MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta DIPLOMOVÁ PRACE Brno 2013 Bc. Petra Formanova í 5a C/1 cl MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ustav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie g JOL ,££0 % Vliv lyzogenie na citlivost kmenů S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s k polyvalentním O i g u m Diplomová práce Petra Formanova VEDOUCÍ PRÁCE: prof. RNDr. Jiří Doškář, CSc Brno 2013 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Bc. Petra Formanova Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ustav experimentální biologie Vliv lyzogenie na citlivost kmenů Staphylococcus aureus k polyvalentním fágům Studijní program: Biologie Studijní obor: Molekulární biologie a genetika prof. RNDr. Jiří Doškář, CSc 2012/2013 77 Vedoucí práce: Akademický rok: Počet stran: Klíčová slova: bakteriofágy, fágová terapie, lyzogenie, Staphylococcus aureus Bibliographic Entry Author: Be. Petra Formanova Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Influence of lysogeny on the sensitivity of Staphylococcus aureus strains to polyvalent bacteriophage Degree Programme: Biology Field of Study: Molecular biology and genetics Supervisor: prof. RNDr. Jiří Doškář, CSc Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 77 Keywords: bacteriophages, phage therapy, lysogeny, Staphylococcus aureus ABSTRAKT Staphylococcus aureus je oportunní patogen, který u lidí s oslabenou imunitou vyvolává závažná onemocnění, jež mohou mít fatální následky. V současné době je léčba těchto infekcí značně problematická a to díky zvyšujícímu se počtu kmenů rezistentních k antibiotikům. Východiskem by mohla být fágová terapie, která se již řadu let aplikuje v některých východních státech, například v Gruzii, Rusku nebo Polsku. Jedním z problémů fágové terapie je rezistence vůči polyvalentním fágům, které se ktéto terapii používají. Tato rezistence k fágům může mít řadu příčin. Doposud byla pozornost zaměřena spíše na restrikčně-modifikační systémy, významný vliv však mohou mít i profágy integrované v genomech kmenů rezistentních k polyvalentním fágům. Tato diplomová práce se zabývá vlivem lyzogenie na citlivost kmenů S. aureus k polyvalentním fágům. Schopnost navodit rezistenci u svých hostitelů byla prokázána u několika mírných fágů. Pomocí komparativní genomiky byl identifikován gen, který by mohl být zodpovědný za navození rezistence vůči fágům, a byla navržena PCR na detekci tohoto genu. ABSTRACT Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen that in people with weakened immune systems raises serious disease that can be fatal. Currently, the treatment of these infections is very problematic due to the increasing number of strains resistant to antibiotics. The starting point could be phage therapy, which has been applied for many years in some Eastern countries, such as Georgia, Russia or Poland. One of the problems of phage therapy is resistance to polyvalent phages used in this therapy. This resistance to phages can have many causes. So far, the attention has been focused more on restriction-modification systems. However, the prophages integrated in the genomes of strains resistant to polyvalent phages may be important too. This thesis examines the influence of lysogeny on the sensitivity of strains of S. aureus to polyvalent phage. The ability to induce resistance in its hosts has been demonstrated in a number of temperate phages. With comparative genomics a gene has been identified that could be responsible for inducing resistance to phages, and the PCR has been designed to detect this gen. Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli prof. RNDr. Jiřímu Doškářovi, CSc za cenné rady a odborné vedení při zpracovávání této diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat všem pracovníkům Laboratoře molekulární diagnostiky mikroorganismů za cenné rady a pomoc. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 10. května 2013 Petra Formanova J V ^ ^ f ^ % V y s o k á š k o l a : Masarykova univerzita Fakulta: přírodovědecká J l V ^ B <ž?/ P r a c o v i š t ě : Ústav experimentální biologie A k a d e m i c k ý rok: 2011/2012 f. i R n l ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE M a g i s t e r s k ý s t u d i j n í p r o g r a m : B i o l o g i e S t u d i j n í obor: Molekulární biologie a genetika Student(ka): Bc. Petra Formanova Vedoucí d i p l o m o v é práce V á m ve smyslu zákona vlády ČR č. 1 11/1998 Sb., čl. o státních závěrečných zkouškách a státních rigorózních zkouškách, určuje tuto diplomovou práci: N á z e v t é m a t u : Vliv lyzogenie na citlivost kmenů Staphylococcus aureus k polyvalentním fágům N á z e v t é m a t u anglicky: Influence of Iysogeny on the sensitivity of Staphylococcus aureus strains to polyvalent bacteriophages V e d o u c í d i p l o m o v é p r á c e : P r o f . R J M D r . J i ř í D o š k á ř , C S c . J a z y k p r á c e : český (jiný jazyk jen na základě přiložené žádosti) Zásady pro vypracování Anotace: Polyvalentní stafylokokové bakteriofágy jsou vzhledem ke svému širokému rozmezí hostitelů využívány k přípravě preparátů pro terapii stafylokokových infekcí. "Některé kmeny stafylokoků druhu S. aureus jsou však k těmto fágům necitlivé, což může účinnost fágové terapie negativně ovlivňovat. Bylo zjištěno, že necitlivost kmenů múze být způsobena přítomností profágů začleněných v jejich genomu. Cílem diplomové práce je stanovit, do jaké míry je necitlivost kmenů S. aureus k polyvalentním fágů ovlivněna přítomností profágů v jejich genomech, které profágy tuto necitlivost specificky navozuj! a následně tyto profágy blíže charakterizovat z hlediska jejich genomové struktury, obsahu genů a dalších vlastností. Č a s o v ý h a r m o n o g r a m řešení (postup): PS 201 ] Studium literatury, zahájení experimentálního zpracování DP JS 2012 Pokračování ve studiu literatury a experimentálním zpracování DP PS 2012 Dokončení experimentálního zpracování, vypracování literární rešerše k tématu DP JS 2013 Sepsání DP R o z s a h d i p l o m o v é p r á c e : 50-60 stran R o z s a h g r a f i c k ý c h p ř í l o h : 10-20 D o p o r u č e n á literatura: 1. Odborné články dle doporučení školitele, zdroje z internetu D a t u m z a d á n í d i p l o m o v é p r á c e : 6.12.2011 T e r m í n o d e v z d á n í d i p l o m o v é p r á c e : Termín odevzdání diplomové práce dle harmonogramu příslušného akademického roku. V Brně dne 6.12.2011. Bc. Petra Formanova prof. RNDr. Jiří DoškaF, CSc. podpis studenta podpis vedoucího diplomové práce prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.) i ředitel ústavu OBSAH OBSAH 8 ZKRATKY 10 1.ÚVOD H 1.1. Druh Staphylococcus aureus 12 1.1.1. Genom Staphylococcus aureus 13 1.2. Bakteriofágy 14 1.2.1 Mírné bakteriofágy 15 1.2.2. Polyvalentní bakteriofágy 18 1.3. Fágová terapie 20 1.4. Mechanismy rezistence bakterií vůči fágům 22 1.4.1. Zabránění adsorpce fága 22 1.4.2. Zabránění vstupu fágové DNA do buňky 23 1.4.3. Reštrikčné modifikační systémy 24 1.5. Struktura genomu mírných fágů druhu & aureus 26 1.5.1. Začlenění fágové DNA do genomu bakterie 28 1.5.2. Oblast kontroly lyzogenního stavu 28 1.5.3. Modul regulace transkripce 28 1.5.4. Morfologický modul 28 1.5.5. Lyrický modul 29 2. CÍLE PRÁCE 30 3. MATERIÁL A METODY 31 3.1. Bakteriální kmeny a bakteriofágy 31 3.2. Materiál 32 3.2.1. Kultivační média 32 3.2.2. Materiál pro elektroforézu 34 3.2.3. DNA markety 35 3.2.4. Materiál pro PCR 35 3.3. Laboratorní přístroje 35 3.3.1. Počítačový software a internetové nástroje pro analýzu sekvencí 36 3.4. Metody 36 3.4.1. Stanovení citlivosti lyzogenních kmenů S. aureus k polyvalentním fágům 36 3.4.2. Titr fágových částic 37 3.4.3. Stanovení adsorpce fágů na bakteriální buňky 37 3.4.4. Zamražení bakteriálních kultur 38 3.4.5. Příprava hrubého lyzátu pro PCR 38 3.4.6. Multiplex PCR na detekci typu serologické skupiny profágů 38 3.4.7. Multiplex PCR na detekci genů pro fágové amidázy 39 3.4.8. Multiplex PCR na detekci genů pro fágové dUTPázy 40 3.4.9. Multiplex PCR na detekci fágového antirepresoru 41 3.4.10. Návrh a optimalizace simplex PCR na detekci genu pro neznámý protein 43 3.4.11. Elektroforéza v agarózovém gelu 44 3.4.12. Indukce profágů U V zářením 44 3.4.13. Lyzogenizace 45 4. VÝSLEDKY 47 4.1. Citlivost vybraných kmenů S. aureus k polyvalentním fágům 47 4.2. Stanovení schopnosti adsorpce polyvalentních fágů 812 a 812a na buňky S. aureus 49 4.3. Profágový profil u vybraných kmenů 52 4.3.1. Morfologický modul profágů 52 4.3.2. Lyrický modul profágů 55 4.3.3. Modul regulace transkripce 58 4.3.4. Modul kontroly lyzogenního stavu 60 4.4. Indukce profágů z necitlivých kmenů a lyzogenizace kmene S. aureus 1039 63 4.5. Analýza in silico 63 4.5.1.Návrh PCR na 53ORF016 64 5. DISKUZE 66 5.1 Citlivost vybraných kmenů S. aureus k polyvalentním fágům 66 5.2. Schopnost adsorpce polyvalentních fágů na buňky S. aureus 67 5.3. Profágový profil u vybraných kmenů 67 5.4. Indukce neznámých profágů a následná lyzogenizace citlivého kmene 69 5.5. Analýza genu pro neznámý protein 70 6. ZÁVĚR 71 7. SEZNAM LITERATURY 72 ZKRATKY C C M - Česká sbírka mikroorganismů EOP - „angl." „effíciency of plating" - efektivita výsevu dsDNA - dvouřetězcová DNA (double-stranded DNA) H M F M - „angl." „Hogness modified freezing medium" - zamražovací médium L M D M - Laboratoř molekulární diagnostiky mikroorganismů MRS A - meticilin-rezistentní Staphylococcus aureus MS SA - meticilin-senzitivní Staphylococcus aureus MLST - multilokusová sekvenční typizace MPA - masopeptonový agar MPB - masopeptonový bujón NCBI - národní centrum pro biotechnologické informace ORF - otevřený čtecí rámec PFU - „angl." „plaque forming units" - částice tvořící plaky PCR - polymerázová řetězová reakce R M - restrikčně-modifikační SaPI - ostrov patogenity u S. aureus SCCmec - stafylokoková chromozómová kazeta nesoucí gen mec VRSA - vankomycin-rezistentní Staphylococcus aureus 1. ÚVOD Staphylococcus aureus je významným patogenem lidí i zvířat. Jedná se o extrémně flexibilní organismus, jehož evoluce probíhá vysokou rychlostí. Může být komenzálem, ale stejně tak i život ohrožující bakterií. V současné době jeho význam roste. Je totiž častým problémem v nemocnicích po celém světě a to díky vzrůstajícímu počtu k antibiotikům rezistentních kmenů MRSA (meticilin rezistentní S. aureus) a VRSA (vankomycin rezistentní S. aureus). Síření této rezistence je způsobeno rychlou evolucí této bakterie a schopností horizontálního přenosu genů. Proto se současné výzkumy zabývají hledáním alternativní cesty k antibiotikům a jako nejvhodnější z nich se jeví právě fágová terapie. Fágová terapie má své počátky již na začátku 20. století, pravděpodobně poprvé byla užita v roce 1921 na kožní onemocnění vyvolané stafylokoky (Bruynoghe a Maisin, 1921). Poté však zájem o fágovou terapii poklesl, jednak díky objevu antibiotik, a dále také díky špatné kvalitě přípravků, způsobené nedostatečnými znalostmi biologie bakteriofágů. Přesto se tato alternativní cesta stále rozvíjela a to zejména v Gruzii, Rusku a Polsku. Po rozšíření rezistence k antibiotikům se fágová terapie stala opět světově aktuální a v současné době se jí zabývá řada výzkumů. Na trhu jsou k dostání první přípravky na bázi bakteriofágů. Fágová terapie se však také potýká s řadou problémů. Jedním z nich je i rezistence bakterií vůči užívaným polyvalentním fágům. Ta může mít řadu příčin, např. R M systémy (restrikčně-modifikační), Sie systémy (superinfekci vylučující) či abortívni infekce. Často je příčina rezistence neznámá, zejména u druhu S. aureus. Většina studií se zabývá vlivem restrikčně-modifikačních sytému na rezistenci bakterií. U mnoha rezistentních kmenů se v genomu nachází mírné bakteriofágy ve formě profágů, jež také mohou nést geny pro rezistenci k polyvalentním fágům. A právě rezistencí podmíněnou profágem se zabývá tato diplomová práce. 