonu nebo adrenalinu. Nízké koncentrace těchto hormonů mohou vést k vážnému poškození nervového systému (Janošek et al., 2006). Retinoidy kontrolují růst, apoptózu a diferenciaci buněk embryí, ovlivňují nervový a imunitní systém a působí jako antioxidanty. Snížené množství těchto látek zvyšuje riziko rakoviny (Janošek et al., 2006). Ve vyšších dávkách však působí jako teratogeny (Inoue et al., 2010). 2.2. SINICE A ŘASY Sinice i řasy patří mezi fotoautotrofní organismy, které ve vodním prostředí vytvářejí společenství fytoplanktonu. Ve vodních ekosystémech plní roli primárních producentů, zachycenou sluneční energii váží ve formě biomasy a tvoří základ potravních řetězců. Tyto dvě skupiny organismů tedy plní podobnou funkci, výrazně se ovšem liší stářím a stavbou buněk. 21 Stáří sinic se odhaduje nejméně na 2,7 miliardy let (Palmer, 2000). Patří mezi prokaryotní organismy, řadí se mezi gramnegativní bakterie. Jejich buňky tedy neobsahují žádné organely a nemají ani cytoskelet. Buněčná stěna je složena z peptidoglykanu a lipoproteinů. Fotosyntéza probíhá v thylakoidech, což jsou ploché měchýřky uložené v cytoplazmě. Thylakoidy obsahují fotosyntetické pigmenty (chlorofyl a, P-karoten, zeaxantin, echinenon, kantaxatin a myxoxantofyl). Na jejich povrchu jsou u většiny sinic fykobilizomy světlosběrné antény, které obsahují další pigmenty (allofykocyanin, fykocyanin a fykoerytrin). Buňky některých druhů navíc obsahují plynové měchýřky (aerotopy), které je ve vodě nadnášejí a umožňují jim setrvat v optimální hloubce. Některé druhy mohou také ve specializovaných buňkách - heterocytech - vázat vzdušný dusík. Dalšími specializovanými buňkami, které se u sinic mohou vyskytovat, jsou akinety. To jsou spory, které umožňují prezimovaní některých druhů vláknitých sinic (Kalina a Váňa, 2005). Oproti tomu řasy jsou vývojově mladší, jejich fosilie pochází z doby před 2,1 miliardami let (Palmer, 2000). Mají již eukaryotickou buňku, která obsahuje jednotlivé organely (př. jádro, chloroplasty, vakuoly, mitochondrie). Mitochondrie a chloroplasty vznikly endosymbiózou prokaryotních buněk. Základem buněčné stěny řas jsou polysacharidy (nejčastěji celulóza). Fotosyntéza probíhá v chloroplastech, kde jsou také přítomny fotosyntetické pigmenty (chlorofyly a+b, P-karoten, lutein, zeaxantin, violaxantin, anteraxantin a neoxantin). Na rozdíl od sinic mohou mít buňky řas bičíky, které jim umožňují pohyb (Kalina a Váňa, 2005). 2.2.1. Systematické rozdělení sinic Sinice se řadí do impéria Prokarya, říše Bakterie (Bacteria), oddělení Sinice (Cyanobacteria). Toto oddělení zahrnuje jedinou třídu Cyanophyceae, která pak obsahuje 4 řády. Do nich se řadí asi 150 rodů a 2000 druhů (Kalina a Váňa, 2005). Řád Chroococcales Tento řád zahrnuje jednobuněčné sinice s kulovitými, elipsoidními a vejčitými buňkami. Patří sem např. rod Microcystis (obrázek 1), který tvoří nepravidelné kolonie buněk v amorfním slizu (Kalina a Váňa, 2005) Obrázek 1: Microcystis (640x) 22 Řád Oscillatoriales Sinice řádu Oscillatoriales jsou vláknité, nevětvené a bez heterocytů a akinet. Některé druhy jsou schopny drkavého pohybu. Do tohoto řádu patří rod Planktothrix (obrázek 2), jehož buňky jsou bez aerotopů (Kalina a Váňa, 2005). Řád Nostocales Obrázek 2: Planktothrix (640x) Sem se řadí vláknité sinice, u kterých se často tvoří heterocyty a akinety. Vlákna jsou nevětvená nebo s nepravým větvením, bývají uložena ve slizu a mohou se vyskytovat jednotlivě nebo v koloniích (Kalina a Váňa, 2005). Mezi významné zástupce patří Anabaena a Aphanizomenon, do tohoto řádu patří také rody Cuspidothrix, Cylindrospermopsis, Dolichospermum a Sphaerospermum (obrázek 3) (UniProt Taxonomy, [online]). Obrázek 3: Sinice a) Anabaena, b) Aphanizomenon, c) Cuspidothrix, d) Cylindrospermopsis, e) Dolichospermum, f) Sphaerospermum (640x) Řád Stigonematales Tyto sinice jsou vláknité s pravým větvením a tvoří heterocyty. Vlákna mají slizovité pochvy, které jsou často hnědavě zbarvené (Kalina a Váňa, 2005). 23 2.2.2. Systematické rozdělení řas Rasy se řadí do impéria Eukarya, říše Rostliny (Plantae), podříše Zelené rostliny (Viridiplantae), oddělení Zelené řasy (Chlorophyta). Toto oddělení se pak dělí na 8 tříd, kam se řadí přibližně 500 rodů a 8000 druhů (Kalina a Váňa, 2005). Třída Prasinophyceae Tato třída zahrnuje volně žijící bičíkovce a v menší míře i kokální řasy. Mohou se vyskytovat v mořských, brakických i sladkých vodách (Kalina a Váňa, 2005). Třída Ulvophyceae Do této třídy patří převážně řasy mořské a brakické. Známým zástupcem je rod Ulva, který vytváří masivní nárosty v mělkých mořích (Kalina a Váňa, 2005; Anderson et al, 2002). Třída Cladophorophyceae Tyto řasy mohou růst ve sladkých, brakických i mořských vodách, některé druhy i na povrchu vlhké půdy (Kalina a Váňa, 2005). Rod Cladophora patří mezi nejrozšířenější zelené řasy (Kalina a Váňa, 2005), v mořích může vytvářet vodní květy (Anderson et al., 2002). Třída Bryopsidophyceae Do této třídy se řadí řasy, které rostou pouze v teplých mořích. Mezi zástupce patří rod Caulerpa, jehož druhy často porůstají dno hustým porostem (Kalina a Váňa, 2005) Třída Dasycladophyceae Zástupci této třídy rostou v mělkých mořích subtropické a tropické oblasti. Jejich největší rozvoj byl před 250 - 55 miliony let (Kalina a Váňa, 2005). Třída Trentepohliophyceae Tyto řasy se vyskytují v mírném pásu a vlhkých tropech, rostou na aerických substrátech např. na skálách, zdivu nebo listech jiných rostlin (Kalina a Váňa, 2005). 24 Třída Trebouxiophyceae Sem patří jednobuněčné a vláknité řasy s jednojadernými buňkami. Často žijí symbioticky v lišejnících, ale patří sem i řasy terestrické, aerofytické a sladkovodní. Mezi zástupce patří rod Chlorella (obrázek 4) (Kalina a Váňa, 2005). Obrázek 4: Chlorella (400x) Třída Chlorophyceae Tato třída zahrnuje volně žijící bičíkovce a jednobuněčné a vláknité řasy. Některé druhy mohou tvořit kolonie obklopené společným slizem. Zvláštním útvarem, který mohou některé druhy vytvářet, je cenobium - celek s často geometrickým uspořádáním vzniklý z určitého počtu (2n ) buněk jedné generace. Tyto řasy se vyskytují převážně ve sladkých vodách, menší část žije v brakických. Radí se sem rody Ankistrodesmus, Chlamydomonas a Scenedesmus (obrázek 5) (Kalina a Váňa, 2005). Obrázek 5: Řasy a) Ankistrodemus, b) Chlamydomonas, c) Scenedesmus (400x) 2.2.3. Eutrofizace a masivní rozvoje Eutrofizace je proces, při kterém dochází ke zvyšování koncentrace anorganických živin (zejména fosforu a dusíku) ve vodních ekosystémech a který může mít přírodní nebo antropogenní příčiny. Přírodní eutrofizace je spojena se stárnutím ekosystému a uvolňováním živin z půdy, sedimentů a odumřelých organismů. Tento proces je však urychlen přísunem živin z antropogenních zdrojů jako jsou odpadní vody, aplikace hnojiv v zemědělství, krmiva z chovů ryb nebo atmosférické depozice částic původem z průmyslu, zemědělství nebo měst. Vyšší množství živin může zapříčinit masivní rozvoj sinic a řas (Anderson et al., 2002). Jako vodní květ se pak označuje hromadné přemnožení sinic nebo řas, které je viditelné pouhým okem (Znachor, 2005). 