Luciferasy jsou v současnosti velmi populární skupinou enzymů, které díky své schopnosti bioluminiscence nacházejí uplatnění v řadě bioprocesů od markerů genetických změn až po citlivou luminiscenční detekci v klinické praxi. Obzvláště oblíbenými se stávají koelenterazin-dependentní luciferasy, zejména pak luciferasa RLuc z organismu Renilla reniformis. Tento enzym je přitom evolučně a strukturně příbuzný bakteriálním halogenalkandehalogenasam, vůči kterým vykazuje nejvyšší stupeň sekvenční homologie. V předchozí práci byl metodou rekonstrukce sekvence ancestrálního enzymu zkonstruován nejpravděpodobnější předek vybraných halogenalkandehalogenas a zmíněné luciferasy, který byl následně strukturně a biochemicky charakterizován a který vykazuje výjimečné strukturní i funkční vlastnosti. Projekt si klade za cíl vyřešit kinetický mechanismus tohoto enzymu se substráty pro obě promiskuitní reakce. V rámci diplomové práce bude provedena detailní kinetická studie luciferasy RLuc s přirozeným substrátem koelenterazinem a získaná data budou porovnána s výsledky obdrženými pro ancestrální enzym. Osnova: 1. Literární rešerše: (i) evoluce na molekulární úrovni, (ii) promiskuita enzymů, (iii) metody studia kinetiky a termodynamiky enzymové reakce. 2. Příprava biologického materiálu: (i) exprese a purifikace enzymů, (ii) optimalizace analytických metod pro detekci reakčních komponent, (iii) základní strukturní a funkční charakterizace. 3. Detailní kinetická analýza: (i) kinetika ustáleného stavu, (ii) „stopped-flow“ a (iii) „rapid quench“ analýza reakce s přirozeným substrátem, (iv) inhibiční kinetika a mechanismus uvolnění produktu. 4. Analýza dat: (i) analytické zpracování dat, odhad kinetických parametrů, (ii) testování navržených mechanismů studované reakce pomocí globální analýzy kinetických dat metodou numerické simulace. 5. Interpretace a zpracování výsledků studie do diplomové práce, příprava podkladů pro odbornou publikaci.