11 1.1. Druh Staphylococcus aureus S. aureus patří mezi grampozitivní nesporulující koky o velikosti 1 p m Jeho kolonie tvoří shluky hroznovitých tvarů a mají charakteristickou nažloutlou barvu. Poprvé byl tento bakteriální druh pozorován v roce 1880 chirurgem Alexandrem Ogstonem, který ho izoloval z otevřených hnisajících ran a posléze ho pojmenoval Staphylococcus. Používal slepičí vejce, aby vyizoloval čistou kulturu, kterou pak infikoval králíky. Dokázal tak, že tyto bakterie způsobují abscesy u infikovaných zvířat. Taxonomicky patří druh Staphylococcus aureus do domény Bacteria, kmene Firmicutes, třídy Bacilli, řádu Bacillales, čeledi Staphylococcaceae a rodu Staphylococcus. Tento druh je fakultativně anaerobní bakterií a v praxi se pro jeho selekci používá schopnost růstu v médiu s 10% NaCl. Obrázek 1: S. aureus. Převzato z http://www.sciogena.eu/wp-content/Staphylococcus-aureus.jpeg, http://3.bp.blogspot.com/. Z hlediska patogenity je S. aureus oportunní patogen., který se nejčastěji vyskytuje na povrchu nosní sliznice, případně na povrchu kůže a zdravému nositeli nezpůsobuje žádné komplikace. V případě oslabení imunity však může způsobovat závažná onemocnění. Mezi ně patří kožní či tkáňové abscesy, pneumonie, syndrom toxického šoku, endokarditida, osteomyelitida nebo meningitida. V populaci se šíří fyzickým kontaktem. Díky masivnímu používání antibiotik ve 40. letech se objevily kmeny rezistentní k penicilinu. Proti nim se začal široce užívat meticilin, což vedlo k rozšíření MRSA kmenů a v současnosti jsou tyto kmeny velkým problémem v nemocnicích po celém světě (DeLeo a Chambers, 2009). Všechna beta-laktamová antibiotika jsou vůči těmto infekcím neúčinná. Za tuto rezistenci je odpovědný gen mecA na chromozómové kazetě SCCmec (Hiramatsu a kol, 2001). Proto se v současnosti používá k léčbě vankomycin, přesto se již objevily kmeny k němu rezistentní (Hiramatsu a kol. 1997). Důvodem je zřejmě horizontální přenos genu vanA, jenž má původ u 12 Enterococcusfaecalis (Chang a kol, 2003). V budoucnu se tak dá očekávat rychlý nárůst rezistence i k tomuto antibiotiku. 1.1.1. Genom S. aureus Genom S. aureus je tvořen jednou molekulou dvouřetězcové DNA a přídatnými plazmidy. Celková velikost se pohybuje od 2,7 Mb - 2,9 Mb. Genomová sekvence je asi z 80% tvořená společnými geny pro všechny kmeny, jde o tzv. jádro genomu složené z esenciálních genů (Lindsay a Holden, 2004). Genetická informace S. aureus však vykazuje i obrovskou diverzitu přídatných genetických elementů. Přídatné geny reprezentují rozmanitost bakteriálního druhu, neboť kódují proteiny potřebné pro adaptaci bakterií v různých ekologických niche. Je pro ně také typický odlišný obsah G + C, což je často dáno tím, že mají jiný původ než zbytek genomové sekvence. Jako první byly sekvenovány kmeny Mu50 a N315, jejichž genomová sekvence je téměř identická. Díky potřebě porozumění příčinám rezistence a patogenity bylo sekvenováno několik dalších kmenů (Obr. 2). Obrázek 2: Osekvenované kmeny S. aureus. Převzato z http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. - 4 08B.A02176 4 subsp. aureus ST39S subsp. aureus 71193 4 subsp. aureus MRSA252 — a subsp. aureus TCH60 — » s u b s p . aureus HO 5096 0412 - » subsp. aureus JKD6159 subsp. aureus JH1 subsp. aureus JH9 .—»subsp. aureus Mu3 I—»subsp. aureus Mu50 - 4 04-02981 — « subsp. aureus N315 — « subsp. aureus EGT-R 2 4 subsp. aureus ED98 - » subsp. aureus M3HR1132 - 4 subsp. aureus str. JKD6008 - a subsp. aureus T0131 4 subsp. aureus T.V20 subsp. aureus U3A300_FPR3757 subsp. aureus USA300_TCH1516 -4 subsp. aureus str. Newman - a subsp. aureus COL 4 subsp. aureus VC40 — 4 subsp. aureus NCTC 8325 - » subsp. aureus MS5.A476 - a subsp. aureus MW2 4 subsp. aureus 11819-97 4 RF122 - 4 subsp. aureus LGA251 4 subsp. aureus ED133 i subsp. aureus M013 13 Populace S. aureus vykazuje vysokou klonální strukturu (Feng a kol, 2008). Velmi populární typizační metodou je MLST (multilokusová sekvenční typizace), založená na sekvenaci 7 „housekeeping" genů (arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi a ygiL). Pokud se izoláty shodují nejméně v 6 z těchto 7 genů, náleží do stejného klonálního klastru (CC). Většina MRSA kmenů pak spadá do 5 klonálních linií CC8, CC5, CC30, CC45, a CC22 (Enright a kol, 2002). S. aureus je tak patrně pravým klonálním typem, o čemž svědčí i to, že se jednotlivé mobilní genetické elementy nemohou mezi kmeny zcela volně pohybovat. V laboratoři je pak značně obtížné geneticky manipulovat s tímto druhem díky rejekci exogenních plazmidů. Z mobilních genetických elementů se u S. aureus vyskytují profágy, inzerční sekvence (IS), transpozony (Tn), stafylokokové chromozómové kazety (SCC), plazmidy, chromozómové ostrovy a ostrovy patogenity - (SaPIs). Celkově zaujímají asi 25% celkového genomu (Lindsay a Holden, 2004). SCCmec obsahuje 2 důležité oblasti, jednak gen mecA, který zodpovídá za rezistenci k beta-laktamázovým antibiotikům a dále ccr komplex, jež umožňuje mobilitu tohoto elementu (Hiramatsu a kol, 2001). Na této kazetě byly nalezeny rozličné inzerční sekvence, transpozony a plazmidy, např. Tn554, IS1272, IS431, pUBUO, pT181, a pl258 (Feng a kol, 2008). Většina kmenů obsahuje 2 genomické ostrovy - vSaa. a vSa p. Ostrovy patogenity jsou důležité vektory, jež mohou přenášet virulentní faktory, např. enterotoxiny a toxin syndromu toxického šoku. Přenos těchto elementů je závislý na pomocném fágu. Např. SaPI 1 je nejčastěji přenášen pomocí fágů 13 a 80a (Lindsay a kol, 1998; Ruzin a kol, 2001). Profágy tvoří rozsáhlou skupinu M G E u druhu S. aureus. Téměř každý kmen obsahuje nějakého profága a většina je stále neznámá. 1.2. Bakteriofágy Bakteriofágy jsou všeobecně definované jako viry infikující bakterie. Některé bakteriofágy pak mají schopnost začlenit svou D N A do chromozomu hostitelské buňky a přetrvávat zde ve stavu profága. Profág je tedy bakteriofágový genom začleněný v bakteriálním chromozomu a patří mezi mobilní genetické elementy. Bakteriofágy byly poprvé objeveny nezávisle na sobě Twortem, Londonem a ďHerellem jako činitelé bakteriální lyže, které je možno filtrovat a infikovat jimi další bakteriální kulturu. Zpočátku se myslelo, že byl nalezen klíč k potlačení bakteriálních infekcí, tehdejší rané studie však vykazovaly značný neúspěch. V současné době význam fágové terapie roste. 14 Bakteriofágy schopné infikovat většinu prokaryot můžeme vyizolovat z půdy, vody, odpadních vod a prakticky z většiny prostředí, která jsou kolonizovaná bakteriemi. Je vcelku logické, že bakteriofágy vykazují obdobnou variabilitu a všestrannost jako jejich hostitelé. Některé bakteriofágy mohou stejně jako některé bakterie přežít v extrémních podmínkách, mezi něž patří vysoká teplota (nad 95 ° C) nebo nízké pH (až 1,3 pH). Fágy, jež jsou užívány k terapii v Gruzii, byly často izolovány právě z odpadních vod. Bakteriofágy náleží do několika čeledí: Corticoviridae, Podoviridae, Myoviridae, Inoviridae, Microviridae, Cystoviridae, Plasmaviridae, Siphoviridae, Leviviridae, Tectiviridae, Fuselloviridae, Rudiviridae a Lipothrixviridae (Ackermann, 2003). U druhu S. aureus nalezneme zástupce z čeledi Myoviridae, Siphoviridae a Podoviridae. Bakteriofágy přenáší svou genetickou informaci ve formě D N A nebo RNA. Dále má většina bakteriofágů proteinovou kapsidu a bičíková vlákna (obr. 3), kterými se fágy navazují na specifické receptory na povrchu bakterií. Těmi mohou být například karbohydráty, proteiny anebo lipopolysacharidy. Bakteriofágy můžeme dělit do dvou skupin, na virulentní a mírné. Virulentní bakteriofág vyvolá kytičkou infekci, vedoucí k lyži hostitele. Mírný bakteriofág využívá tzv. lyzogenní cyklus. Obrázek 3: Struktura bakteriofágů. Převzato z: http://www.sciogena.eu/wp-content/phage-3.jpeg. 1.2.1. Mírné bakteriofágy Mírné bakteriofágy mohou mít lytický i lyzogenní cyklus. Při lyzogenním cyklu je bakteriofág schopen začlenit svou vlastní nukleovou kyselinu do genomu hostitele. V případě DNA se genetická informace může přímo včlenit do genomu, jedná-li se o RNA, pak tomuto začlenění předchází reverzní transkripce za pomocí speciálního enzymu reverzní transkriptázy. Samotný včleněný virový genom se nazývá profág a je přenášen do všech dceřiných buněk hostitele. Virus tak využívá replikačních mechanismů hostitele, aniž by zapříčinil jeho smrt. Některé profágy mohou být spontánně indukovány a to například U V 15 zářením, anebo chemickými mutageny. Tato lyzogenní indukce pak vede k transkripci, produkci nových fágových částic a následné lyži bakteriální buňky. Mnoho profágů nese geny výhodné pro hostitele a velký význam bakteriofágů spočívá v přenosu genetické informace mezi bakteriemi a to transdukci a lyzogenní konverzi. Přenos genů pomocí bakteriofágů je u druhu S. aureus nej častějším způsobem horizontálního přenosu genů (Holden a Lindsay, 2008). Síření genů spojených s virulencí pomocí lyzogenizujících bakteriofágů je obecným jevem u grampozitivních i gramnegativních bakterií (Boyd a kol, 2001). Přítomnost genů kódujících „záškrtový" toxin na lyzogenizujícím bakteriofágů u Corynebacterium diphtheriae byla zjištěna téměř před půl stoletím a v následujících letech byla objevena spousta dalších toxinů kódovaných bakteriofágy, např. shigatoxinu u Enterobacteriacee, toxinu cholery u Vibrio cholerae, neurotoxinů u Clostridium botulinum, nebo cytotoxinu u Pseudomonas aeruginosa (Cheetham a Katz, 1995). U druhu S. aureus je nejvýznamnějším příkladem gen eta pro exfoliativní toxin A, jež se nachází v genomu konvertují čího bakteriofága (Yamaguchi a kol, 2000). Tento toxin způsobuje u člověka závažné epidermolýzy např. syndrom opařené kůže (obr. 4). Obrázek 4.: Syndrom opařené kůže způsobený exfoliativním toxinem A. Převzato z http://detskakuze.phorum.cz/imagesnovor/14.jpg. Pokud se po začlenění genomu fága změní fenotyp hostitelské buňky, dochází k tzv. lyzogenní konverzi. Začlenění profágové D N A do bakteriálního genomu může mít několik důsledků a to: (i) modifikaci povrchových struktur, chránících bakteriální buňku před účinky protilátek, makrofágů, antibiotik nebo bakteriofágů, 16 (ii) odlišné chemické složení kapsulárních polysacharidu, které mechanicky chrání bakteriální buňku před vnějšími faktory, (iii) produkci exotoxinu, který působí na různé systémy makroorganismu, (iv) produkci specifických proteinů (internalinů nebo invazinů), které umožňují bakteriální invazi do krevního oběhu a buněk makroorganismu, (v) uspořádání biofilmu, jehož výsledkem je bakteriální adheze na epiteliální buňku a radikální změna vlastností, která se týká neprístupnosti a vysoké rezistence k různým faktorům a (vi) mnohonásobnou rezistentnci k antibiotikům (Krylov, 2003). Přítomnost určitých profágů koreluje i s přítomností určité rezistence k antibiotikům. Kmeny MRSA a MSSA byly testovány na citlivost k antibiotikům současně s PCR detekcí přítomnosti určité skupiny mezinárodní řady profágů (Mehndiratta a kol, 2010). Fágy byly rozděleny na základě podobnosti do skupin I- fágy 29, 52, 52A, 79, 80, II- fágy 3 A, 3C, 55, 71, III- fágy 6, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85, IV- fágy 94, 96 a dále nezařazené fágy 81,95. Všechny kmeny MSSA obsahující profágy typu 81 byly citlivé na všechna testovaná antibiotika kromě penicilinu, na který byly všechny rezistentní. Dále pak bylo zjištěno, že 45 % kmenů MRSA s profágem ze skupiny III je multirezistentních. Přítomnost určitého profága tak může předpovídat rezistenci k antibiotikům. Asi 93% fágu S. aureus je mírných a z toho většina patří do čeledi Siphoviridae (Goerke a kol, 2009). Rada z nich již byla osekvenována. Mají modulární uspořádání a jsou mozaikovité povahy, to znamená, že jednotlivé sekvence najdou zastoupení v genomech různých fágů (obr. 5). Je to dáno postupnou nezávislou evolucí spojenou s horizontálním přenosem genů a rekombinací (Kwan a kol, 2005). Mírné fágy mají u druhu S. aureus velký význam při přenosu genů. Jsou nejrozšířenějším mobilním genetickým elementem (Witney a kol, 2005). Většina kmenů obsahuje minimálně jednoho profága, bezprofágové kmeny se vyskytují vzácně (Goerke a kol, 2009; Pantůček a kol, 2004). 