25 V České republice se vodní květy vyskytují až v 80 % velkých vodních nádrží. Dominantním druhem bývá Microcystis aeruginosa, vodní květy vláknitých sinic Anabaena, Planktothrix a Aphanizomenon, dříve poměrně časté, jsou dnes spíše výjimečné (Znachor, 2005). M. aeruginosa byl dokumentován jako dominantní druh i v dalších státech Evropy (Německo, Řecko, Turecko), ale v ostatních částech světa to mohou být i jiné rody. V Austrálii jsou to např. Anabaena, Microcystis a Cylindrospermopsis, na jihozápadě USA je to hlavně Planktothrix (Bláhová et al., 2007). Vodní květy mohou působit negativně na okolí různými mechanismy. Velké množství biomasy ve vodním sloupci může způsobit stínění vegetace na dně. Také dochází ke změně biodiverzity a zastoupení jednotlivých organismů (Anderson et al., 2002). Na konci vegetační sezony pak působí problémy hromadný rozklad velkého množství přítomné biomasy. Rozkladné procesy z vody odčerpávají kyslík a vzniká tak anoxické prostředí, které může vést k úhynu vodních živočichů. Na okolní organismy mohou také negativně působit produkty rozkladu, např. amoniak (Sivonen and Jones, 1999). Sinice a řasy však mohou produkovat i řadu sekundárních metabolitů, které nepříznivě ovlivňují ostatní organismy. Tyto látky mohou dosahovat efektivních koncentrací právě během masivních rozvojů, případně během rozkladu biomasy, kdy dochází k jejich uvolnění z rozkládajících se buněk. 2.2.4. Metabolity sinic a řas Některé z metabolitů produkovaných sinicemi a řasami jsou skladovány uvnitř buněk a do okolí se dostávají až po jejich lýzi. Takové látky se označují jako intracelulární. Ostatní organismy jim mohou být vystaveny během odumírání a rozkladu biomasy nebo po její konzumaci. Pro hodnocení toxicity těchto intracelulárních metabolitů se často využívají extrakty biomasy. Některé metabolity ale mohou být buňkami aktivně vylučovány do okolí během jejich života. Ty se pak označují jako extracelulární metabolity nebo také exudáty a patří mezi méně často testované látky. Pro tvorbu intra- i extracelulárních metabolitů platí, že jeden druh může produkovat více různých látek (např. Anabaena flos-aquae tvoří jak anatoxin-a(s), tak několik strukturních variant microcystinů) a jedna látka může být produkována více různými druhy (např. microcystin-LR je syntetizován sinicemi Microcystis aeruginosa, Microcystis viridis 26 aAnabaena flos-aquae) (Sivonen and Jones, 1999). Ekologická funkce těchto metabolitů většinou není známa. Předpokládá se, že mohou hrát roli při skladování dusíku, ochraně před UV zářením, chelataci kovů, obraně před herbivory, alelopatických interakcích nebo při quorum sensing (signalizace velikosti koncentrace buněk) (Leáo et al., 2010). Sekundární metabolity sinic a řas zahrnují sloučeniny s rozličnou chemickou strukturou. Mohou to být např. různé peptidy, alkaloidy, terpenoidy nebo deriváty běžných aminokyselin. Biosyntéza těchto látek může probíhat různými cestami, často se na ní podílí enzymy neribozomální peptidsyntázy (především u sinic) a polyketidsyntázy (Maschek and Baker, 2009). Jejich tvorba také může být ovlivněna řadou vnějších faktorů, jako jsou např. teplota, množství světla nebo množství živin (Sivonen and Jones, 1999). Nejčastěji studovanými metabolity sinic jsou microcystiny (Bláhová et al., 2007). Jedná se o cyklické heptapeptidy (chemická struktura na obrázku 6a), které působí hepatotoxicky. Jejich specifickým mechanismem působení je inhibice proteinfosfatáz. Microcystiny mohou být produkovány sinicemi rodu Microcystis, Anabaena, Anabaenopsis, Planktothrix, Nostoc nebo Hapalosiphon a řada z těchto rodů také tvoří vodní květy (Sivonen and Jones, 1999). V České republice byly pomocí metody ELISA microcystiny zjištěny ve 145 z 206 vzorků vod odebraných z 94 lokalit v roce 2004. Jejich koncentrace dosahovala až 37 ug/1, mediánová koncentrace byla 0,67 ug/1 (Bláhová et al., 2007). Koncentrace v biomase však mohou být i tisíce ug/g sušiny (Sivonen and Jones, 1999). Sinice mohu produkovat také neurotoxické látky. Patří mezi ně anatoxiny a saxitoxiny. Anatoxin-a (struktura na obrázku 6b) a jeho homolog homoanatoxin-a jsou alkaloidy, které napodobují účinky acetylcholinu. Produkce těchto látek byla zaznamenána u rodů Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermum a Oscillatoria. Saxitoxiny jsou také alkaloidy, blokují otevírání sodíkových kanálů nervových buněk. Byly detekovány u sinic rodu Aphanizomenon, Anabaena, Lyngbya a Cylindrospermopsis. Zvláštní strukturu má anatoxin-a(s), jedná se o organofosfát (viz obrázek 6c). Tento toxin inhibuje enzym acetylcholinesterázu. Jeho syntéza byla zjištěna jen u dvou druhů rodu Anabaena (Sivonen and Jones, 1999). Dalším známým alkaloidem produkovaným sinicemi je cylindrospermopsin (struktura na obrázku 6d). Má však jiný mechanismus účinku než předchozí látky - působí cytotoxicky, inhibuje biosyntézu proteinů. Jeho produkce byla zdokumentována u rodů 27 Cylindrospermopsis, Umezakia, Aphanizomenon, Anabaena a Rhaphidiopsis (Wiegand and Pflugmacher, 2005). V České republice byla jeho přítomnost ve vodě zjištěna na 3 lokalitách. Maximální koncentrace zjištěná pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí byla 0,14 ug/1 (Bláhová et al., 2009). Koncentrace v biomase mohou podobně jako u microcystinů dosahovat i tisíců ug/g sušiny (Sivonen and Jones, 1999). Dalšími známými metabolity sinic s bioaktivními účinky jsou např. fischerellin A, který inhibuje fotosyntézu (Srivastava et al., 1998), calothrixin A, který potlačuje syntézu RNA a DNA (Doan et al., 2000) nebo různé peptidy, které inhibují proteázy (Welker and von Dohren, 2006). Obrázek 6: Struktura a) microcystinu-LR, b) anatoxinu-a, c) anatoxinu-a(s) a d) cylindrospermopsinu (Wiegand and Pflugmacher, 2005) Rasové metabolity nejsou zkoumány tak intenzivně jako metabolity sinic, navíc často není známa chemická struktura těchto látek. Mohou ale také vykazovat různou biologickou aktivitu. Mezi jejich pozorované účinky patří inhibice tvorby heterocytů sinic (Kearns and Hunter, 2002), zvýšení produkce toxinů sinicemi (Kearns and Hunter, 2000) nebo ovlivnění růstu jiných druhů fytoplanktonu (DellaGreca et al., 2010). 