17 Obrázek 5.: Mozaikovité uspořádání genomu fágů z čeledi Siphovirídae. Srovnávací fág 47. Převzato z Kwan a kol. (2005); upraveno. Riřík- Integrace Hlava Lyže • , Replikace DNA h—* t • > p = 3A ^ ^ H I I ^ H ^ ^ ^ H I 42e 55 52A • • I BI 29 • i i BI 71 92 88 II i B I I 2 I ľ 96 — • 1« R88A lili I I II l l l 77 85 I I I IIBBI 69 187 l l l | l | l Neméně významná je jejich role při mobilizaci ostrovu patogenity. U druhu 5*. aureus se nachází několik odlišných SaPIs. Jsou to mobilní elementy, které jsou přenášeny za pomocí bakteriofága. Díky tomu dochází k častějšímu přenosu a to nejen u druhu S. aureus (Lindsay a kol, 1998), ale také u dalších druhů Staphylococcus sp. (Maiques a kol, 2007) a dokonce k přenosu i na Listeria monocytogenes (Chen a Novick, 2009). Při infekci hostitelské buňky fágem se SaPIs vyštěpí, autonomně replikují a poté jsou zabaleny do fágových částic namísto fágové D N A (Tallent a kol, 2007; Tormo a kol, 2008). Fág 80a umí mobilizovat značnou část ostrovů patogenity. Původně se myslelo, že fág 80a je odvozený od fága 80, jelikož byl izolován jako plaka na kmeni NCTC 8325 a je tedy schopen na tomto kmeni růst (Novick, 1967). Při srovnávání genomu a schopnosti mobilizace však byl zjištěno, že fág 80a je jen vzdáleně příbuzný k fágu 80 a naopak má sekvenci genomu blízkou fágu 53 (Christie a kol, 2010). Téměř 90% genomu 80a je shodných s publikovanou sekvencí 53. Pravděpodobně tak bude 80a variantou 53, který zřejmě tehdejší studie kontaminoval. Taktéž u fága 53 byla zjištěna schopnost mobilizovat SaPU a 2. Jelikož fág 53 má schopnost navodit rezistenci vůči polyvalentním fágům, přináší tak svému hostiteli hned dvojí výhodu. 1.2.2. Polyvalentní bakteriofágy S. aureus Polyvalentní bakteriofágy jsou lytické fágy se širokým spektrem hostitelů. Proto jsou ideálními fágy pro využití ve fágové terapii. Na rozdíl od mírných fágů mají tyto fágy pouze 18 lyrický cyklus. Nejprve se fág adsorbuje na hostitelskou buňku pomocí jejích povrchových molekul. Poté bakteriofág vstřikuje svoji nukleovou kyselinu do buňky. Uvnitř buňky využívá jejích replikačních, transkripčních a translačních mechanismů k replikaci vlastní genetické informace, a k translaci proteinů potřebných pro sestavení nových fágových částic. Poté se tvoří nové fágové částice, počet vzniklých fágů během jediného cyklu infekce se pohybuje od 50 až po 200 nových částic. Následuje lyže bakteriální buňky za pomocí endolyzinů, jež naruší buněčnou stěnu a nové částice se dostanou vně buňky. Prvním krokem při infekci je tedy adsorpce na povrchový receptor. Ztrátou nebo změnou svých povrchových struktur může bakterie zabránit bakteriofágům v přichycení a stát se rezistentní vůči fágům, které využívají tyto molekuly. Dále mohou bakterie využít specifické mechanizmy k ochraně proti invazi cizí DNA, např. R M systémy. Podrobnější informace o možnostech resistence vůči fágům jsou uvedeny v další části této práce. Mezi klasické zástupce polyvalentních fágů u druhu S. aureus patří fág 812, K a G. Bakteriofág 812 patří mezi polyvalentní fágy s rozsáhlým spektrem hostitelských kmenů. Je morfotypu AI a serotypu D (Ackermann a DuBow, 1987) a náleží do čeledi Myoviridae, druhu Twort, tak jako řada dalších polyvalentních fágů se širokým účinkem, jež mají využití ve fágové terapii, např. K l , G l a Twort (Muphy a kol, 1995). Jeho hlava má ikozahedrický tvar o průměru 92 nm, bičík je 209 nm dlouhý, s kontraktilním pouzdrem a bazálni destičkou. Má lineární dsDNA o velikosti 146,5 kb, nemá kohezní konce a obsah G+C v jeho genomu je 35,1% (Pantůček a kol, 1998). Z tohoto fága byla odvozena řada mutant, které dohromady se standardním typem 812 vykazují vysokou účinnost u většiny kmenů - až 95% kmenů S. aureus subsp. aureus a 43% rozličných druhů koaguláza-negativních stafylokoků, např. S. capititis, S. carnosus, S haemolyticus, S. hominis nebo S. epidermisis (Rosypal a kol, 1986; Pantůček a kol, 1998). Na obrázku 6 je vidět postupná izolace mutant v rozmezí hostitele. 19 Obrázek 6: Mutanty v rozmezí hostitele fága 812. V závorce uvedena frekvence mutace a efektivita výsevu. Převzato z Rosypal a kol. (1986). $812 | S A 6 6 (1 - S » lO , 1 .82) P S 4 7 <5.O*10 . 1 .70) 8 I 2 m 3 Í S f2h-S f2h- -4 C C M 251G ( 5 . 1 * 1 0 . 0 . 4 T L S12oS12o P S 04C2.6><10 . 0 . 4 6 )P S 04C2.6><10 . 0 . 4 6 ) fr -o S 26 ( 9 . 9 - 1 0 . 0.43) # í 2 s I B12F3 H S 1160 ( 2 . 3 - 1 0 " , 1.41) 8T2F1 l-N 4 { Í . S H I Ů , Ú . 4 É ) ä 1 S A o 4 * 1 0 . i ai2i8T2F1 ä 1 ai2i F N 34 (4.3~10 , 0.17) Mezi další polyvalentní fágy S. aureus patří bakteriofág K, jenž je blízce příbuzný fágu 812. Jeho velikost je 127,4 kb (O Flaherty a kol, 2004). Fág K je schopný infikovat mnoho koaguláza-negativních i pozitivních druhů stafylokoků (Rountee 1949). U tohoto fága byla také prokázána schopnost prevence utváření biofilmu spolu s dalšími 6 od něj odvozenými fágy (Kelly a kol, 2012). Nově izolovaným fágem je fág MSA6 (Kwiatek a kol, 2012). Byl izolován z kravské mastitidy a jeho genom je 143 kb velký, což odpovídá velikosti fága 812. Morfologicky je podobný fágům z čeledi Myoviridae a náleží do stejné seroskupiny jako fágy druhu Twort. Jeho kapsidový protein vykazuje 82% podobnost sekvence s fágem K. MSA6 je schopen lyžovat 27 testovaných kmenů MRSA z 28 a je tak zřejmě dalším vhodným fágem pro terapeutické účely. 1.3. Fágová terapie V poslední době se hodně studií věnuje možnosti fágové terapie. Nemocniční studie ukázaly, že použitím bakteriofágů na ošetření místností, jako jsou toalety apod., zabraňuje přenosu E. coli na pacienty. Další možností je použití fágové terapie při bakteriální infekci 20 namísto antibiotik. Fágová terapie nabízí mnoho výhod oproti léčbě antibiotiky. Je účinná i na organismy rezistentní k antibiotikům a může být užitá jako alternativní terapie pro pacienty s alergií na antibiotika (Marks a Sharp, 2000). Bakteriofágy nabízí vysokou přesnost k cílovému organismu a zároveň nemají žádny vliv na ostatní organismy. Jsou schopny autoreplikace. Pakliže je cílový organismus přítomen, replikují se, dokud nejsou všechny cílové bakterie zlyzovány. Zároveň v případě, že cílový organismus chybí, vyloučí se z těla ven. Dokáží přirozeně mutovat, aby překonali rezistenci hostitele, případně mohou být v laboratoři zmutovaný záměrně. S rozvíjející se antibiotikovou rezistenci je vyvinutí alternativních terapií stále více urgentní a fágová terapie může mít v budoucnu velký význam jak samostatně, tak v kombinaci s léčbou antibiotiky. Hlavními problémy fágové terapie jsou: I. rezistence bakterií vůči užívaným fágům, II. inaktivace fágových částic imunitním systémem pacienta, III. toxický šok pacienta díky rychlé lyži bakterií a vyplavení toxických látek do krevního oběhu, IV. nutnost přesné diagnostiky původce onemocnění. Studie fágové terapie na myších dokazuje, že se lze těmto problémům vyhnout vhodnou selekcí používaných fágů (Capparelli a kol. 2007). Nejprve byl vybrán fág W S a , který vykazoval největší šíři hostitelů u druhu S. aureus. Dále byl současnou aplikací fága a stafylokoka intravenózne do myši získán mutant M S a , který byl schopen v myších perzistovat až 25 dní. Následně byly prováděny experimenty, jež dokázali účinnost tohoto fága při léčbě. Při aplikování smrtelné dávky kmene AI 70 myším, spolu s fágem M S a přežilo 97% myší a bakterie byly zcela eradikovány již během 4 dnů fágové terapie. Fág byl účinný při lokální, systematické i vnitrobuněčné infekci, stejně tak účinkoval i na MRSA kmeny. Zároveň byl fág dobře tolerován zvířaty, nevyvolal produkci protilátek, ani šok po rychlé bakteriální lyži. Fág fungoval i při aplikaci na již propuklou infekci. Dávky byli aplikováni intravenózne či podkožně, stačila 1 injekce k vyléčení, pouze u abscesů bylo potřeba opakované dávky. V případě tzv. trpasličích kmenů S. aureus byla situace poněkud obtížnější. Tyto kmeny jsou schopné přežívat v hostiteli vnitrobuněčné, zatímco bakteriofág se dovnitř eukaryotické buňky není schopen dostat. I tyto kmeny je možné eliminovat za pomocí bakterií, jež jsou již napadené fágem a zanesou ho dovnitř buňky. Tento experiment tak ukazuje velký potenciál fágové terapie. 21 1.4. Mechanismy rezistence bakterií vůči fágům Je známo mnoho mechanismů, jimiž mohou bakterie zabránit infekci bakteriofágem. Lytický cyklus polyvalentních fágů se skládá z několika kroků (obr. 7) a bakterie vyvinuly rozmanité způsoby rezistence namířené vůči různým stádiím infekce. Obrázek 7: Lytický cyklus polyvalentních fágů. Převzato z: http://textbookofbacteriology.net/; upraveno. Plášť Adsorpce Viiová DNA Vstup DNA v * ř s Lytický cyklus (15 - 60min, 37 °C) Lyže yReplikace DNA Translace, sestavování fágových částic 1.4.1. Zabránění adsorpce fága Nejdříve se fág musí na hostitelskou buňku adsorbovat. Využívá k tomu různé molekuly na povrchu hostitele. U druhu S. aureus je k adsorpci často využíván protein A, který je zároveň virulentním faktorem (Labrie a kol, 2010). Jeho překrytím pak bakterie zabraňuje adsorpci. Polyvalentní fág K však dokázal tuto rezistenci překonat tím, že se navazuje na jinou molekulu, konkrétně na N-acetylglukosamin teichoové kyseliny (Chatterjee, 1969). Při studii rezistence vůči polyvalentnímu fágu K, bylo objeveno, že většina rezistentních kmenů obsahuje R M systémy degradující fágovou DNA (Kelly a kol, 2010). U třech kmenů však byla zjištěna neschopnost adsorpce. Jde tedy o neustálý evoluční boj mezi fágem a jeho hostitelem. Další možností obrany bakterií je produkce extracelulárních polymerů, jež tvoří fyzickou bariéru mezi fágem a bakterií (Labrie a kol, 2010). Přesto se některé fágy dokázaly 22 a d a p t o v a t a n a o p a k r o z p o z n á v a j í t y t o s p e c i f i c k é p o l y m e r y . K y s e l i n a h y a l u r o n o v á j e p r o d u k o v á n a n ě k t e r ý m i s t r e p t o k o k y j a k o u s o u č á s t j e j i c h k a p s u l e . T o j i m p o m á h á u n i k n o u t p ř e d i m u n i t n í m s y s t é m e m i p ř e d b a k t e r i o f á g y ( M o s e s a k o l , 1997). U n ě k t e r ý c h p r o f á g ů b y l y n a l e z e n y g e n y p r o e n z y m y d e g r a d u j í c í k y s e l i n u h y a u l u r o n o v o u , k t e r é n e n i č í j e n t u b a k t e r i á l n í , a l e i t u l i d s k o u a p o m á h a j í t a k b a k t e r i i š í ř i t s e s k r z e p o j i v o v o u t k á ň . U Haemophilus infuenzae s e j e h o f á g H P l c l n e m ů ž e a d s o r b o v a t d í k y f á z o v é v a r i a c i ( Z a l e s k i a k o l , 2005). Z a t o j e z o d p o v ě d n á m o d i f i k a c e g e n u Uc2A p r o p r o t e i n p o d í l e j í c í s e n a s y n t é z e l i p o o l i g o s a c h a r i d ů . 