28 2.2.4.1. Endokrinně disruptivnípotenciál metabolitů sinic Metabolity sinic však mohou mít i další efekty. U microcystinu-LR (MC-LR) a nodularinu-R (NOD-R) byla sledována estrogenní aktivita v in vitro testu s buněčnou linií M E L N (odvozena z lidských buněk karcinomu prsu). Obě tyto látky indukovaly estrogenní odpověď. U NOD-R byla patrná křivka dávka - odpověď (rozsah koncentrací 2-120 ug/1) a stanovená relativní potence byla 1,45 x 10"4 . MC-LR také indukoval statisticky významnou odpověď (rozsah koncentrací 2 - 6 0 ug/1), pří vyšších koncentracích ale došlo k jejímu snížení. To mohlo být způsobeno cytotoxicitou. Vzhledem k mechanismu působení těchto látek se předpokládá, že jejich estrogenní aktivita je zprostředkována ovlivněním fosforylace ER (Oziol and Bouáícha, 2010). Další známý metabolit, cylindrospermopsin, inhiboval tvorbu progesteronu v lidských folikulárních buňkách (testované koncentrace 0,0625 - 1 mg/l). To může mít za následek narušení poměru koncentrací progesteronu a estrogenu a narušení reprodukce (Young et al., 2008). Vbiomase sladkovodní sinice rodu Nostoc byly také identifikovány některé isoflavony (koncentrace v desítkách ng/g), které jsou známými fytoestrogeny (Klejdus et al., 2010). Štěpánková et al. (2011) zkoumali estrogenní aktivitu pěti extraktů biomasy laboratorních druhů sinic a pěti reálných vzorků vodních květů (v koncentracích 0,0078 - 1 g sušiny/l) pomocí in vitro testu na buněčné linii M V L N (odvozena od lidských buněk karcinomu prsu). Z laboratorních kultur vykazoval pouze extrakt sinice Planktothrix agardhii významnou estrogenní aktivitu se závislostí na dávce. Sledované efekty nelze vysvětlit pouze obsahem microcystinů. Extrakt biomasy Microcystis aeruginosa jich obsahoval přibližně dvakrát více než extrakt P. agardhii, ale způsoboval jen asi poloviční efekty. U reálných vzorků byla estrogenní aktivita zjištěna u čtyř z pěti testovaných extraktů, přičemž jejich účinky nekorelovaly se zjištěnou koncentrací microcystinů. Estrogenitu extraktů laboratorních druhů (v rozsahu koncentrací 0,001 - 0,25 g sušiny/l) hodnotili i Sychrová et al. (2012). Ze sedmi druhů sinic indukoval estrogenní odpověď (až 300 % maximální odpovědi estradiolu) pouze druh Aphanizomenon gracile, který v předchozí studii způsoboval pouze maximálně 20% efekt. Kromě extraktů byla sledována i in vitro estrogenní aktivita exudátů sinic (Sychrová et al., 2012). Bylo testováno sedm druhů (rozsah zakoncentrování 0,5 - lOx) a kromě jednoho (Aphanizomenonflos-aquae)byly všechny exudáty estrogenní. 29 Estrogenita sinic byla pozorována také in vivo. Rogers et al. (2011) porovnávali expresi genů u ryb Danio rerio exponovaných po dobu 96 hodin čistému MC-LR (100 a 1000 ug/1) a lyofilizovaným buňkám sinice Microcystis aeruginosa (50 mg/l) ve vodě. Některé geny byly ovlivněny MC-LR i buňkami sinic, ale jiné byly ovlivněny jen u jedné z těchto variant. Pouze u rybek exponovaných buňkám sinic došlo k výraznému zvýšení exprese genů pro vitellogenin oproti kontrole, u varianty exponované čistým MC-LR nedošlo k žádným výrazným efektům na expresi těchto genů. Indukce syntézy vitellogeninu byla pozorována i v rybách Oryzias latipes, kterým byl zaveden extrakt biomasy sinice Planktothrix agardhii do žaludku (5 ul extraktu, odpovídalo 10 mg sušiny) a které byly 2 hodiny po zavedení roztoku usmrceny (Marie et al., 2012). U různých druhů organismů bylo pozorováno, že metabolity sinic mohou mít toxické účinky na jejich reprodukční orgány. Ve varlatech ryb Oryzias latipes exponovaných 30 dní rozpuštěnému MC-LR (5 ug/1) ve vodě nebyly pozorovány žádné statisticky významné změny. Oproti tomu u vaječníku byla pozorována celkově menší plocha orgánu a nižší produkce vajíček (Trinchet et al., 2011). U křepelek (Coturnix coturnix japonica) vystavených biomase sinic v krmení po dobu 8 týdnů (s odpovídající dávkou 61,62 ug microcystinů na den na jedince) byly také pozorovány změny reprodukčních orgánů. Ve varlatech ptáků, kteří byli krmeni sinicemi, došlo k vážnému poškození tkání semenotvorných kanálků a redukci vývojových stadií spermií (Damkova et al., 2011). U myší, kterým byl 14 dní intraperitoneálně vpravován extrakt sinice Microcystis aeruginosa (dávka 3,33 nebo 6,67 ug microcystinů/kg tělesné hmotnosti), byl pozorován úbytek hmotnosti varlat a snížení životnosti spermií (Ding et al., 2006). I u potkanů, exponovaných 28 dní intraperitoneálně MC-LR (5, 10 a 15 ug/kg tělesné hmotnosti), byla zjištěna nižší relativní hmotnost varlat a nižší koncentrace a pohyblivost spermií (Li et al., 2008a). Mezi významné konzumenty sinic patří sladkovodní plži, u kterých byly také pozorovány účinky metabolitů sinic na rozmnožování. U plovatky (Lymnaea stagnalis) byla pozorována kompletní inhibice reprodukce během pěti týdnů, kdy byli jedinci krmeni biomasou sinice Planktothrix agardhii (koncentrace 200 000 buněk/ml) a reprodukce nebyla obnovena ani během následující třítýdenní detoxikace. Na pohlavních orgánech ovšem nebyly pozorovány žádné změny ve struktuře a z experimentu není jasné, zda k inhibici reprodukce došlo v důsledku ovlivnění hormonální aktivity nebo přesunutím energie na detoxikaci (Laňce et al., 2007). Podobně (koncentrace sinice 100 000 buněk/ml) byli exponováni i písečníci 30 (Potamopyrgus antipodarum), u kterých byla po pěti týdnech expozice pozorována snížená fekundita (udávaná jako počet embryí na samici). Po dalších třech týdnech detoxikace už ale nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl v počtu embryí u kontrolní skupiny a skupiny krmené biomasou sinic (Laňce et al., 2008). Kromě estrogenní aktivity byl zkoumán potenciál extraktů biomasy sinic interagovat s dalšími intracelulárními receptory. Z pěti sledovaných extraktů žádný nevykazoval významnou dioxinovou, androgenní, glukokortikoidní ani anti/retinoidní aktivitu (rozsah koncentrací 0,0078 - 1 g sušiny/l) (Štěpánková et al., 2011). Retinové a 4-oxo-retinové kyseliny ovšem byly analyticky identifikovány ve vzorcích extraktů biomasy 32 z 39 studovaných laboratorních kultur sinic a řas (až tisíce ng/g sušiny) (Wu et al., 2012). Dalším sledovaným efektem metabolitů sinic na endokrinní systém živočichů byly změny koncentrací thyroidních hormonů. U ryb Carassius auratus, kterým byly intraperitoneálně vpraveny extrahované microcystiny (150 a 600 ug/kg tělesné hmotnosti), došlo během 48 hodin k poklesu plazmatického trijodthyroninu a thyroxinu a tento pokles byl závislý na dávce microcystinů (Li et al, 2008b). Účinky MC-LR (100, 300 a 500 ug/1) na thyroidní hormony byly zkoumány i u embryí ryb Danio rerio. Po 96hodinové expozici microcystinů ve vodě došlo u ryb v nejvyšší testované dávce také k významnému poklesu koncentrace trijodthyroninu a thyroxinu a byla u nich pozorována i redukovaná délka těla (Yan et al., 2012). 2.2.4.2. Endokrinně disruptivnípotenciál metabolitů řas Stejně jako u sinic i extrakty a exudáty řas mohou mít estrogenní potenciál. Sychrová et al. (2012) zkoumali dvě řasy (Chlorella Kessleri a Scenedesmus quadricauda) a u obou zjistili estrogenní aktivitu jak exudátu (rozsah zakoncentrování 0,5 - lOx), tak extraktu (koncentrace 0,001 - 0,25 g sušiny/l). Pří chemických analýzách byly v biomase sladkovodních řas Scenedesmus a Spongiochloris spongiosa zjištěny nízké koncentrace (jednotky ng/g) známých fytoestrogenů a tyto koncentrace byly ve většině případů nižší než v biomase sladkovodní sinice Nostoc (Klejdus et al, 2010). 31 3. MATERIÁLY A METODY 3.1. DESIGN EXPERIMENTŮ Experimentální část se skládá ze dvou celků. První je věnován hodnocení vnitrodruhové variability produkce látek s estrogenními účinky a druhý pak analýze mezidruhové variability produkce těchto látek. 3.1.1. Vnitrodruhová variabilita Druhy, které byly vybrány pro hodnocení vnitrodruhové variability estrogenní aktivity exudátů, jsou uvedeny v tabulce 4. Každý druh byl kultivován vždy v pěti opakováních při dvou různých typech osvětlení (vyšší- 3000 lx a nižší - 2300 lx). Každá baňka (každé opakování) byla následně samostatně zpracovávána a testována. Tabulka 4: Druhy sinic a řas vybrané pro hodnocení vnitrodruhové variability estrogenní aktivity exudátů číslo kultura sbírka1 identifikační číslo původ číslo kultura sbírka1 identifikační číslo stát lokalita sinice 1 Aphanizomenon gracile RCX 06 Irsko jezero Lough Neagh 2 Microcystis aeruginosa PCC 7806 Nizozemsko nádrž Braakman řasy 3 Scenedesmus quadricauda CCALA 463 Německo Greifswald 1 názvy jednotlivých sbírek: CCALA: Culture Collection of Autotrophic Organisms (Třeboň, Česká republika) PCC: The Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria (Paříž, Francie) RCX: RECETOX Culture Collection of Cyanobacteria and Algae (Brno, Česká republika) 3.1.2. Mezidruhová variabilita Druhy vybrané pro hodnocení mezidruhové variability produkce látek s estrogenními účinky jsou uvedeny v tabulce 5. Jednotlivé druhy byly kultivovány vždy při jednotném osvětlení (odpovídalo vyššímu osvětlení při sledování vnitrodruhové variability - 3000 lx) ve čtyřech opakováních, ze kterých byl následně vytvořen jeden směsný vzorek. Systematické zařazení a fotky kultivovaných rodů jsou uvedeny v kapitolách 2.2.1. Systematické rozdělení sinic a 2.2.2. Systematické rozdělení řas. Veškeré fotky 32 organismů uvedené v této práci byly vyfoceny pomocí mikroskopu Zeiss Axio.imager (zvětšení 400x - 640x, objektiv 40) a jsou součástí sbírky na pracovišti Centra. Tabulka 5: Druhy sinic a řas vybrané pro hodnocení mezidruhové variability estrogenní aktivity exudátů číslo kultura sbírka1 identifikační číslo původ rok izolace číslo kultura sbírka1 identifikační číslo stát lokalita rok izolace sinice 1 Anabaena flos-aquae UTEX 1444 USA Mississippi 1964 2 Aphanizomenon gracile RCX 06 Irsko jezero Lough Neagh - 3 Aphanizomenon klebahnii CCALA 009 Velká Británie nádrž Queen Elizabeth - 4 Cuspidothrix issatchenkoi JČU - Česká republika nádrž Hostivař 2009 5 Cylindrospermopsis raciborskii SAG 1.97 Maďarsko jezero Balaton 1984 6 Dolichospermum mendotae JČU - Česká republika rybník Cerniš 2004 7 Microcystis aeruginosa PCC 7806 Nizozemsko nádrž Braakman 1972 8 Microcystis aeruginosa UTEX 2667 Kanada jezero Little Rideau 1954 9 Microcystis ichtyoblabe JČU - Česká republika nádrž Lipno 2010 10 Planktothrix agardhii CCALA 159 Německo jezero Plussee - 11 Sphaerospermum aphanizomenoides JČU - Česká republika rybník Svět 2004 fasy 12 Ankistrodesmus falcatus CCALA 211 - - - 13 Chlamydomonas reinhardtii CCALA 928 USA Massachusetts - 14 Chlorella kessleri CCALA 253 Rusko Moskva - 15 Scenedesmus quadricauda CCALA 463 Německo Greifswald názvy jednotlivých sbírek: CCALA: Culture Collection of Autotrophic Organisms (Třeboň, Česká republika) JČU: sbírka sinic na Jihočeské univerzitě (České Budějovice, Česká republika) PCC: The Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria (Paříž, Francie) RCX: sbírka řas a sinic Centra pro výzkum toxických látek v prostředí (Brno, Česká republika) SAG: Culture Collection of Algae at the University of Goettingen (Goettingen, Německo) UTEX: The Culture Collection of Algae at The University of Texas at Austin (Austin, USA) 33 3.2. KULTIVACE ŘAS A SINIC Ke kultivaci všech druhů sinic a řas bylo použito ZBB médium - směs Zehnder média a Bristol modifikovaného Bold média v poměru 1:1. Složení těchto médií je uvedeno v tabulce 6 (Zehnder médium) a tabulce 7 (Bristol modifikované Bold médium). ZBB médium bylo uchováváno v chladu jako 200% zásobní roztok, který byl před použitím zředěn destilovanou vodou v poměru 1:3 a sterilizován v autoklávu. Tabulka 6: Složení Zehnder média zásobní roztok koncentrace zásobního roztoku objem přidávaný do 11200% média 1 NaN03 46,7 g/l 10 ml 2 Ca(N03 )2 .6H2 0 5,9 g/l 10 ml 3 K2 HP04 3,1 g/l 10 ml 4 MgS04 .7H2 0 2,5 g/l 10 ml 5 Na2 C03 2,1 g/l 10 ml 6 Fe - EDTA do 500 ml 10 ml FeCl3 .6H2 0 0,138 mg v 5 ml 0,1NHC1 Chelaton III 0,186 mg v 5 ml 0,1NHC1 7 stopové prvky podle Gaffrona do 100 ml 0,08 ml NiS04(NH4)2S04.6H20 19,8 mg V2 04 (S04 )3 .16H2 0 3,1 mg (NH4 )6 Mo7 02 4 .4H2 0 8,8 mg ZnS04 .7H2 0 28,7 mg Cd(N03 )2 .4H2 0 15,4 mg A12 (S04 )3 K2 S04 .24H2 0 47,4 mg Na2 W04 .2H2 0 3,3 mg KBr 11,9 mg H3 B03 31 mg MnS04 .4H2 0 223 mg Cr(N03 )3 .7H2 0 3,70 mg Co(N03 )2 .H2 0 14,6 mg KI 8,3 mg CuS04 .5H2 0 12,5 mg 34 Tabulka 7: Složení Bristol modifikovaného Bold média zásobní roztok koncentrace zásobního roztoku objem přidávaný do 11200% média 1 NaN03 25 g/l 10 ml 2 CaCl2 .2H2 0 2,5 g/l 10 ml 3 K2 HP04 7,5 g/l 10 ml 4 KH2PO4 17,5 g/l 10 ml 5 MgS04 .7H2 0 7,5 g/l 10 ml 6 NaCl 2,5 g/l 10 ml 7 EDTA 5 g/100 ml 1 ml 8 H 3 B O 3 1,142 g/100 ml 1 ml 9 FeS04 .7H2 0 do 100 ml 1 ml FeS04 .7H2 0 0,498 g H2 S04 konc. 0,1 ml 10 mikroprvky do 100 ml 1 ml ZnS04 .7H2 0 0,882 g MnCl2 .4H2 0 0,144 g Na2 Mo04 .2H2 0 0,242 g nebo M0O3 0,071 g CuS04 .5H2 0 0,157 g Co(N03)2. H2 0 0,049 g Kultivační baňky (objem 1 1), kádinka, zátky a skleněné Pasteurovy pipety byly