1.4.2. Zabránění vstupu fágové DNA do buňky Dalším krokem je vstup fágové DNA do buňky. Superinfekci vylučující systémy (Sie) jsou složeny z proteinů, které blokují vstup DNA do buňky. Rada z nich je nesena na profágových genomech a většina je známa u gramnegativních bakterií. Jako příklad bych jmenovala dnes již dobře charakterizované systémy I m m a S p u colifága T4. Oba tyto systémy způsobují inhibici injekce D N A a zabraňují tak infekci dalším T4 podobným fágem (Labrie a kol, 2010). Imm zamezuje přenosu fágové D N A do bakteriální cytoplasmy změnou konformace vstupního místa. Obsahuje dvě transmembránové domény, pravděpodobně je lokalizován v membránovém prostoru a je spojen s membránou ve specifických místech ( L u a kol., 1993). Imunita navozená pouze tímto proteinem není kompletní a pravděpodobně je spojen ještě s dalším membránovým proteinem, s nímž je schopen navodit kompletní imunitu. S p je membránový protein, jenž inhibuje aktivitu lysozymu bakteriofága T4 ( L u a Henning, 1994). Ten pak nemůže proděravět buněčnou stěnu a injikovat svoji D N A do buňky. U g r a m p o z i t i v í c h b a k t e r i í b y l o d o s u d o b j e v e n o p o u z e n ě k o l i k m e c h a n i s m ů . V ě t š i n a z n i c h b y l a n a l e z e n a u b a k t e r i e Lactococcus lactis, k t e r á j e u ž í v á n a v p r ů m y s l u p ř i f e r m e n t a č n í c h p r o c e s e c h m l é k a ( A k c e l i k , 1998). N e j l é p e c h a r a k t e r i z o v a n ý m s y s t é m e m j e Sie2oo9- J e n e s e n p r o f á g e m T u c 2 0 0 9 a b y l n a l e z e n i u n ě k o l i k a d a l š í c h m í r n ý c h f á g ů . V ě t š i n a t ě c h t o f á g ů p a t ř í d o s k u p i n y P335 l a k t o k o k o v ý c h f á g ů , a v š a k j i m i n e s e n ý Sie2oo9 z p ů s o b u j e r e z i s t e n c i v ů č i o d l i š n é f á g o v é s k u p i n ě 936, k t e r á j e h l a v n í s k u p i n o u f á g ů v y s k y t u j í c í c h s e v m l é č n é m p r ů m y s l u . ( M c G r a t h a k o l , 2002). K r o m ě t o h o t o s y s t é m u b y l a o b j e v e n a ř a d a d a l š í c h p o d o b n ý c h s y s t é m ů , j e ž j s o u n e s e n y p r o f á g y , n a p ř . S i e m g 2 / 3 i 2 , n e b o S i e x 7 i 2 ( M a h o n y a k o l , 2008). P ř e d p o k l á d á s e , ž e j s o u l o k a l i z o v á n y n a m e m b r á n ě a z a b r a ň u j í v s t u p u DNA d o b u ň k y . D a l š í m z o b j e v e n ý c h f á g o v ý c h g e n ů , z o d p o v ě d n ý c h z a r e z i s t e n c i h o s t i t e l e v ů č i s u p e r i n f e k c i , j e g e n Ipt p r o l i p o p r o t e i n . J e n e s e n f á g e m T P J34, k t e r ý i n f i k u j e Streptococcus 23 thermophilus (Neve a kol, 1998). Tento gen je lokalizován v operonu s třemi dalšími geny (genem pro integrázu a genem pro protein s metaloproteinázovým motivem) a celý operon pak začíná represorem, potřebným k udržení lyzogenního stavu. Je složený ze 142 A M K (von Heijne,1989). Lpt se exprimuje během lyzogenního cyklu a je aktivní proti superinfekci (Sun a kol, 2006). Neovlivňuje adsorpci, ale narušuje injekci D N A do buňky. Lipoproteiny jsou u fágů vcelku vzácné. U fága X se během lyzogenního cyklu exprimují 2 geny pro lipoproteiny, a to gen bor, jehož produkt je zahrnut v rezistentním séru lyzogenních buněk (Barondes a Beckwirth, 1995), a dále gen rzi, jež se uplatní v lytickém cyklu (Kedzierska a kol, 1996). 1.4.3. Restrikčně-modifikační systémy Když nemethylovaná fágová D N A vstoupí do hostitelské buňky, je rozeznána reštrikčním enzymem a degradována (obr. 8). Tato restrikce vede k rozštěpení jakékoliv cizí DNA, která nenese odpovídající metylaci. Malý počet nemodifikovaných fágových genomů je však schopen se tomuto štěpení vyhnout, díky následné replikaci spolu s bakteriálním genomem získává modifikaci methylázou a je schopen se vyhnout restrikci i v následujících infekčních cyklech (Marks a Sharp, 2000). Osud fágové D N A v hostitelské buňce je tedy určen těmito dvěma enzymy. Vlastní D N A mají bakterie modifikovanou metylaci na specifických místech a ta je pak chráněna proti rozštěpení restrikčními endonukleázami. R M systémy se člení do 4 základních typů (typ I, II, III, IV) na základě odlišnosti enzymové struktury, reakčního mechanismu a typu DNA, jež rozeznávají (http://rebase.neb.com). Zástupci všech těchto typů byli nalezeni i u druhu S. aureus. Obr č. 8: Funkce RM systému. Převzato z Tock a Drayen (2005); upraveno. Degradovaná fágová DNA Modifikovaná DNA 24 Aby se fágy vypořádaly s těmito systémy, vyvinuly několik strategií. Jedna z nich je absence míst, která jsou rozeznávána restriktázou, pomocí hromadění bodových mutací. Např. stafylokokový polyvalentní fág K se dokáže vyhnout restrikci tím, že nemá ve svém řetězci sekvenci 5'-GATC- 3', jež je rozpoznávána R M systémem Sau3A (Kruger a kol, 1988). Některé fágy se vyhnou restrikci díky glukosylaci DNA. E. coli CT596 je však schopná atakovat i glukosylovanou DNA a to díky dvoukomponentímu systému složenému ze 2 proteinů: GmrS a GmrD (Bair a kol, 2007). Jsou kódovány profágem a rozpoznávají a rozstřihávají pouze tu DNA, která obsahuje glukosylovaný hydroxymethylcytosin. Rezistence vůči bakteriofágům nemusí bakterii přinášet pouze výhody. Když se bakterie přizpůsobuje prostředí a stává se rezistentní vůči mnoha fágům, často přitom ztrácí původní vlastnosti, např. virulentní faktory. Fágy mohou využívat jako receptor esenciální součást buněčné stěny a tak aby bakterie získala rezistenci, musí se této části zbavit anebo ji pozměnit (Scott a kol, 2007). Díky tomu se může stát méně virulentní. Toho by mohlo být využito při přípravě vakcíny proti stafylokokové infekci ( Capparelli a kol, 2010). Pomocí selekce na rezistenci vůči antibiotikům a fágům byl připraven oslabený kmen AI72. Z něj byla připravena vakcína AI 72 H K (heat killed), která byla následně podána myším. Tyto myši pak byly vystaveny působení MRSA a VRSA kmenů. Vakcína poskytovala efektivní ochranu proti těmto kmenům po dobu nejméně 20 týdnů. Příliš vysoká dávka vakcíny však způsobila úmrtí 40% - 50%. Vakcinace A172HK mění expresi genů (obr. 9), kódujících prozánětlivé cytokiny (IFN-y, Il-P a TNF-a) a indukuje transkripci protizánětlivých cytokinů 11-4 a 11-6 (ten reguluje expresi prozánětlivých cytokinů). Obrázek 9: Protizánětlivá aktivita vakcíny A172. Převzato z Capparelli a kol. (2010). I Z4 fr 43h I I ?4 h 48 h I I 24 h 46 h | | 34 h h I | ?4 h 4S h I T ' V F - o i I ř í í - y L L —l 1 L J I L 1(1 25 Stafylokoková infekce způsobuje zvýšené uvolňování prozánětlivých cytokinů, díky čemuž se zvýší propustnost cév a infekce se rozšíří z krve do tkání (Nilsson a kol, 1998). Zvýšená sekrece INF- y pak způsobuje nekrózu v ledvinách myší, jež jsou nakaženy stafylokoky (Hu a kol, 2003). Vakcinace A172 tak indukuje balancovanou pro i proti zánětlivé imunitní odpovědi ( Capparelli a kol, 2010). Selekční nevýhoda senzitivních bakterií je tak vyvážena sníženou fitness rezistentních bakterií, což přispívá k diverzitě bakteriální populace (Middelboc a kol, 2001). 1.5. Struktura genomu mírných fágů druhu S. aureus Genom mírných fágů má modulové uspořádání. Postupně jsou za sebou řazeny geny, které souvisí s určitými funkcemi. Celkově tak můžeme rozlišit 8 hlavních modulů (obr. 10). Obrázek 10: Modulové uspořádání genů u mírných fágů S. aureus. Převzato z landolo a kol. (2002); upraveno. LYZOGENIE K P L K A C Í REGULACE SBALOVÁW HLAVA BIČÍK VLÁKNA Vili m I h V M ľ l l ' i F EHČÍKU Toto uspořádání nám umožňuje charakteristiku a klasifikaci profágů s využitím jednotlivých modulů. Postupně byly vybrány reprezentativní ORF pro PCR, jež dobře charakterizují jednotlivé moduly a odpovídají jednotlivým typům a podtypům a to s využitím komparativní genomové analýzy dostupných fágových genomů (Pantůček a kol, 2004; Goerke a kol, 2009; Kahánková a kol, 2010). Na základě těchto PCR se tak dají profágy čeledi Siphoviridae dobře charakterizovat (obr. 11). 26 u (/i i/i E LH z ^ 1,-1 o í 'S ICE E B a T5T7T OJ OJ B D I H TJ -ff TJ M t/iW W M P I K K m ó ¥ 3 S í S 3 3 R R i l M S R 0 = O D O D O Í O +•• iů tn up Cl LT! ĹJ LJ T -J •-I ÚO Q O •-• QCTpN Iíl Ž ^ W ^ s c. š s g ^ § uu) tfl ca ca Cfl _ i J> Í R H I I K s B a i S Sí R u en u K Ž?a? s? s? u u v Í; I; V C O" O" s? s? C? 5 KSK U U U Dl 1 : IS i l l i n s R s s R R R ř Ě t ; s s i g § % s . R 3 g H R K g R g g j g g | g | g g | Í g | g g | •o "O "O R s n 9 9 i tu OJ H l § - 3 s «3 ü 'éö o b ö _i ^ ^ M I B —i- ro •in br ^ g g g g | g 3 Ll J n> U ^ 2 13 ; ;; ; ... TI in tu m cn m tri in r.ii nj m r* r* r* IP T B D D D I D O I D S S S S LU LV ft' Í I 3 M W -*u u u u u u u u u u u u Joj ĽJ L1 J ij ib dj J> +i rb i- rjj dj . i l l 1.5.1. Začlenění fágové DNA do genomu bakterie Nejdříve se fágová DNA musí začlenit do bakteriálního genomu, k čemuž využívá enzym integrázu. Ta zprostředkovává jednosměrnou, místně specifickou rekombinaci mezi dvěma úseky D N A (att místa) a vnoří tak fágový genom do hostitelského. Experimentálně byly klasifikovány integrázové typy Saintl - Saint7 (Goreke a kol, 2009). Dále byl přidán Sa8int (nalezený u RF122) a Sa9int (nalezený u PS96);(Kahánková a kol, 2010). 1.5.2. Oblast kontroly lyzogenního stavu Tento region zahrnuje lyzogenní modul kromě genů pro integrázu. Charakteristická vlastnost tohoto regionu je střídání se oblastí s vysokou homologií D N A a segmenty DNA s nízkou homologií (Kahánková a kol, 2010). Pro charakterizaci tohoto modulu byl použit gen pro antirepresor právě díky přítomnosti konzervativních i variabilních oblastí a kvůli ideální délce. Navíc tento gen koreluje s typy kontrolní oblasti lyzogenie a umožňuje tedy rychlé rozpoznání tohoto regionu. Antirepresory jsou většinou složeny ze 2 domén, jež se vážou na DNA. Zároveň je možná rekombinace mezi oblastmi, které tyto domény kódují. U S. aureus bylo identifikováno několik typů domén. První je BRO-N doména, jež se nachází téměř vždy na N konci a často je spojena s C koncovou doménou. Další je KilA-C doména (podílí se na usmrcení hostitelské buňky), AntA doména (antirepresor), ORF6C doména a Rha doména (Iyer etal, 2002). 