sterilizovaný vysokou teplotou. Příprava kultivace probíhala ve sterilním prostředí ve flow-boxu. V kádince bylo přibližně odměřeno 600 ml sterilního média, které bylo přelito do kultivační baňky a následně bylo přidáno 60 ml inokula vybraného druhu. Inokulum každého druhu bylo v exponenciální fázi růstu. Takto připravené baňky byly uzavřeny zátkou, skrze kterou byla vedena skleněná Pasteurova pipeta. Poté byly baňky přeneseny do kultivační místnosti a kultivovány po dobu tri týdnů. Kultivace probíhaly za stálého osvětlení a vzduchování (vzduch byl filtrován přes filtr s póry o průměru 0,2 um) při pokojové teplotě 23 + 3 °C. 3.2.1 Stanovení počtu buněk Pro odhad počtu buněk sinic a řas během kultivace a pro zajištění stejného inokula při opakovaném zakládání kultivace stejného druhu byla měřena absorbance kultury při 680 nm v průhledných 96jamkových mikrotitračních destičkách na spektrofotometru BioTek PowerWave. Jako blank byla použita destilovaná voda. Absorbance kultury pak byla převedena na počet buněk pomocí kalibrační závislosti. 35 Pro vytvoření této závislosti byla kultura nejprve rozředěna do několika koncentrací a poté byla změřena jejich absorbance. Následně byl v takto naředěných kulturách pod mikroskopem pomocí Biirknerovy komůrky sečten počet buněk a přepočten na 1 ml. Počítání probíhalo ve čtvercích o obsahu 1/25 mm2 . Byly spočítány buňky uvnitř a na horní a levé hranici 9 čtverců, jejich součet byl následně převeden na počet buněk na 1 ml podle následujícího vzorce: součet buněk počet buněk/ml = x 16 x 10000 y Sčítání bylo provedeno dvěma lidmi nezávisle na sobě a následně zprůměrováno. Získané kalibrační závislosti jsou uvedeny na obrázku 7, naměřená data jsou uvedena v příloze 1. Obrázek 7: Kalibrační závislosti absorbance na počtu buněk (průměry z 2 měření směrodatná odchylka) 0,00 10,00 20,00 30,00 počet buněk x 106 /ml 40,00 50,00 • Microcystis aeruginosa y = 0,032x + 0,055 R2 = 0,993 I Scenedesmus quadricauda y = 0,271x - 0,032 R2 = 0,955 Aphanizomenon gracile y = 0,038x + 0,117 R2 = 0,979 3.2.2. Optimalizace délky kultivace Aby nedocházelo k rozkladu buněk a smísení intra- a extracelulárních metabolitů, byly kultivace vzorků ukončovány v exponenciální fázi růstu kultury, kdy je množství uhynulých buněk nejmenší. K optimalizaci délky kultivace byly vybrány stejné druhy jako pro sledování vnitrodruhové variability (sinice M. aeruginosa a A. gracile a řasa S. quadricauda). Pro zjištění optimální doby trvání kultivace byly nejprve vybrané kultury kultivovány ve třech opakováních (3 kultivační baňky o objemu 0,5 1) při vyšším i nižším osvětlení po dobu přibližně dvou měsíců a každé 2 - 3 dny byla měřena absorbance kultury. Absorbance byla 36 měřena na vlnové délce 680 nm v průhledných 96jamkových mikrotitračních destičkách ve třech opakováních pro každý vzorek. Ze získaných dat pak byly sestaveny růstové křivky pro jednotlivé typy osvětlení (na obrázku 8 růstové křivky řasy S. quadricauda, růstové křivky zbylých dvou druhů jsou uvedeny v příloze 2). Na základě těchto růstových křivek tak byla ověřena optimální délka kultivace 21 dní. Tato doba pak byla dodržována při všech dalších kultivacích vzorků vnitrodruhové a mezidruhové variability. Obrázek 8: Růstové křivky řasy Scenedesmus quadricauda (průměry z 3 baněk + směrodatná odchylka) 7 - E > rO =>« 4 c -Q % 3 >u o CL 2 - 21. den •nižší osvětlení •vyšší osvětlení 10 20 30 40 doba kultivace (dny) 50 60 3.3. ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ Kultivace probíhala 21 dní za stálého osvětlení a aerace jednotlivých baněk. Po ukončení kultivace byl odebrán vzorek pro změření absorbance kultury. Ze změřených hodnot absorbance byly pomocí kalibračních závislostí vypočítány koncetrace buněk řas a sinic na konci kultivace. Biomasa byla následně oddělena centrifugací při 6000 rpm po dobu 5 minut. Zakoncentrovaná biomasa byla rozsuspendována v malém množství destilované vody a z tohoto objemu bylo poté odebráno 0,5 ml do předem zvážené mikrozkumavky. k lyofilizaci pro zjištění hmotnosti sušiny. Zbytek biomasy byl uskladněn při teplotě -18 °C. 37 Médium po centrifugaci bylo přefiltrováno přes filtr ze skleněných vláken s póry 0,6 um avodměrném válci byl změřen jeho objem. 15 ml zfiltrovaného média bylo odebráno na zjištění celkového organického a anorganického uhlíku. Zbytek byl převeden přes kolony na SPE (extrakce na tuhou fázi). Pro extrakci byly použity kolony Oasis HLB a Alltech carbograff zapojené za sebou. Obě kolony byly kondicionovány 100% methanolem a ekvilibrovány destilovanou vodou. Po přetažení vzorků byly kolony vysušeny přetahováním vzduchu a před elucí byly skladovány v chladu a temnu. Pro SPE vzorků vnitrodruhové variability byly použity 0,5 g kolony, pro vzorky mezidruhové variability 1 g kolony. Kolony byly eluovány 100% methanolem každá zvlášť do odpařovací baňky a získaný eluát byl odpařen na přibližně 0,5 ml na rotační vakuové odparce při teplotě vodní lázně 35 °C. Vzorek byl následně převeden do vialky. Odpařovací baňka byla dvakrát vymyta 300 ul methanolu a chvíli ponechána v ultrazvukové lázni (cca 5s), methanol s vymytým obsahem byl přidán ke vzorku do vialky. Objem roztoku byl poté snížen odfoukáním pod dusíkem a následně doplněn na výsledný objem 4000x nižší než byl původní objem zfiltrovaného média. Takto připravený vzorek byl skladován při teplotě -18 °C. Pro testování na buněčné linii HeLa byly vzorky převedeny z methanolu do DMSO (dimethylsulfoxidu). 150 ul 4000x zakoncentrovaného roztoku vzorku v 100% methanolu bylo odebráno do inzertu a odfoukáno pod dusíkem do poslední kapky. Ta byla následně rozpuštěna ve stejném objemu DMSO (150 ul). Inzert s roztokem byl poté ještě chvíli ponechán pod dusíkem, aby byl odfoukán zbytkový methanol. Takto připravený roztok byl uchováván při teplotě -18 °C. 3.4. BUNĚČNÁ LINIE H E L A Buněčná linie hERa-HeLa-9903 jsou lidské rakovinné buňky z nádoru děložního čípku, které byly transfekovány reportérovým genem pro luciferázu pod kontrolou lidského ERa a genem pro tvorbu tohoto receptoru. Po vazbě ligandu na tento receptor tak dojde k aktivaci transkripce genu pro luciferázu a syntéze tohoto enzymu. Aktivita luciferázy se pak měří po přídavku luciferinu jako luminiscence (OECD, 2009). Princip testu je znázorněn na obrázku 9. 