1.5.3. Modul regulace transkripce Tento modul je vymezen ORF50 *PVL na 5' konci a rinB na 3' konci a obsahuje geny spojené s regulací transkripce. Pro charakterizaci tohoto modulu byl zvolen gen pro dUTPázu. Tento gen má 4 varianty a to duti, dut2, dut3 a dut4. DUTPáza je enzym, který hydrolyzuje dUTP na dUMP pyrofosfát. DUTPázy jsou rozděleny do 4 skupin na základě jejich podobnosti. Mezi skupinami se podobnost pohybuje od 42% do 72%, zatímco uvnitř skupin je podobnost mezi 76% - 100%. (Kahánková a kol, 2010) 1.5.4. Morfologický modul Jedná se o oblast s geny pozdní exprese, které kódují strukturní proteiny pro sbalování DNA, fágovou hlavu a bičík. Podle dotplotového srovnání se všechny tři oblasti u sifofágů přenáší při horizontálním přenosu společně (Kahánková a kol, 2010). Pro diagnostiku byl vybrán nejvíce konzervovaný region pro sbalování DNA. Začíná pravděpodobně krátkým genem pro terminázu a končí genem Clp pro proteázu nebo 28 „prohead" genem u seroskupin F a A, popřípadě hlavovým orfogenetickým proteinem (Mu-F) u seroskupiny B. Zatímco u skupiny A existuje pouze jeden morfogenetický typ, skupina B i F obsahuje ještě další podtypy na základě genu pro portálový protein. Skupina F se dále dělí na Fa a Fb (Pantůček a kol, 2004). U skupiny B bylo rozlišeno 5 podtypů Ba - Be (Kahánková a kol, 2010) obr. Oblast pro tvorbu bičíku odpovídá serologickým skupinámA,B, F a L fágů mezinárodní typizační sady a experimentálních fágů (Pantůček a kol, 2004). Obrázek 12: Dendogramy ukazující podobnost sekvencí morfogenetického modulu u Siphoviridae. Převzato z Kahánková a kol. (2010). 1.5.5. Lytický modul Tento modul je složen pouze z dvou genů a to pro enzymy holin a endolyzin, jež se uplatňují na konci lytického cyklu při buněčné lyži. Endolyzin degraduje buněčnou stěnu, zatímco holin perforuje cytoplazmatickou membránu. Pro charakterizaci pomocí PCR byl vybrán pouze gen pro endolyzin, klasifikace holinu i endolyzinu spolu souvisí (Kahánková a kol, 2010). Většina endolyzinu je modulární struktury a obsahuje C-koncové vazebné (SFBb) aN-koncové katalytické domény (Young, 1992). 29 2. CÍLE PRÁCE Cílem diplomové práce bylo popsat vliv lyzogenie na rezistenco kmenů S. aureus vůči polyvalentním fágům, zjistit které profágy navozují tuto necitlivost a následně tyto profágy blíže charakterizovat z hlediska jejich genomové struktury, obsahu genů a dalších vlastností. Dílčí úkoly: 1. Stanovení citlivosti vybraných kmenů MRSA, obsahujících profágy, k polyvalentním fágům. 2. Výběr vhodných kmenů pro bližší charakterizaci jejich profágů. 3. Charakterizace profágů s využitím PCR pro klasifikaci fágových modulů. 4. Indukce profágů z necitlivých kmenů a následná lyzogenizace kmenů citlivých. 5. Komparativní genomika profágů u nichž jsou dostupné sekvence a jež navozují u svých hostitelů rezistenci. 30 3. MATERIÁL A METODY 3.1. Bakteriální kmeny a bakteriofágy Bakteriofág 812 a jeho mutanty v rozmezí hostitele 812a, 812b, 812i, 812K1 a 812F1 a jejich pomnožovací kmen S. aureus 812 pochází ze sbírky Laboratoře molekulární diagnostiky mikroorganismů (LMDM). Tabulka 1: Studované kmeny 5. aureus. Zdroj kmenů: FN - fakultní nemocnice, LMDM - Laboratoře molekulární diagnostiky mikroorganismů Kmen Původ PS6 (53+) Sbírka LMDM PS47 Sbírka LMDM PS47 (53+) Sbírka LMDM PS47(77+) Sbírka LMDM PS54 (53+) Sbírka LMDM PS83A (53+) Sbírka LMDM 8511 Sbírka LMDM 8511 (53+) Sbírka LMDM 8511(77+) Sbírka LMDM 8511(85+) Sbírka LMDM 8511(84+) Sbírka LMDM S 26 Sbírka LMDM ISP8 Sbírka LMDM ISP8 (53+) Sbírka LMDM ISP8 (53+,77,M+) Sbírka LMDM ISP8 (53+,77+) Sbírka LMDM ISP8 (53+,M+) Sbírka LMDM ISP8 (53-) Sbírka LMDM ISP8 (77+) Sbírka LMDM ISP8 (47+, 11+) Sbírka LMDM ISP8 (47+) Sbírka LMDM ISP8 (85+) Sbírka LMDM 1039 (42E+) Sbírka LMDM CCM5757 Česká sbírka mikroorganismů 420 FN Brno 08/3556 FN Brno E14 FN Brno HDE288 FN Brno FN4 FN Brno 06/1298 FN Brno E19 FN Brno E26 FN Brno 31 09/2650 FN Brno EP17 FN Brno 06/622 Praha Homolka NRL 07/910 FN Brno EP5 FN Brno E48 FN Brno E43 FN Brno E53 FN Brno E29 FN Brno FN32 FN Brno 3A Sbírka LMDM 3C Sbírka LMDM 6 Sbírka LMDM 29 Sbírka LMDM 42D Sbírka LMDM 42E Sbírka LMDM 52 Sbírka LMDM 52A Sbírka LMDM 53 Sbírka LMDM 54 Sbírka LMDM 55 Sbírka LMDM 71 Sbírka LMDM 75 Sbírka LMDM 80 Sbírka LMDM 83A Sbírka LMDM 84 Sbírka LMDM 85 Sbírka LMDM 95 Sbírka LMDM 96 Sbírka LMDM 187 Sbírka LMDM 3.2. Materiál 3.2.1. Kultivační média Masopeptonový agar 1,5% (MPA): Masopeptonový agar 0,7% (MPA): Nutrient broth (Oxoid) 13 g Nutrient broth (Oxoid) 13 g Yeast extract (Oxoid) 3 g Yeast extract (Oxoid) 3 g Pepton (Imuna) 5 g Pepton (Imuna) 5 g Agar (Oxoid) 15 g Agar (Oxoid) 7 g 32 destilovaná voda 1000 ml pH upraveno 10M NaOH na hodnotu 7,2 destilovaná voda 1000 ml pH upraveno 10M NaOH na hodnotu 7,2 Masopeptonový bujón (MPB): Luria-Bertani (LB) bujón: Nutrient broth (Oxoid) 13 g Yeast extract (Oxoid) 3 g Pepton (Imuna) 5 g destilovaná voda 1000 ml ml pH upraveno 10M NaOH na hodnotu 7,2 2*YT médium: Trypton (Oxoid) 16 g Yeast extract (Oxoid) 10 g NaCl (Lachema) 5 g destilovaná voda 1000 ml pH upraveno ÍOM NaOH na hodnotu 7,0 33 Trypton (Oxoid) 10 g Yeast extract (Oxoid) 5 g NaCl (Lachema) 5 g destilovaná voda 1000 pH upraveno ÍOM NaOH na hodnotu 7,0 10* koncentrovaný profágový bujón: Nutrient broth (Oxoid) 3 g NaCl (Lachema) 2 g Yeast extract (Oxoid) 2 g Trypton (Oxoid) 10 g destilovaná voda 100 ml Zamražovací médium HMFM (Hogness modified freezing medium): 3,6mMK2 HP04 0,164 g l , 3 m M K H2 P 0 4 0,035 g 2,0mM citrát sodný 0,118g l,0mMMgSO4 .7H2 O 0,049 g 4,4% (v/v) glycerol 8,8 ml voda doplněna do celkového objemu 200 ml 3.2.2. Materiál pro elektroforézu agaróza na přípravu gelu pro elektroforézu (Lachema, SERVA) agaróua s nízkou teplotou tání na přípravu gelu pro elektroforézu (Lachema, FLUKA) lx koncentrovaný TAE pufr (40mM Tris-acetát, lmM EDTA, pH 8,2) 3.2.3. DNA markery 100 bp DNA ladder (BioLabs) - velikost fragmentů 100 bp - 1 517 bp 34 2-log DNA ladder (BioLabs) - velikost fragmentů 100 bp - 10 000 bp 3.2.4. Materiál pro PCR Taq DNA polymeráza (Invitrogen) 10x koncentrovaný pufir pro PCR bez MgCl2 (Invitrogen) roztok MgCl2 v zásobní koncentraci 50 mM (Invitrogen) nukleotidy dATP, dGTP, dTTP, dCTP v zásobních koncentracích 2 mM (Roche Diagnostics) 2x koncentrovaný FastStart PCR Master (Roche Diagnostics, Německo) 3.3. Laboratorní přístroje Centrifugy: Mini Spin plus (Eppendorf) BR4i (Thermo Electron Corporation) Mikro 220R (Hettich Zentrifugen) Box na PCR Biosan (Biotech) Termocykler T-gradient a T Personal Thermocykler (Biometra) Termostat BT 120 (Laboratorní prístroje Praha) Termostat Shaking incubator SUEL LAB (Biotech) Thermo Shaker TS-100 Biosan (Biotech) Proudový zdroj pro elektroforézu: Power PAC 300 (BioRad) EC 105 (Thermo Electron Corporation) Třepačka Lab Dancer (IKA) Váhy Navigator (OHAUS) Vakuová odparka Savant SPD121P (Thermo Electron Corporation) Vortex-2 Genie (Scientific Industries) Cell Density Meter (WPA Biowave) Digitální kamerový systém EDAS 290 35 (Kodac) pH metr pH210 (HANNA Instruments) Laminární box Steril Antares (Schoeller Spektrofotometr Nanodrop ND-2000c Instruments) (Thermo Scientific) 3.3.1. Počítačový software a internetové nástroje pro analýzu sekvencí BLAST (National Center for Biotechnology Information, USA) - analýza sekvencí mVista (Vista Tools for Comparative Genomics) - analýza sekvencí Oligosearch 6.44 - analýza primerů S.W.O.T Analysis (Protein Bar) - analýza proteinu 3.4. Metody 3.4.1. Stanovení citlivosti lyzogenních kmenů S. aureus k polyvalentním fágům 1. Do 18 hodinové bakteriální kultury S. aureus ve 20 ml MPB byly přidány 2 ml CaCl2 2. 100 ul této kultury bylo nepipetováno do 2,5 ml předem rozvařeného 0,7% M P A vytemperovaného na 45 °C. Obsah zkumavky byl rovnoměrně rozvrstven na misku s 1,5% 3. Po utuhnutí byly na povrch agaru nanášeny lOpl kapky příslušného ředění fágového lyzátu 4. Následně proběhla kultivace 24hod/37 °C. U citlivého kmene se vytvořila jasná lytická zóna, v nižších ředěních byly patrné plaky. V opačném případě byl kmen považován za necitlivý. Pokud se vytvořila pouze matná plocha a ani v nižších ředěních nebyli přítomny plaky, byl kmen považován za necitlivý. (0,02M). MPA. (nejčastěji bylo použito ředění 10"2 a 10"6 ). 36 3.4.2. Titr fágových částic Stanovení titru fágových částic bylo provedeno na standartním kmeni S. aureus 1039. Titry byly prováděny na 3 miskách od každého ředění, aby se odhalila případná chyba v provedení, výsledné počty se zprůměrovaly. 1. Fágový lyzát byl naředěn 10"3 až 10"7 dle očekávaného výsledku (do 0,9 ml bujónu 0,1 ml lyzátu, promícháno, novou pipetou přenést 0,1 ml lyzátu do dalších 0,9 ml bujónu atd.) 2. Do zkumavky s vytemperovaným 0,7% M P A na 45 °C bylo přidáno 100 ml 18hod bakt. kultury obsahující CaC12 do výsledné koncentrace 0,002 M a 100 ml lyzátu v daném ředění; 3. Od jednoho ředění byl proveden výsev na 3 misky 4. Následně probíhala kultivace 18 hod / 37 °C. Na základě ředění a počtu plak na jednotlivých miskách byl poté spočten titr fágových částic v 1 ml indukovaného fágového lyzátu. 3.4.3. Stanovení adsorpce fágů na bakteriální buňku Stanovení adsorpce fágů vychází z předpokladu, že pokud se fágové částice neadsorbují na bakteriální stěnu a zároveň ještě neproběhl celý lytický cyklus, poklesne výrazně titr fágových částic. 1. Byl proveden fágový titr na standardním kmeni 1039 2. Ve zkumavce bylo smícháno 5 ml testované 18tihodinové kultury, 0,5 ml CaCi2 (0,02M) a 0,5 ml testovaného fága. 3. V časových intervalech 5,10 a 20 minut bylo odebráno 0,5 ml směsi. 4. Tato směs byla následně centrifugována (3 min/10 000 rpm) a bylo odebráno 0,2 ml supernatantu. 5. Supernatant byl naředěn až na 10"4 a byl proveden titr fága opět na standardním kmeni 37 3.4.4. Zamrazení bakteriálních kultur 1. Do mikrozkumavky bylo napipetováno 500 ml sterilního HMFM. 2. Do ní byla naočkovánal platinová klička (cca 3 mm3) 24hod kultury narostlé na misce. 3. Na vortexu bylo vše důkladně promícháno a následně umístěno do mrazícího boxu o teplotě -70 °C 3.4.5. Příprava hrubého lyzátu pro PCR 1. 24-hodinová stacionární kultura narostlá v mikrozkumavce v 1 ml média MPB byla centrifugována 4 minuty při 12 000 rpm. 2. Pelet byl resuspendován v 1 ml sterilní vody a centrifugován stejným způsobem jako v předchozím bodě. 3. Pelet byl resuspendován v 1 ml sterilní vody a temperován ve stolním zahřívacím bloku 20 minut při 80 °C (lyže varem). 4. Zlyzované bakteriální buňky byly centrifugovány 4 minuty při 12 000 rpm. 5. Bakteriální D N A uvolněná v supernatantu byla použita jako templát pro PCR. 3.4.6. Multiplex PCR na detekci typu serologické skupiny profágů Na základě strukturních genů byla navržena PCR rozdělující profágy do 4 sérologických skupin. Čtyři páry primerů (SGA1, SGA2; SGB1, SGB2; SGF3, SGF4; SGF5, SGF6) byly odvozeny ze sekvencí, jež kódují strukturní kapsidové proteiny a proteiny bičíkových vláken, poslední pár (SAU1, SAU2) je odvozen z konzervativní sekvence specifické pro druh S. aureus a má tedy funkci pozitivní kontroly. Do serologické skupiny A patří fágy podobné fágu (p3A, do serologické skupiny B fágy podobné fágu (pil, sérologická skupina F, rozdělena na podskupiny Fa a Fb, zahrnuje fágy příbuzné s fágem (p77 (Pantůček a kol, 2004). 38 Tabulka 2: Složení multiplex PCR na detekci typu serologické skupiny profágů. Složení Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Objem deionizovaná sterilní H2 0 14,36 PCRpufr 10x lx 2,50 MgCl2 50 mM 2mM 1,00 dNTP 2mM 0,2 mM 2,50 primery SGA1 + SGA2 100 uM 100 uM 0,15 + 0,15 primery SGB1 + SGB2 100 uM 100 uM 0,12 + 0,12 primery SGF3 + SGF4 100 uM 100 uM 0,20 + 0,20 primery SGF5 + SGF6 100 uM 100 uM 0,10 + 0,10 primery SAU1 + SAU2 100 uM 100 uM 0,10 + 0,10 Taq DNA polymeráza 5 U/ul 1 U 0,30 templátová DNA 100* ředěná, nebo neředěný hrubý lyzát 50 ng 3,00 Tabulka 3: Podmínky multiplex PCR na detekci typu serologické skupiny profágů. Počáteční denaturace 94 °C 5 min lx Denaturace 94 °C 1 min 30xPřipojení příměrů 58 °C 1 min 30 s 30x Prodlužování příměrů 70 °C 1 min 30 s 30x Závěrečné prodlužování příměrů 70 °C 5 min lx Podmínky elektroforézy 1,5% gel 3.4.7. Multiplex PCR na detekci genů pro fágové amidázy Na základě homologie kyseliny aminové a organizace její domény byly vyvinuty 4 páry příměrů detekující 4 typy endolyzinů. Pár ami 1 obsahující CHAP doménu, amidázovou 2 doménu (s N -acetylmuramoyl-L-alaninamidázovou aktivitou) a SH3b doménu. Dále ami 2 s CHAP doménou, amidázovou 3 doménou (s N -acetylmuramoyl-L-alaninamidázovou aktivitou) a SH3b doménou. Pár ami 3 jež obsahuje pouze CHAP doménu a pár ami 4 s CHAP doménou, amidázovou 3 doménou (Kahánková a kol, 2010). 39 Tabulka 4: Složení multiplex PCR směsi na detekci genů pro fágové amidázy. Složení Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Objem [lil] deionizovaná sterilní H2 0 14,5 PCRpufr 10x lx 2,5 MgCl2 25 mM 2,8 mM 1,3 dNTP 2mM 0,216 mM 2,7 primery AMI 12F + AMI 12R 100 uM 10 uM 1,2 + 1,2 primery AMI 1 IF + AMI 1 IR 100 uM 10 uM 1,1 + 1,1 primery AMI 13F + AMI 13R 100 uM 10 uM 1 + 1 primery ETA F + ETA R 100 uM 10 uM 0,75 + 0,75 primery SAU1282 + SAU 1733 100 uM 10 uM 0,5 + 0,5 Taq DNA polymeráza 5 U/ul 1 U 0,30 templátová DNA 100* ředěná, nebo neředěný hrubý lyzát 50 ng 3,00 Tabulka 5: Podmínky multiplex PCR na detekci genů pro fágové amidázy. Počáteční denaturace 95 °C 7 min lx Denaturace 94 °C 45s 23xPřipojení primerů 53 °C 30 s 23x Prodlužování primerů 72 °C 1 min 30 s 23x Závěrečné prodlužování primerů 72 °C 5 min lx Podmínky elektroforézy 1,8% gel 3.4.8. Multiplex PCR na detekci genů pro fágové dUTPázy Tato PCR amplifikuje sekvence DNA, které korespondují s 4 hlavními typy dUTPáz. DUTPázy jsou rozděleny do těchto skupin na základě jejich podobnosti. Mezi skupinami se pohybuje od 42% do 72%, zatímco uvnitř skupin je podobnost mezi 76% - 100%. Duti patří k dUTPázám, které se běžně vyskytují u většiny organismů, zbývající typy dUTPáz jsou členy superrodiny dUTPáz_2 (Kahánková a kol, 2010). 40 Tabulka 6: Složení multiplex PCR směsi na detekci genů pro fágové dUTPázy. Složení Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Objem [ul] deionizovaná sterilní H2 0 9,1 FastStart PCR Master 2x lx 12,5 primery duti F+ duti R 100 uM 0,2 (jM 0,05 + 0,05 primer dut2 F 100 uM 0,2 (jM 0,05 primer dut3 F 100 uM 0,2 (jM 0,05 primer dut4 F 100 uM 0,2 (jM 0,05 primery dut2 -3 -4 R 100 uM 0,2 (j,M 0,05 primery SAU1 + SAU 2 100 uM 0,2 (jM 0,05 + 0,05 templátová DNA 50x ředěná, nebo neředěný hrubý lyzát 50 ng 3,00 Tabulka 7: Podmínky multiplex PCR na detekci genů pro fágové dUTPázy. Počáteční denaturace 95 °C 15 min lx Denaturace 94 °C 30 s 24xPřipojení primerů 57 °C 1 min 30 s 24x Prodlužování primerů 72 °C 1 min 24x Závěrečné prodlužování primerů 72 °C 10 min lx Podmínky elektroforézy 1,5% gel 3.4.9. PCR na detekci genu pro fágový antirepresor Fágové antirepresory jsou rozděleny do 5 základních typů s několika dalšími podtypy (Kahánková a kol, 2010). V této práci byla použita zjednodušená PCR zahrnující nejčastěji se vyskytující typy a to antla, antld, antle, ant2, ant4a a ant 4b. 41 Tabulka 8: složení multiplex PCR směsi na detekci genu pro fágový antirepresor. Složení Zásobní Výsledná Objem Složení koncentrace koncentrace deionizovaná sterilní H2 0 14,36 PCRpufr 10x lx 2,50 MgCl2 50 mM 2mM 1,00 dNTP 2mM 0,2 mM 2,50 primer 53upAR 10 uM 10 (xM 0,5 primer 53lowAR 10 uM 10 (xM 0,25 primer 47upAR 10 uM 10 (xM 0,5 primer ETA2upAR 10 uM 10 (xM 0,25 primer X21owAR 10 uM 10 (xM 0,25 primer 8OlowAR 10 uM 10 (xM 0,25 primer PV831owAR 10 uM 10 (xM 0,5 primer MR1 lup AR 10 (xM 10 (xM 0,25 primer MR11lowAR 10 (xM 10 (xM 0,25 primer 13upAR 10 (xM 10 (xM 0,25 primer 13lowAR 10 (xM 10 (xM 0,5 primer 29upAR 10 (xM 10 (xM 0,25 primer 88upAR 10 (xM 10 (xM 0,25 primer 881owAR 10 (xM 10 (xM 0,25 primer SAU 1282 10 (xM 10 (xM 0,1 primer SAU 1733 10 (xM 10 (xM 0,1 Taq DNA polymeráza 5 U/^il 1 U 0,30 templátová DNA 50x ředěná, nebo neředěný hrubý lyzát 50 ng 3,00 42 Tabulka 9: Podmínky multiplex PCR na detekci genu pro fágový antirepresor. Počáteční denaturace 95 °C 5 min lx Denaturace 94 °C 45 s 26xPřipojení primerů 49 °C 45 s 26x Prodlužování primerů 72 °C 45 s 26x Závěrečné prodlužování primerů 72 °C 5 min lx Podmínky elektroforézy 3,5% gel FLUKA 3.4.10. Návrh a optimalizace simplex PCR na detekci genu pro neznámý protein Pomocí softwaru Oligosearch 6.44 byl navržen pár primerů k sekvenci 53ORF016 a následně vyroben firmou Invitrogen. Tabulka 10: Primery pro 530RF16 Primer Sekvence délka Tm° délka produktu TP-F TATCGTATTATGCTGCAACGG 21bp 62,3 291 bp TP-R TTATAAATTCGGTATTGGTGACT 23bp 58,1 291 bp Tabulka 11: Složení simplex PCR směsi pro 53ORF016 Složení Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Objem m deionizovaná sterilní H2 0 15,3 PCRpufr 10x lx 2,5 MgCl2 100 mM 2,5 mM 1 dNTP 2mM 0,2 mM 2,5 primer TP F 100 uM 100 uM 0,2 primer TP R 100 uM 100 uM 0,2 Taq DNA polymeráza 5 U/ul 1 U 0,30 templátová DNA 50x ředěná, nebo neředěný hrubý lyzát 50 ng 3,00 43 Tabulka 12: Podmínky simplex PCR na detekci 53ORF016 Počáteční denaturace 95 °C 8 min lx Denaturace 95 °C 30 s 3OxPřipojení primerů 53 °C 30 s 3Ox Prodlužování primerů 72 °C 30 s 3Ox Závěrečné prodlužování primerů 72 °C 5 min lx Podmínky elektroforézy 1,2% gel 3.4.11. Elektroforéza v agarózovém gelu Elektroforéza byla prováděna v 1 x koncentrovaném TAE pufru, který byl získán naředěním 50x koncentrovaného zásobního roztoku (242 g Tris-base; 51,7 ml ledové kyseliny octové; 100 ml 0,5 M EDTA s pH 8,0; H 2 0 doplněna do 1 000 ml; výsledná hodnota pH 8,2). DNA byla separována v agarózovém gelu dle podmínek PCR, velikost napětí byla standardně nastavena na hodnotu 5 V/cm.Po proběhnutí elektroforézy byl agarózový gel barven v roztoku ethidium bromidu o koncentraci 1 p g/ml po dobu 30 min., poté byl opláchnut destilovanou vodou a fotografován pod U V světlem při 302 nm 3.4.12. Indukce profágů UV zářením 1. 10 pl bakteriální kultury (donorový kmen) bylo naočkováno do 10 ml MPB a kultivováno 18 hodin při37°C. 2. Kompletní objem kultury byl přenesen do 50 ml MPB v 200ml Erlenmeyerově baňce a byl provzdušňován 2 hodiny při 37 °C za třepání o rychlosti 120 rpm. 3. Poté bylo 45 ml kultury přeneseno do 50 ml kónické zkumavky a centrifugováno 20 minut při 3 000 rpm. 4. Pelet byl resuspendován ve fyziologickém roztoku do hodnoty optické hustoty 0,15 (při vlnové délce 600 nm). 5. 10 ml takto naředěné buněčné suspenze bylo pipetováno do sterilní Petriho misky a ozářeno v indukční skříni (odkryté víčko na Petriho misce). Vzdálenost misky od U V lampy a dobu 44 ozařování lze měnit tak, aby byl po indukci dosažen vysoký titr fágových částic. Kulturu je po ozáření potřeba co nejvíce chránit před viditelnou složkou světla. 6. Ozářená suspenze byla přenesena do sterilní Erlenmeyerovy baňky spolu s 30 ml fyziológ, roztoku a 10 ml 10x koncentrovaného profágového bujónu. Obsah baňky byl poté přenesen do 250ml provzdušňovačky a provzdušňován v temnu 2 hodiny při 37 °C do zlyzování buněk. 7. V případě neúplné lyže byl fágový lyzát ponechán přes noc v temnu při laboratorní teplotě. 8. Po projasnění byl lyzát zcentrifugován 10 minut při 5 000 rpm a zfiltrován přes komerčně dodávaný filtr (Millipore Millex, velikost pórů 0,45 um). 3.4.13. Lyzogenizace 1. 20 ixl rozmražené kultury buněk kmene S. aureus 1039 bylo naočkováno do 20 ml MPB a inkubovalo se 18 hod. při 37 °C. 2. Poté byly přidány 2 ml narostlé kultury do 50 ml MPB, 1 ml narostlé kultury do 20 ml MPB a kultury byly provzdušňovány 2 hod. při 37 °C do hustoty ODóoo = 0,3 (cca 2x10 buněk). 3. Do celkového objemu 50 ml byla namíchána lyzogenizační směs 1:1 (fág : buňka), do 20 ml byly namíchány směsi 10:1 (fág : buňka) a 1:10 (buňka : fág), používal se lyzát fága o titru cca 2 x 108 PFU, do směsí byla přidána 1/10 0,02 M CaCl2 . 4. Směsi byly ponechány lyžovat přibližně 2 hod. při 37 °C za provzdušňování, poté byly uloženy do druhého dne v chladu a ve tmě. 5. Byla provedena centrifugace po dobu 15 min. při 4500 ot./min., supernatant byl odlit. 6. Sediment byl 2x promyt v 5 ml sterilního promývacího lyzogenizačního roztoku (0,15 M NaH2 P04 ; 0,15 MNa2 HP04 ; 0,01 M citrát sodný). 7. Následně byl sediment rozsuspendován v 1 ml MPB, naředěn fyziologickým roztokem na 10° -ÍO"4 . 8. Z každého ředění bylo naočkováno 0,1 ml na 3 misky s M P A s 0,01 M citrátem sodným a rozetřeno skleněnou hokejkou. 45 9. Kultivace 18 hod. při 37 °C. 10. Jednotlivé kolonie byly přečárkovány sterilním párátkem (výběr alespoň 30 kolonií) na MPA s 0,01 M citrátem sodným, kultivace 20 hod. při 37 °C. 11. Kolonie byly 3 x pasážovány na M P A s 0,01 M citrátem sodným, pokaždé byly kultivovány 20 hod. při 37 °C. 12. Byl proveden test na rezistenci k původnímu fágu, kterým byl kmen lyzogenizován. Na misku s M P A (bez citrátu) byly naočkovány kličkou čárky (čárky označit čísly stejnými jako kultury podle matrice). Na ně bylo nakápnuto 10 ul lyzátu původního fága. Kultivace 20 hod. při 37 °C a dle potřeby dále 72 hod. při 25 °C. 13. U rezistentních kultur byly připraveny hrubé buněčné lyzáty a provedena PCR pro detekci genu amidázy. 46 4. V Ý S L E D K Y 4.1. Citlivost vybraných kmenů S. aureus k polyvalentním fágům Prvním krokem bylo otestovat vybrané kmeny k polyvalentnímu fágu 812 a jeho mutantám v rozmezí hostitele. Na základě testů citlivosti byly vybírány kmeny na podrobnější zkoumání. Testování citlivosti bylo provedeno na uměle lyzogenizovaných kmenech, na kmenech s neznámými profágy a na kontrolních kmenech bez profágů. První testování citlivosti uměle lyzogenizovaných kmenů bylo provedeno již dříve v L M D M . Jelikož řada kmenů vykazovala odlišné výsledky, byly tyto testy opakovány a rozšířeny (tab. 13). Dále bylo provedeno testování citlivosti na propagačních kmenech mezinárodní řady mírných fágů (PS kmeny, tab. 14). Obrázek 13 : Test citlivosti kmene PS6(53+) k fágu 812a. Citlivý kmen vůči tomuto fágu. 47 Tabulka 13: Citlivost vybraných kmenů k polyvalentnímu fágu 812 a jeho mutantám. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; -, m rezistentní kmen Bakteriální kmen Citlivost k fágům Bakteriální kmen 812 812a 812b 812i Kl Fl PS kmeny a lyzogeny PS6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ PS kmeny a lyzogeny PS6 (53+) m ++ m ++ ++ ++ PS kmeny a lyzogeny PS47 m ++ m ++ ++ ++ PS kmeny a lyzogeny PS47 (53+) m ++ m ++ ++ ++PS kmeny a lyzogeny PS47 (77+) - ++ - ++ ++ ++ PS kmeny a lyzogeny PS54 ++ ++ ++ ++ ++ ++ PS kmeny a lyzogeny PS54 (53+) - ++ - ++ ++ ++ PS kmeny a lyzogeny PS83A - ++ - ++ ++ ++ PS kmeny a lyzogeny PS83A (53+) - ++ - ++ ++ ++ 8511 a lyzogeny 8511 ++ ++ ++ ++ ++ ++8511 a lyzogeny 8511 (53+) - M - m m m 8511 a lyzogeny 8511 (77+) ++ ++ ++ + ++ ++ 8511 a lyzogeny 8511 (85+) ++/m ++/+ ++/m +/+ +/+ +/m 8511 a lyzogeny 8511 (84+) ++ ++ ++ ++ ++ ++ S 26 S 26 - ++ m ++ + ++ ISP8 a lyzogeny ISP8 ++ ++ ++ ++ ++ ++ISP8 a lyzogeny ISP8 (53+) - ++ - ++ ++ ++ ISP8 a lyzogeny ISP8 (53+,77,M+) - ++ - ++ ++ ++ ISP8 a lyzogeny ISP8 (53+,77+) - ++ - ++ ++ ++ ISP8 a lyzogeny ISP8 (53+,M+) - ++ - ++ ++ ++ ISP8 a lyzogeny ISP8 (53-) .7 + - ?