38 Obrázek 9: Schématické znázornění in vitro testu estrogenní aktivity s reportérovým genem pro luciferázu (Giesy et al., 2002) Xenoestrogen or estrogen ER-Responsive Genes 'Estrogenic Effects" Kultivace buněk probíhala ve sterilních lahvích v inkubátoru při 37 °C a 5% koncentraci CO2. Ke kultivaci bylo použito médium DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) s 10% dialyzovaným/stripovaným FBS (fetální bovinní sérum). Buňky byly pasážovány každé 2 - 3 dny při dosažení 70 - 90% konfluence. Pasážování bylo prováděno ve sterilním prostředí ve flow-boxu. Nejprve bylo odsáto médium. Poté byly buňky dvakrát opláchnuty 3 ml sterilního PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, složení je uvedeno v tabulce 8), které byl následně odsáto. Po opláchnutí bylo k buňkám přidáno 0,5 ml trypsinu a jeho působením došlo k uvolnění buněk ode dna. Aktivita trypsinu byla zastavena přídavkem kultivačního média a buňky byly rozsuspendovány pomocí sterilní plastové Pasteurovy pipety. Část suspenze (přibližně polovina až devět desetin objemu, podle nárostu buněk) byla odebrána a případně použita na testy. Zbytek suspenze byl ponechán v kultivační lahvi a bylo k němu doplněno nové médium do celkového objemu přibližně 6 ml. Uvedené objemy platí pro kultivační lahve s povrchem 25 cm . Buňky byly během kultivace pasážovány maximálně 40x. 39 Tabulka 8: Složení PBS (pH roztoku je dále upraveno pomocí I M NaOH nebo I M HC1 na hodnotu 7,2) látka navážka na 11 (g) NaCl 8 KC1 0,2 Na2 HP04 .2H2 0 2,89 KH2PO4 0,2 3.5. TEST ESTROGENITY K testování byly používány buňky odebrané při pasážování. Buněčná suspenze byla odebrána do sterilní lahvičky a pomocí cellometru byla spočítána koncentrace buněk. Následně byla buněčná suspenze naředěna kultivačním médiem (DMEM + 10% dialyzované/stripované FBS) na výslednou koncentraci 10 000 buněk/jamku (100 ul). Naředěná buněčná suspenze byla poté rozpipetována do 96jamkové bílé mikrotitrační destičky s průhledným dnem, přičemž do každé jamky bylo pipetováno 100 ul. Do okrajových jamek bylo pipetováno 100 ul PBS. Takto připravené destičky byly poté přeneseny do inkubátoru, kde byly ponechány 3 hodiny. Během této doby buňky přisedly na dno jamek. Poté následovala expozice. Pro expozici byly používány roztoky vzorků v DMSO. Expoziční roztoky byly připraveny ve sterilním prostředí rozředěním vzorku čistým médiem (DMEM bez FBS) tak, aby výsledná koncentrace DMSO v jamce byla 0,5 %. Expoziční roztoky pak byly rozpipetovány do jamek, vždy 50 ul na jamku. Všechny koncentrace vzorků a kontrol byly testovány v triplikátech. Vzorky byly testovány v řadě zakoncentrování 0,25 - 0,5 - 1 - 5 - lOx oproti původnímu objemu vzorku (objem po filtraci). Jako pozitivní kontrola byl použit 17P-estradiol (E2), pro vytvoření kalibrační křivky byla testována koncentrační řada 0,1 - 0,4 - 1,2 - 3,6 - 11 - 100- 500 - 1000 pM. Dále byla využita rozpouštědlová kontrola (DMSO) a negativní kontrola - blank (čisté expoziční médium). Po rozpipetování expozičních roztoků byly destičky opět uloženy na 24 hodin do inkubátoru. Po 24hodinové expozici byly jednotlivé jamky překontrolovány pod mikroskopem, zda nedošlo ke kontaminaci mikroorganismy. Pro měření aktivity luciferázy bylo smícháno 0,6 ml komerčního kitu (PROMEGA Steady-glo) a 2,8 ml lyzačního pufru (jeho složení je uvedeno v tabulce 9). Tyto objemy platí pro měření 1 desky. Poté bylo z každé jamky odpipetováno 100 ul a následně přidáno 50 ul směsi lyzačního pufru a kitu. Destička byla na 15 minut 40 umístěna na třepačku (140 rpm) a zakryta proti světlu alobalem. Po skončení třepání byl obsah jamek promíchán pipetou, spodní část destičky byla podlepená bílým papírem a na luminometru (Luminoskan Ascent) byla změřena luminiscence. Tabulka 9: Složení lyzačního pufru (pH roztoku je dále upraveno pomocí 1M NaOH nebo IM HC1 na hodnotu 7,8) látka navážka na 100 ml (mg) tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 121,14 dithiothreitol 30,8 ethylenglykoltetraoctová kyselina 76,08 3.6. VYHODNOCENÍ DAT Změřené hodnoty luminiscence byly převedeny na procentuální odpověď. Od naměřených hodnot byla odečtena luminiscence kontroly rozpouštědla a takto získaná čísla byla následně vztažena k maximální luminiscenci indukované E2 s odečtenou kontrolou rozpouštědla. Výpočet je shrnut v následujícím vzorci: luminiscence vzorku - luminiscence rozpouštědla procentuální odpověď= - — ——: — TZT, x 100 % max. luminiscence E2 - luminiscence rozpouštědla Následně byla tato data proložena křivkou dávka-odpověď pomocí nelineární regrese v softwaru GraphPad Prism verze 5.00.288. Pro srovnání účinků jednotlivých exudátů byly vypočteny hodnoty EEQ. Pro výpočet byl použit následující vzorec: EC20 E2 EC20 vzorku Pro vzorky, které v rozsahu testovaných koncentrací nezpůsobovaly 20% indukci luminiscence, byly použity hodnoty EC50 vzorku a EC50 odpovídající kalibrační křivky. Pokud vzorek nezpůsoboval ani 20%, ani 50% indukci, pak byla pro lx zakoncentrovaný vzorek exudátu odhadnuta z kalibrační křivky koncentrace E2, která způsobovala stejný efekt. Následně byla od EEQ vzorků odečtena hodnota EEQ pozadí kultivací (samotné kultivační médium kultivované 21 dní a zpracované stejně jako vzorky exudátů). V experimentech zaměřených na vnitrodruhovou variabilitu byly odpovídající EEQ přepočteny na počet buněk jednotlivých druhů na konci kultivace. 41 Vlastní přispění V rámci této práce jsem se podílela na vytváření kalibračních křivek pro přepočet absorbance na koncentraci buněk a měření růstových křivek. V rámci části věnované vnitrodruhové variabilitě jsem se podílela na kultivacích a zpracování jednotlivých vzorků a dále na sumarizaci výsledků a jejich statistickém vyhodnocení. V rámci sledování mezidruhové variability jsem se podílela na kultivacích a zpracování vzorků, následně jsem prováděla in vitro testy estrogenní aktivity těchto vzorků a statisticky zpracovala získané výsledky. 42 4. VÝSLEDKY 4.1. ESTROGENNÍ AKTIVITA KULTIVAČNÍHO MÉDIA Před hodnocením estrogenní aktivity exudátů jednotlivých druhů sinic a řas byl stanoven estrogenní potenciál samotného kultivačního média (50% ZBB). Tento vzorek byl připravován stejným způsobem jako vzorky exudátů (21denní kultivace za stálé aerace a vyššího osvětlení a následné zpracování vzorku pomocí SPE) a následně byla stanovena jeho estrogenní aktivita v in vitro testu na buněčné linii HeLa. Získané hodnoty EC20, EC50 a estrogenní ekvivalent jsou uvedeny v tabulce 10. Tabulka 10: Stanovené hodnoty EC20, EC50 a EEQ kultivačního média (50% ZBB) EC20 (zákone.) EC501 (zákone.) EEQ (ng/1) 2,40 11,70 0,010 1 hodnota byla z křivky odhadnuta extrapolací Výsledná hodnota EEQ kultivačního média pak byla odečtena od všech vypočítaných hodnot EEQ exudátů. Všechny hodnoty EEQ exudátů v následujících kapitolách jsou uvedeny už po odečtení EEQ kultivačního média. 