/+ ++ ++ ISP8 a lyzogeny ISP8 (77+) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ISP8 a lyzogeny ISP8 (47+, 11+) - + - + + + ISP8 a lyzogeny ISP8 (47+) - ++ m ++ ++ ++ ISP8 a lyzogeny ISP8 (85+) ++ ++ ++ ++ ++ Tabulka 14: Citlivost PS kmenů k polyvalentnímu fágu 812 a jeho mutantám. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; -, m rezistentní kmen PS kmeny Citlivost k fágům PS kmeny Citlivost k fágůmPS kmeny 812 812a Kl Fl PS kmeny 812 812a Kl Fl 3A ++ ++ ++ ++ 55 ++ ++ ++ ++ 3C ++ ++ ++ ++ 71 ++ ++ ++ 6 ++ ++ ++ ++ 75 ++ ++ ++ ++ 29 ++ - - - 80 ++ ++ ++ ++ 42D ++ ++ ++ ++ 83A - ++ - ++ 42E ++ ++ ++ ++ 84 - - - - 52 ++ ++ ++ ++ 85 - - - - 52A ++ ++ ++ ++ 95 - - - - 53 ++ ++ ++ ++ 96 ++ ++ ++ ++ 54 ++ ++ ++ ++ 187 ++ ++ ++ ++ Při pohledu na výslednou tabulku je patrné, že se některé kmeny staly po lyzogenizaci necitlivé k polyvalentním fágům. Prvním profágem, jež u svých hostitelů navozuje rezistenci je fág 53 (Rosypal a Horáková, 1968). Tento fág způsobil necitlivost původně citlivých kmenů 8511, ISP8 či PS6. Obdobnou rezistenci navozuje i fág 47. U dalších profágů nebylo navození rezistence zaznamenáno. Fágy 53 a 47 tak zřejmě nesou neznámý mechanismus pro navození rezistence. Mnoho kmenů, jež jsou rezistentní, obsahují přirozeně ve svém genomu řadu neznámých profágů (např. PS47, PS83A či některé nemocniční kmeny). Proto bylo třeba blíže určit tyto profágy za pomocí několika PCR na detekci genů charakterizujících jednotlivé fágové moduly - viz další část této páce. 4.2. Stanovení schopnosti adsorpce polyvalentních fágů 812 a 812a na buňky S. aureus V rámci bližšího určení mechanismu rezistence byla testována schopnost lytických fágů adsorbovat se na hostitelskou buňku v závislosti na citlivosti nebo rezistenci hostitelského kmene. Jako zástupce polyvalentního fága byl vybrán fág 812, jež je schopen tvořit plaky na řadě kmenů, ale má menší hostitelské spektrum než jeho mutanta 812a. Taje schopna překonat rezistenci většiny kmenů. Pro pozitivní kontrolu (kmen citlivý vůči oběma kmenům) byl zvolen kmen ISP8. Dále lyzogenní kmen ISP8 (53+), který je citlivý pouze vůči fágu 812a a kmen PS85, jenž je rezistentní vůči oběma fágům. Po stanovení počátečního titru probíhala inkubace s bakteriální kulturou 10 min, následně byla provedena centrifugace a fágový titr na citlivém kmenu S. aureus ISP8. V tab. 15 jsou zaznamenány výsledné titry fágů po inkubaci, jejich původní titr a procentuální vyjádření zůstatku vůči původnímu titru. Pokaždé došlo ke snížení titru po inkubaci, a tedy k adsorpci fágů na hostitelské buňky. Z grafů 1 a 2 je patrné, že jsou rozdíly mezi různými kmeny, není však výrazný rozdíl mezi adsorpci obou fágů na daném kmeni. Tabulka 15: Adsorpce fágů na kmenech ISP8, ISP8 (53+) a PS85. fág 812 fág 812a Původní titry fágů*: 2,3xl09 24,3xl08 Bakteriální kmen Výsledné titry fágů ISP8 3,3 x 107 1,4% 8,8 x 107 3,6% ISP8 (53+) 1,3 x 109 56,5% 1,4 x 109 60% PS85 1,5 x 109 67,4% 1,7 x 109 72,1% 49 Grafy 1 a 2: Adsorpce fágů 812 a 812a na kmenech ISP8 (53+) a PS85 Pro ověření byly provedeny pokusy s dalším rezistentními i citlivými kmeny. Inkubace fágů probíhala v intervalech 5, 10 a 20 minut. Výsledek však opět potvrdil předchozí experimenty a žádný výrazný rozdíl adsorpce mezi fágy nebyl zaznamenán. Tabulka 16: Adsorpce fágů 812 a 812a na kmenech ISP8 (47+) a ISP8 (85+) ISP8 (47+) - necitlivý k 812, citl. k 812a; ISP8 (85+) - citl. k 812, 812a Původní titry 812 812aPůvodní titry 4x109 3,9xl09 Kmen Výsledné titry; čas inkubace: 5 min ISP8 4,6xl08 12% 6,5xl08 16,55% ISP8 (47+) l,7xl08 5% 3,5xl08 9,00% ISP8 (85+) l,6xl08 4% 1,4x108 3,50% čas inkubace: 10 min ISP8 2,2x108 5% 2,5xl08 6% ISP8 (47+) 6x107 2% 7,5xl07 2% ISP8 (85+) 1,4x108 3% 7,5xl07 2% čas inkubace 20 min ISP8 3,7xl08 9% 2,lxl08 5% ISP8 (47+) l,5xl08 4% 7,2x107 2% ISP8 (85+) lxlO8 3% 7,lxl07 2% 50 Tabulka 17: Adsorpce fágů 812 a 812a na kmenu IPS8 (53+), citlivém pouze k fágu 812a. * Bakteriofág 812 812a Původní titry 3,5xl09 4,3xl09 Kmen Výsledné titry - čas inkubace: 5 min ISP8 3,3 xlO8 9,40% 3,7xl08 8% ISP8 (53+) 2,5xl07 0,70% 5xl07 1,20% čas inkubace: 10 min ISP8 l,5xl08 4,30% l,9xl08 4,50% ISP8 (53+) lxlO7 0,30% 6x107 1,30% čas inkubace 20 min ISP8 8 xlO7 2,30% 5,5x10' 1,30% ISP8 (53+) lxlO7 0,30% 5xl06 0,10% Graf 3: Adsorpce fága 812 na kmenech ISP8, ISP8 (47+), ISP8 (85+) a ISP8 (53+). í 8 1 2 čas inkubace (min) 51 Graf č. 4. Adsorpce fága 812a na kmenech ISP8, ISP8 (47+), ISP8 (85+) a ISP8 (53+). i 812a čas inkubace (min) 4.3. Profágový profil u vybraných kmenů Necitlivé kmeny vůči polyvalentním fágům spolu s několika citlivými kmeny byly dále charakterizovány z hlediska obsahu profágů. Profágy obsažené v těchto kmenech byly klasifikovány pomocí čtyř PCR zaměřených na jednotlivé fágové moduly a to na morfologický modul, lytický modul, modul regulace transkripce a modul kontroly lyzogenního stavu. 4.3.1. Morfologický modul profágů Nejdříve byla provedena PCR na detekci profágů spadajících do 4 různých serologických skupin - A, B, Fa a Fb. Dosavadní studie dávaly předpoklad, že většina rezistentních kmenů bude obsahovat ve svém genomu profága patřícího do sérologické skupiny B, tento předpoklad se však nepotvrdil. Nejdříve byly otestovány některé uměle lyzogenizované kmeny (tab. 18). V genomu kmene 8511 byly detekovány profágy spadající 52 do 3 různých sérologických skupin, včetně skupiny B, přesto tento kmen nevykazuje sníženou citlivost vůči polyvalentním fágům. Obrázek 13: PCR na detekci sérologických skupin profágů u vybraných kmenů. PS47 (77+) - pozitivní kontrola; 1039 a H2 0 - negativní kontrola. & ^ ^ p: £ f ž í & R2 i - + + + r-- C O oo• — • '-—-' T T T T— ^—LTJ (,0 co ( O W. iŕ5: C 4 ; Si ?£. !& ÍS ^ c o r - . ! ^ ^ ! ; e ? ^ ^ ^ ^ co OD L L - < - l - l - Q _ 0 _ Q _ Q _ C O 0 O 00 C O W Síí — w bp Seroskupina Následně byl otestován soubor nemocničních kmenů, u nichž byla citlivost stanovená již dříve v laboratoři L M D M . (tab. 19). Z výsledků je patrné, že i profág ze skupiny Fa může navodit rezistenci. 53 Tabulka 18: Výsledky PCR na detekci serologických skupin profágů u lyzogenních kmenů spolu s citlivostí k polyvalentním fágům. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; -, m rezistentní kmen Citlivost k fágům Serologické Bakteriální kmen 812 812 812 812 K l Fl skupiny a b i PS6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ B PS6 (53+) m ++ m ++ ++ ++ A, B PS47 m ++ m ++ ++ ++ A,B, Fb PS PS47 (53+) m ++ m ++ ++ ++ A,B, Fb kmeny PS47(77+) - ++ - ++ ++ ++ A,Fa,B, Fb a jejich PS54 ++ ++ ++ ++ ++ ++ Fa,B lyzogeny PS54 (53+) - ++ - ++ ++ ++ Fa,B PS83A - ++ - ++ ++ ++ A,Fa,B PS83A (53+) - ++ - ++ ++ ++ A,Fa,B 8511 a 8511 ++ ++ ++ ++ ++ ++ A,Fa,B jeho 8511 (53+) - M - m m m A,Fa,B lyzogeny 8511 (77+) ++ ++ ++ + ++ ++ A,Fa,B 8511 (85+) ++/ m ++/ + ++/ m +/+ +/+ +/ m A,Fa,B 8511 (84+) ++ ++ ++ ++ ++ ++ A,Fa,B S 26 S 26 - ++ m ++ + ++ A,Fa,B ISP8a ISP8 ++ ++ ++ ++ ++ ++ jeho ISP8 (53+) - ++ - ++ ++ ++ B lyzogeny ISP8 (53+,77,M+) - ++ - ++ ++ ++ A,Fa,B ISP8 (53+,77+) - ++ - ++ ++ ++ Fa,B ISP8 (53+,M+) - ++ - ++ ++ ++ A,B ISP8 (53-) + - ?/+ ++ ++ ISP8 (77+) ++ ++ ++ ++ ++ ++ Fa ISP8 (47+, 11+) - + - + + + A,B ISP8 (47+) - ++ m ++ ++ ++ A ISP8 (85+) ++ ++ ++ ++ ++ ++ B Tabulka 19: Výsledky PCR na detekci serologických skupin profágů u nemocničních kmenů spolu s citlivostí k polyvalentním fágům. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; -, m rezistentní kmen Bakteriální kmen Serologické skupiny Citlivost k fágům Bakteriální kmen Serologické skupiny 812 812a 812b 812i Kl Fl S 420 Fa,B m m m - m ++ - 08/3556 Fa - - - - - - E14 Fa m m m m m m m HDE288 A,Fa,B - - m m ++ m FN4 Fa,B - - m - m ++ - 06/1298 Fa - - - - m - E19 A,Fa,B - ++ m ++ ++ ++ ++ E26 A,Fa,B ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 09/2650 A,Fa,B - - - - - ++ - 54 Pro doplnění je přiložena tabulka se serologickými skupinami PS kmenů, které byly testovány dříve v laboratoři L M D M . (tab. 20). Z ní je patrné, že rezistentní kmeny obsahují nejčastěji profágy skupiny B a Fa. Většina kmenů však obsahuje několik profágů a s rezistencí mohou souviset fágy z jakékoliv serologické skupiny Tabulka 20: Výsledky PCR na detekci serologických skupin profágů u PS kmenů spolu s citlivostí k polyvalentním fágům. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; -, m rezistentní kmen PS kmeny Serologické skupiny Citlivost k fágůmPS kmeny Serologické skupiny 812 812a K l Fl 3A Fa ++ ++ ++ ++ 3C ++ ++ ++ ++ 6 B ++ ++ ++ ++ 29 Fa,Fb, B ++ - - - 42D Fa ++ ++ ++ ++ 42E Fa ++ ++ ++ ++ 52 Fa,Fb ++ ++ ++ ++ 52A Fa,Fb ++ ++ ++ ++ 53 A,Fa,B ++ ++ ++ ++ 54 Fa,B ++ ++ ++ ++ 55 Fb ++ ++ ++ ++ 71 Fb ++ ++ ++ ++ 75 Fa,B ++ ++ ++ ++ 80 Fa,Fb ++ ++ ++ ++ 83A A,Fa,B - ++ - ++ 84 Fa,B - - - - 85 Fa,B - - - - 95 Fa,B - - - - 96 Fb ++ ++ ++ ++ 187 Fa ++ ++ ++ ++ 4.3.2. Lytický modul profágů Vybrané kmeny byly dále testovány na přítomnost genů pro 4 typy fágových amidáz. Amidázy jsou enzymy, které se uplatní na konci lytického cyklu při pronikání nových fágových částic ven z buňky a používají se na typizaci lytického modulu. Účelem této PCR bylo blíže specifikovat profágy, zároveň lze konstatovat, že nebyla nalezena korelace mezi lytickým modulem a citlivosti. Všechny typy amidáz se nacházely u kmenů citlivých i rezistentních (tab. 21). 55 Obrázek 14: PCR na detekci genů pro fágové amidázy. PS47 (77+), 98/534, 04/754 pozitivní kontroly, 1039 a H2 0 - negativní kontroly 56 Tab č. 21: Výsledky PC R na detekci genů pro fágové amidázy spolu s citlivostí k polyvalentním fágům. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; -, m rezistentní kmen Bakteriální kmen Souhrn Citlivost k fágům Bakteriální kmen Souhrn 812 812a 812b 812i K l Fl Stafal 420 Amil,ami3 m m m - m +++ - 08/3556 Ami3 - - - - - - E14 Ami3 m m m m m m m HDE288 Ami3,ami4 - - m m +++ m FN4 Amil - - m - m +++ - 06/1298 Ami2,ami3 - - - - m - E19 Ami2,ami3 - +++ m +++ +++ +++ +++ E26 Ami 1 ,ami2,ami3,ami4 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 09/2650 Amil,ami2,ami3 - - - - - + PS6 Ami4 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ PS29 Amil,ami2,ami3 + - +++ +++ - - n PS 47 Amil,ami2,ami3 m +++ m +++ +++ +++ n PS 54 Ami2,ami3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ n PS 83A Ami2,ami3 - +++ - +++ +++ +++ n PS 84 Amil,ami2,ami3 - - - - - - PS 85 Amil,ami2,ami3 - - - - - - PS 95 Amil,ami3 - - - - - - - 8511 Ami2,ami3 ++ +++ ++ +++ +++ +++ n S26 Amil,ami2,ami3 - ++ -m ++ + ++ n ISP8 - +++ +++ +++ +++ +++ +++ ISP8 (53-) - + + + + + + + 57 4.3.3. Modul regulace transkripce Další PCR byla zaměřena na modul regulace transkripce a to na gen pro dUTPázu, který má 4 varianty. Zastoupení více typů dUTPáz v jednom kmeni bylo již vzácnější oproti amidázám a většina kmenů obsahuje pouze jeden typ dUTPázy. Zajímávaje např. porovnání kmenů PS29 a PS54. Oba obsahují stejné profágové dUTPázy, liší se však v citlivosti k polyvalentním fágům. Dále je zde časté spojení dUTPázy 3 s amidázou 3 a serologickou skupinou Fa, tyto kmeny jsou současně i rezistentní k fágům, může se tedy jednat o stejného profága. Obr.