4.2. VNITRODRUHOVÁ VARIABILITA 4.2.1. Koncentrace buněk na konci kultivace Při sledování koncentrace buněk na konci kultivací vzorků vnitrodruhové variability bylo patrné, že každý druh měl individuální preference k osvětlení. Zároveň se však i každá baňka chovala jako samostatná jednotka a byly mezi nimi značné rozdíly, i když byly kultivovány za stejných podmínek. Tyto trendy jsou patrné na obrázku 10, kde jsou uvedeny koncentrace buněk jednotlivých druhů na konci kultivací. Sinice Aphanizomenon gracile rostla výrazně lépe při vyšším osvětlení. I nejnižší koncentrace buněk při vyšším osvětlení (baňka 4) byla přibližně 2x vyšší než nejvyšší koncentrace buněk při nižším osvětlení (baňka 1). Při nižším osvětlení však byly jednotlivé baňky více vyrovnané, nejnižší koncentrace (baňka 2) dosahovala přibližně 65 % hodnoty nejvyšší koncentrace (baňka 1). Oproti tomu při vyšším osvětlení byly více patrné rozdíly mezi jednotlivými baňkami - nejnižší koncentrace (baňka 4) měla pouze 40% hodnotu nejvyšší koncentrace (baňka 2). 43 Obrázek 10: Koncentrace buněk v baňkách na konci kultivací (21. den) Aphanizomenon gracile nižší osvětlení vyšší osvětlení Scenedesmus quadricauda i i nižší osvětlení vyšší osvětlení Microcystis aeruginosa nižší osvětlení vyšší osvětlení U druhé sinice, Microcystis aeruginosa, nebyla preference k typu osvětlení jednoznačná. Vyšší koncentrace buněk (tři celkově nejvyšší) byly pozorovány při nižším osvětlení. Rozdíly však byly minimální. Nejvyšší koncentrace dosažená při vyšším osvětlení (baňky 1 a 2) dosahovala 75 % nejvyšší koncentrace pozorované při nižším osvětlení (baňka 4). Kromě jedné výrazně nižší hodnoty v každém typu osvětlení (baňka 1 z nižšího a baňka 3 z vyššího osvětlení) nebyly mezi jednotlivými opakováními velké odlišnosti. Poslední z trojice kultivovaných druhů, řasa Scenedesmus quadricauda, také rostla srovnatelně při obou typech osvětlení. Koncentrace buněk byly mezi jednotlivými baňkami při jednom typu osvětlení srovnatelné. Výjimkou byly baňky 2, ve kterých byly při obou variantách osvětlení naměřeny vyšší počty buněk. Pokud zanedbáme tyto dvě hodnoty, nebyly rozdíly mezi oběma osvětleními větší než přibližně 20 % nejvyšší koncentrace. 44 4.2.2. Estrogenní ekvivalenty exudátů Podobně jako u koncentrace buněk na konci kultivací byly i estrogenní aktivity vzorků jednotlivých druhů velmi různorodé a rozdíly mezi baňkami kultivovanými za stejných podmínek byly větší než rozdíly mezi průměrnými aktivitami při vyšším a nižším osvětlení. Estrogenní ekvivalenty exudátů sinice Aphanizomenon gracile se pohybovaly v rozmezí 0,006 - 0,144 ng/1 pro nižší osvětlení a 0,030 - 0,278 ng/1 pro vyšší osvětlení. Estrogenní aktivita mezi jednotlivými baňkami byla stále variabilní i po přepočtu estrogenního ekvivalentu na počet buněk (rozsah EEQ 1,01 - 24,12 zg/buňku pro nižší osvětlení a 1,75 - 26,01 zg/buňku pro vyšší osvětlení). Všechny hodnoty pro jednotlivé baňky a osvětlení jsou uvedeny v tabulce 11. Tabulka 11: Vypočítané hodnoty EC20, EC50 a EEQ exudátů sinice Aphanizomenon gracile (průměry z 2 měření) osvětlení baňka EC20 EC501 EEQ počet buněk EEQ osvětlení baňka (zákone.) (zákone.) (ng/1) x 106 /ml (zg/buňku) nižší 1 0,79 1,21 0,144 5,95 24,12 nižší 2 1,67 16,71 0,061 3,90 15,54 nižší 3 7,10 50,98 0,006 5,54 1,01 nižší 4 3,70 20,26 0,020 4,00 4,93 nižší 5 1,29 4,20 0,046 5,64 8,09 nižší průměr 2,91 18,67 0,055 5,01 10,74 nižší směrodatná odchylka 2,32 17,69 0,048 0,87 8,22 vyšší 1 n.i.2 1,13 0,047 26,24 1,80 vyšší 2 nekompletní vzorek vyšší 3 1,30 6,47 0,168 11,23 14,98 vyšší 4 1,08 4,27 0,278 10,70 26,01 vyšší 5 5,26 124,50 0,030 17,31 1,75 vyšší průměr 2,55 34,09 0,131 16,37 11,14 vyšší směrodatná odchylka 1,92 52,23 0,100 6,26 10,14 1 hodnoty větší než 10 jsou z křivky odhadnuty extrapolací 2 n.i. exudát neindukoval 20% efekt Exudáty sinice Microcystis aeruginosa měly také velmi různorodé hodnoty estrogenních ekvivalentů. Rozmezí pro nižší osvětlení bylo 0,045 - 0,525 ng/1, pro vyšší osvětlení to pak bylo 0,026 - 0,381 ng/1. Jednotlivé estrogenní ekvivalenty byly opět vztaženy na koncentraci buněk, ale rozdíly mezi baňkami zůstaly značné. Rozsah estrogenních ekvivalentů po 45 přepočtení byl přitom podobný jako u druhu A. gracile (2,35 - 27,82 zg/buňku pro nižší osvětlení a 1,69 - 22,12 zg/buňku pro vyšší osvětlení). Jednotlivé hodnoty jsou uvedeny v tabulce 12. Tabulka 12: Vypočítané hodnoty EC20, EC50 a EEQ exudátů sinice Microcystis aeruginosa (průměry z 3 měření) osvětlení baňka EC20 EC501 EEQ počet buněk EEQ osvětlení baňka (zákone.) (zákone.) (ng/1) x 106 /ml (zg/buňku) nižší 1 1,58 9,24 0,045 11,96 3,77 nižší 2 2,21 10,19 0,053 22,42 2,35 nižší 3 0,43 2,36 0,525 18,86 27,82 nižší 4 0,83 3,76 0,351 22,92 15,31 nižší 5 0,95 1,76 0,275 15,49 17,75 nižší průměr 1,20 5,46 0,250 18,33 13,40 nižší směrodatná odchylka 0,62 3,55 0,183 4,17 9,44 vyšší 1 vzorek nezpracován vyšší 2 n.i.2 1,42 0,381 17,22 22,12 vyšší 3 3,29 10,64 0,033 6,66 4,93 vyšší 4 2,38 15,34 0,026 15,19 1,69 vyšší 5 1,59 7,50 0,062 11,86 5,25 vyšší průměr 2,42 8,73 0,125 12,73 8,50 vyšší směrodatná odchylka 0,69 5,05 0,148 4,00 7,99 1 hodnoty větší než 10 jsou z křivky odhadnuty extrapolací 2 n.i. exudát neindukoval 20% efekt Stejně jako u obou druhů sinic, byla i u řasy Scenedesmus quadricauda pozorována značná variabilita hodnot estrogenních ekvivalentů. Ty se pohybovaly v rozmezí 0,004 - 0,319 ng/1 pro nižší osvětlení a 0,046 - 0,355 ng/1 pro vyšší osvětlení. Hodnoty zůstaly různorodé i po přepočtu na koncentraci buněk (2,25 - 259,13 zg/buňku pro nižší osvětlení a 33,37 - 171,52 zg/buňku pro vyšší osvětlení). Byly ale vyšší než u obou druhů sinic, což je dáno i nižšími koncentracemi buněk na konci kultivací. Jednotlivé hodnoty jsou pak uvedeny v tabulce 13. U všech tří kultivovaných druhů byla pozorována výrazná vnitrodruhová variabilita. Estrogenní ekvivalenty jednotlivých baněk kultivovaných za stejných podmínek se lišily i o dva řády. Z naměřených hodnot pak není u žádného sledovaného druhu patrná závislost estrogenní aktivity na typu osvětlení. 46 Tabulka 13: Vypočítané hodnoty EC20, EC50 a EEQ exudátů sinice Scenedesmus quadricauda (průměry z 3 měření) osvětlení baňka EC20 EC501 EEQ počet buněk EEQ osvětlení baňka (zákone.) (zákone.) (ng/1) x 106 /ml (zg/buňku) nižší 1 6,28 14,51 0,023 1,26 17,91 nižší 2 3,52 12,57 0,004 1,81 2,25 nižší 3 5,26 16,81 0,031 1,40 22,41 nižší 4 2,37 4,84 0,082 1,36 60,19 nižší 5 0,65 1,65 0,319 1,23 259,13 nižší průměr 3,61 10,07 0,092 1,41 72,38 nižší směrodatná odchylka 2,01 5,83 0,116 0,21 95,30 vyšší 1 1,79 5,74 0,097 1,60 60,59 vyšší 2 0,84 1,25 0,355 2,07 171,52 vyšší 3 2,29 13,08 0,079 1,49 52,81 vyšší 4 4,30 14,65 0,052 1,55 33,92 vyšší 5 4,01 14,35 0,046 1,39 33,37 vyšší průměr 2,65 9,82 0,126 1,62 70,44 vyšší směrodatná odchylka 1,32 5,38 0,116 0,23 51,64 1 hodnoty větší než 10 jsou z křivky odhadnuty extrapolací 4.2.3. Koncentrace microcystinů Kromě koncentrace buněk a estrogenní aktivity byla sledována i koncentrace microcystinů v exudátech na konci kultivace. Ve vzorcích byla pomocí kapalinové chromatografie měřena koncentrace tří strukturních variant (MC-LR, MC-RR a MC-YR). Microcystiny byly detekovány pouze v exudátech sinice Microcystis aeruginosa (limit detekce byl pro MC-LR 0,1 ug/1, pro MC-RR 0,05 ug/1 a pro MC-YR 0,1 ug/1). Hlavním detekovaným microcystinem byl MC-LR, který byl stanoven ve všech vzorcích v nejvyšších koncentracích. MC-RR byl detekován také ve všech vzorcích, ale ve třech jeho koncentrace nepřesáhly limit kvantifikace (0,20 ug/1) a ve zbylých vzorcích jeho koncentrace nebyly vyšší než 0,36 ug/1. MC-YR nebyl detekován v žádném vzorku. Sumy koncentrací microcystinů pro jednotlivé vzorky jsou uvedeny v tabulce 14. U baněk kultivovaných při nižším osvětlení byly naměřeny vyšší koncentrace microcystinů, což mohlo být zčásti způsobeno i vyššími koncentracemi buněk. Mezi jednotlivými baňkami byla opět patrná variabilita, která ale nebyla tak výrazná jako u estrogenní aktivity (všechny koncentrace se pohybovaly v desítkách ug/1). Po přepočtu na počet buněk/ml už se od sebe 47 průměrné koncentrace microcystinů v exudátech z kultivací při nižším a vyšším osvětlení významně nelišily. Tabulka 14: Naměřené koncentrace microcystinů v exudátech sinice Microcystis aeruginosa koncentrace počet koncentrace osvětlení baňka microcystinů v exudátu (ug/1) buněk x 106 /ml microcystinů v exudátu (fg/buňku) nižší 1 48,32 11,96 4,04 nižší 2 56,33 22,42 2,51 nižší 3 66,46 18,86 3,52 nižší 4 44,60 22,92 1,95 nižší 5 36,28 15,49 2,34 nižší průměr 50,40 18,33 2,87 nižší směrodatná odchylka 10,30 4,17 0,78 vyšší 1 46,23 17,22 2,68 vyšší 2 32,50 17,22 1,89 vyšší 3 16,30 6,66 2,45 vyšší 4 39,31 15,19 2,59 vyšší 5 32,20 11,86 2,72 vyšší průměr 33,31 13,63 2,46 vyšší směrodatná odchylka 9,94 4,00 0,30 Přítomnost microcystinů byla sledována i ve vztahu k estrogenním ekvivalentům jednotlivých vzorků. Závislost těchto dvou veličin pro exudáty sinice Microcystis aeruginosa (které jediné obsahovaly microcystiny) je uvedena na obrázku 11 a mezi koncentrací microcystinů a estrogenním ekvivalentem není patrná žádná úměra. Obrázek 11: Estrogenní ekvivalenty exudátu sinice Microcystis aeruginosa v závislosti na koncentraci microcystinů • nižší osvětlení • vyšší osvětlení 80 — 0,6 — 0,5 +•» 1 °'4 > 2 0,3 ai 1 0,2 ai oo £ 0,1 tu 0,0 • " • • •1 1 1 20 40 60 koncentrace microcystinů (ug/l) 48 4.3. MEZIDRUHOVÁ VARIABILITA 4.3.1. Křivky dávka - odpověď Křivky dávka - odpověď byly patrné u exudátů všech sledovaných druhů sinic i řas. U jednotlivých druhů však byla pozorována značná variabilita ve schopnosti interagovat s ER. Všechny křivky jsou uvedeny na obrázku 12. Nejvyšší účinek byl pozorován u exudátu sinice Sphaerospermum aphanizomenoides, dosahoval až 177 % maximální odpovědi E2. Oproti tomu nejnižší účinek měl exudát sinice Cylindrospermopsis raciborskii, který indukoval maximálně 19 % maximální odpovědi E2. Mezi sinicemi tak byla pozorována mnohem větší mezidruhová variabilita než mezi řasami. Mezi kultivovanými sinicemi byly i 4 druhy, které byly v nedávné době izolovány z vodních květů v České republice (druhy ze sbírky Jihočeské univerzity, indukované křivky jsou na obrázku 12a). Byly mezi nimi druhy, které způsobovaly větší odpověď než E2 {Sphaerospermum aphanizomenoides m % a Dolichospermum mendotae 105 % maximální odpovědi E2). Oproti tomu další dva druhy nedosáhly ani 50 % maximální E2 odpovědi {Microcystis ichtyoblabe dosáhl 43 % a Cuspidothrix issatchenkoi 25 %). Vysoké odpovědi byly indukovány i sinicí Microcystis aeruginosa (křivky na obrázku 12c). Tento druh byl zastoupen dvěma kmeny ze dvou různých sbírek (PCC a UTEX). Pří nižším zakoncentrování byly dosažené odpovědi obou těchto kmenů podobné, při vyšším se však lišily. Exudát kmene ze sbírky UTEX způsoboval až 105 % maximální odpovědi E2, oproti tomu exudát kmene ze sbírky PCC indukoval jen 69 % maximální odpovědi E2. Z dalších druhů (křivky na obrázku 12b) pak byly vyšší odpovědi pozorovány ještě u sinic Aphanizomenon klebahnii a Planktothrix agardhii (85 % a 66 % maximální odpovědi E2). Ostatní druhy {Anabaena flox-aquae, Aphanizomenon gracile, Cylindrospermopsis raciborskii) pak nedosáhly ani 50 % maximální odpovědi E2. U řas nebyly pozorovány tak velké rozdíly v účincích (křivky na obrázku 12d). Nejnižší efekty vykazoval exudát druhu Chlorella kessleri (58 % maximální odpovědi E2) a podobně reagoval i exudát druhu Chlamydomonas reinhardtii (59 %). Nejvyšší účinky pak byly pozorovány u druhu Ankistrodesmus falcatus (až 78 % maximální odpovědi E2). 49 Obrázek 12: Křivky dávka - odpověď estrogenní aktivity exudátů a) sinic Cuspidothrix issatchenkoi (Cul), Dolichospermum mendotae (DoM), Microcystis ichtyoblabe (Mil) a Sphaerospermum aphanizomenoides (SpA), b) sinic Anabaena flos-aquae (Ana), Aphanizomenon gracile (ApG), Aphanizomenon klebahnii (ApK), Cylindrospermopsis raciborskii (CyR) a Planktothrix agardhii (PIA), c) sinic Microcystis aeruginosa (MiA) z obou sbírek (PCC a UTEX) a d) řas Ankistrodesmus falcatus (AnF), Chlamydomonas reinhardtii (ChR), Chlorella kessleri (ChK) a Scenedesmus quadricauda (ScQ) (vše průměry z 2 opakování + směrodatná odchylka) a) 200 1 2,5 5 za koncentrování C) 200 175 H 150 -o g 125 g 100 E n 75 50 25 •MiA PCC •MiA UTEX 0,5 1 2,5 5 10 za koncentrování b) 200 0,5 1 2,5 5 zakoncentrování 10 50 4.3.2. Estrogenní ekvivalenty exudátů Na základě odpovědí exudátů jednotlivých druhů byly stanoveny jejich estrogenní ekvivalenty (hodnoty jsou uvedeny v tabulce 15). Rozsah pozorovaných hodnot byl u sinic 0,050 - 3,158 ng/1, u řas to pak bylo 0,169 - 2,650 ng/1. Tabulka 15: Vypočítané hodnoty EC20, EC50 a EEQ exudátů (průměry z dvou měření) a naměřené koncentrace microcystinů v exudátech sinic a řas číslo kultura sbírka EC20 (zakonc.) EC501 (zakonc.) EEQ (ng/1) koncentrace microcystinů v exudátů (ng/1) sinice 1 Anabaena flos-aquae UTEX 6,99 17,21 0,136 u o °- 10 Microcystis aeruginosa 21. den •nižší osvětlení •vyšší osvětlení 10 20 30 40 doba kultivace (dny) 50 60 66