č. 15: PCR na detekci genů pro fágové dUTPázy. PS47 (77+), N315, fág X2 pozitivní kontroly, 1039 a H2 0 - negativní kontroly i i 58 Tab č. 22: Výsledky PCR na detekci genů pro fágové dUTPázy, v souhrnu s dalšími testovanými moduly a s citlivostí k polyvalentním fágům. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; -, m rezistentní kmen Bakteriální kmen Citlivost k fáeům Fágové modulyBakteriální kmen 812 812 a 812 b 812 K l Fl S ser. sk. amidázy dUTPázy 420 m m M - M ++ - Fa,B Amil,ami3 dUTP2 08/3556 - - - - - - - Fa Ami3 dUTP3 E14 m m M m M m m Fa Ami3 dUTP3 HDE288 - - M m ++ m - A,Fa,B Ami3,ami4 dUTP3 FN4 - - M - M ++ - Fa,B Amil dUTPl 06/1298 - - - - M - - Fa Ami2,ami3 dUTP3 E19 - ++ M ++ ++ ++ ++ A,Fa,B Ami2,ami3 dUTPl E26 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ A,Fa,B Amil,ami2, ami3,ami4 dUTPl,dU TP2 09/2650 - - - - - ++ - A,Fa,B Amil,ami2, ami3 dUTP2 PS6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ B Ami4 dUTP3 PS29 + ++ ++ ++ Fa,Fb, B Amil,ami2, ami3 dUTPl, dUTP2, dUTP3, dUTP4 PS 47 m ++ M ++ ++ ++ ++ A, B, Fb Amil,ami2, ami3 dUTPl, dUTP3 PS 54 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ A,Fa, B Ami2,ami3 dUTPl, dUTP2, dUTP 3, dUTP4 PS 83A - ++ - ++ ++ ++ ++ A,Fa,B Ami2,ami3 dUTPl,dU TP 3 PS 84 - - - - - - - Fa,B Amil,ami2, ami3 dUTP3 PS 85 - - - - - - - Fa,B Amil,ami2, ami3 dUTPl,dU TP 3 PS 95 - - - - - - - Fa, B Amil,ami3 dUTP3 8511 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ A,Fa,B Ami2,ami3 dUTPl, dUTP2, dUTP3 S26 - ++ M ++ + ++ ++ A,Fa,B Amil,ami2, ami3 dUTPl ISP8 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - ISP8(53-) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - - 59 4.3.4. Modul kontroly lyzogenního stavu Jako poslední PCR byla vybrána PCR na detekci genu pro antirepresor. Jednotlivé typy antirepresorů korelují s modulem kontroly lyzogenního stavu. Byla provedena pouze zjednodušená varianta PCR, jež byla pro účely specifikace profágů postačující (tab. 23). Potvrdila se souvislost určitých modulů a patrně se tak jedná o stejného profága, který je obsažen v genomu E14, 08/3556, 06/1298, PS85 a PS95. Tento fág navozuje necitlivost svého hostitele vůči polyvalentnímu fágu 812 a všem jeho mutantám. Tuto myšlenku bylo třeba potvrdit indukcí tohoto profága a následnou lyzogenizací bezprofágového citlivého kmene (viz dále). Dodatečně byly charakterizovány některé kmeny s již známou citlivostí a některými fágovmi moduly (Streitová, 2013; tab. 24). Obrázek 16: PCR na detekci genů pro fágové antirepresory. PS47 (77+), 1039 (96+), Groeningen U, 04/754, 1039(47+) - pozitivní kontroly, 1039 a voda - negativní kontroly 60 Tab č. 23: Výsledky PCR na detekci genů pro fágové antirperesory, v souhrnu s dalšími testovanými moduly a s citlivostí k polyvalentním fágům. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; -, m rezistentní kmen Bakteriální kmen Citlivost k fágům Fágové modulyBakteriální kmen 812 812a 812b 812i K l Fl S serologické skupiny amidázy dUTPázy antirepresory 420 m m m - m ++ - Fa,B Amil,ami3 dUTP2 antla 09/2650 - - - - - ++ - A,Fa,B Amil,ami2,ami3 dUTP2 antla, ant4b FN4 - - m - m ++ - Fa,B Amil dUTPl antla, ant4b 08/3556 - - - - - - - Fa Ami3 dUTP3 ant4b E14 m m m m m m M Fa Ami3 dUTP3 ant4b 06/1298 - - - - m - - Fa Ami2,ami3 dUTP3 antle, ant4b PS 85 - - - - - - - Fa,B Amil,ami2,ami3 dUTPl,dUTP3 ant4a, ant4b PS 95 - - - - - - - Fa, B Amil,ami3 dUTP3 ant4b PS 84 - - - - - - - Fa,B Amil,ami2,ami3 dUTP3 ant4a HDE288 - - m m ++ m - A,Fa,B Ami3,ami 4 dUTP3 PS29 + ++ ++ ~ - ++ Fa,Fb, B Amil,ami2,ami3 dUTPl,dUTP2, dUTP3, dUTP4 antla, ant 4b E19 - ++ m ++ ++ ++ ++ A,Fa,B Ami2,ami3 dUTPl antld, ant 4b PS 83A - ++ - ++ ++ ++ ++ A,Fa,B Ami2,ami3 dUTPl,dUTP3 ant4b PS 47 m ++ m ++ ++ ++ ++ A, B, Fb Amil,ami2,ami3 dUTPl,dUTP3 antla, ant la S26 - ++ m ++ + ++ ++ A,Fa,B Amil,ami2,ami3 dUTPl ant la, ant 4b 8511 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ A,Fa,B Ami2,ami3 dUTPl,dUTP2,dUTP3 E26 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ A,Fa,B Ami 1 ,ami2,ami3,ami4 dUTPl,dUTP2 antld, ant 4a, ant 4b PS 54 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ A,Fa, B Ami2,ami3 dUTPl,dUTP2, dUTP3, dUTP4 ant4a, ant 4b PS6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ B Ami4 dUTP3 ant4b ISP8 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - - - 61 Tab č. 24: Klasifikace kmenů převzatých od Markéty Štreitové.* mnou testované moduly, N netestováno ++ ,+ lyže, citlivý kmen; - (m) rezistentní kmen. ** kmen testovaný dříve v LMDM. Charakteristika kmenů Testované fágy Fágové moduly kmen CC spa typ SCCmec 812 812a 812b 812i Fl/812 Kl/812 int ser. sk. antirep.* amidázy* E14 8 t030 INA - - - - - - Sa3 Fa ant4b ami3 - - - - - - Sa3 Sa7 antle,ant4a ami3 06/622 80 t044 IV - - - - - - Sa2 Sa3 Fb antla ami3 **NRL 07/910 80 t044 IV - - m/107 m/107 m/107 m/107 Sa2 Sa3 A, B, Fb antla amil, ami2, ami3 EP5 45 t026 IV _ ++ _ ++ ++ ++ Sa2 Sa3 Sa5 Sa6 Sa7 A, B, Fa antlb,ant4b ami3,ami2 E48 8 t024 IV - +/++m - ++ ++ ++ Sa2 Sa3 A, Fa N ami3 E43 8 t211 IA ++ - +m ++ - - Sa3, Sa6, Sa7 B, Fa N amil,ami3 E53 8 t211 IA ++ - +m ++ - - Sa3, Sa6, Sa7 B, Fa N amil,ami3 E29 1 tl27 IV ++m - - +m - - Sa2, Sa3 A, Fa N ami3 62 4.4. Indukce profágů z necitlivých kmenů a lyzogenizace kmene S. aureus 1039 Některé kmeny obsahovaly shodné profágy, které se zdály být zopdovědné za navození rezistence. Proto byly tyto profágy indukovány a následně použity k lyzogenizaci bezprofágového kmene. Pro indukci byly vybrány kmeny E14 a 08/3556 jelikož obsahují na základě profágového profilu pouze jednoho profága. Indukce byla úspěšná u obou kmenů, oba fágové lyzáty měly přibližný titr 104 . Po indukci následovala lyzogenizace bezprofágového kmene 1039. Poté byly jednotlivé kolonie pasážovány přes citrát sodný, aby se zamezilo falešným výsledkům při detekci PCR (fágy vně buňky byly eliminovány). Byla provedena PCR na profágové amidázy a testy citlivosti vůči polyvalentním fágům (tab. 25). Potvrdila se přítomnost profága v původně bezprofágovém kmeni 1039 i necitlivost původně citlivého kmene. Tabulka 25: Přehled citlivosti lyzogenizovaných kmenů 1039 společně s výsledky PCR na detekci genu pro amidázy. - rezistentní kmen Lyzogenní kmen přítomnost amidáz citlivost vůči polyvalentním fágůmLyzogenní kmen přítomnost amidáz 812 812a 812b 812i Kl Fl 1039 (* z E14)1 ami3 - - - - - - 1039 (*zE14)2 ami3 - - - - - - 1039 (*zE14)3 ami3 - - - - - - 1039 (* z 0S73556)1 ami3 - - - - - - 1039 (i z 08/3556)2 ami3 - - - - - - 1039 (i z 08/3556)3 ami3 - - - - - - 4.5. Analýza in silico Díky dostupným sekvencím některých profágů (NCBI) mohlo být provedeno celogenomové srovnání fágů, jež citlivost ovlivňují (47 a 53) s fágy, jež tuto schopnost nevykazovaly (85,77,11). Fág 47 a fág 53 jsou evolučně značně vzdálené, přesto navozují stejnou rezistenci u svých hostitelů. Oproti tomu fág 85 je blízce příbuzný fágu 53 a rezistenci nenavozuje. Postupným srovnáním pomocí programu Blast a mVista bylo identifikováno několik genů, které byly alespoň částečně totožné u fágů 53 a 47, zároveň se více či méně lišili u ostatních bakteriofágů. Jako nejvýznamnější se jevil ORF016 fága 53 (obr. 18). Kóduje 63 protein neznámé funkce. Sekvence tohoto genu se zcela shodovala u obou profágů, úplně chyběla u ostatních srovnávaných fágů. Pomocí programu Blast bylo zjištěno, že se tato sekvence vyskytuje pouze u několika kmenů a bakteriofágů, a je vysoce specifická. Byla nalezena u kmene PS47 a to na genomu profága 12. Rezistence tohoto kmene je shodná s rezistencí způsobenou fágy 47 a 53. Dále byla nalezena u bakteriofága 80alfa, jenž je zřejmě odvozený od fága 53 (Christie a kol, 2010) a u několika dalších kmenů. Protein kódovaný tímto genem obsahuje transmembránovou doménu (S.W.O.T Analysis). Několik dalších kmenů vykazovalo stejný profil citlivosti, a proto byla navržena PCR na detekci genu pro tento protein. Obrázek 18: Srovnání profágových genomů. 0\ 4.5.1. Návrh PCR na 53ORF016 Pomocí programu Oligosearch 6.44 byla navržena PCR na detekci genu pro neznámý protein (dále TP). Pomocí teplotního gradientu byly určeny ideální podmínky reakce, jež jsou uvedeny v metodách. Na obr. 19 jsou vyznačené pozice obou primerů, délka amplikonu je 291 bp. Následně byl otestován soubor kmenů s různou citlivostí na přítomnost tohoto genu. Zahrnuty byly kmeny se shodnou citlivostí jako ISP8 (53+), u kterých byl TP očekáván. Dále byly otestovány rezistentní i zcela citlivé kmeny (tab. 26). 64 Obrázek 19: Navržené primery pro 53ORF016. Žlutou barvou je vyznačen TP-F, zelenou TP-R. : 61 12. 181 241 301 361 421 4 = 1 541 601 661 721 781 a t g a a a g g t g t a t g c t g c a a a a c a a q a a a a a t g a a t t t a a a a a t a t c a c a t t c a a g a a c g g a a a t t g t t a 7* 7* . a t a t a t a c a t c g g t g g t t c a a c g a g t t t t c WvVTWVTVvWvWvWv t t t t a g a a a a g t t t t g a t a a c t t a t a a a a a W^WAWAWvVvVvVv d ^ d d t t d t d d t t d d d C d d d d WvVvVvVvVTWWVvWv t t a a a a g t a a T* . a c c g a t a a t a • " t a a a t t t a a c a a a a t t a a t t t g t t c c t t t c tca^cg^a^acj^a a q a a q a g t g t t a t a g g a g a t t g a c g t a t t c 7* . 7* . 7* a a t g a a a c c c a t a t a t a t t g c a t g a a t a a a a a c a t a a c a a v w w w w v w w w v w v ttgagt.ct.tt WWWvWWWWWWV a a t t t a a t a g g a a a a g c g t a a t a q t a a t a c a c a t t g a t a t w w w w w v w w w w v a a t t t t a c a a t a a a t a a a a a q q t t t a t c a q t c a t c t a t t t a a a a g g t a t a t c g a a a a g g a c a a g a t a a a a a^ga^acagtct t t a c g g g c t a a a a c a g t g g a c a a g g t a t a a tcattacatc t g a a t g g a a t c a g a a a c t c a vVvV-Ti/vVvV-Ti/vVvVvV-.".' a a t a a a a t a g aacaaaaaga t t t t t a a a a a t a t c t g g t g g aaaggaaaga g t t t t g a t a t t t a a t g a a t t t t a c t g a t a a t a a t t t t a g a c t t t t t c g a c a t a c a c t c a t \-\---y-y-y-y-y-y-y-y-y-y-y-y-y-y-y-y-.-\- ttt.ct.at.gca • a a a t c t a t t t VWWWWWWWWWVr g g c a t g a a a a t a a a a t t t a a g a t a t c g t a t a a a g g c t g t t äCCCCäCätä a g a g a a t a a g • -. • a g a g a t t g c a " " " g c t t c g t a c t a t t t g a c a a c dCCtCjddddd t a a g a a g t a t t t t t a c c a a t C t g d d d d d t t a a a a a c a a t a VWWWWWWWWWVr a t t t t a t g t t aaagaaaaca g a a a t a a Tabulka 26: Výsledky PCR na detekci genu pro TP spolu s citlivostí testovaných kmenů vůči polyvalentním fágům. ++ ,+ lyže, citlivý kmen; - (m) rezistentní kmen. Kmen přítomnost TP cit ivost k fágům Kmen přítomnost TP 812 812a 812b 812i Kl Fl 420 - m m m - m ++ PS85 - - - - - - E14 - m m m m m m HDE288 - - - m m ++ m FN4 - - - m - m ++ 06/1298 - - - - - m PS85 - - - - - - EP17 - - - - - - NRL 07/910 - - - - - - PS84 - - - - - - PS29 - + - ++ ++ - - 8511 - ++ ++ ++ ++ ++ ++ E26 - ++ ++ ++ ++ ++ ++ PS54 - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ISP8 (53+) + - ++ - ++ ++ ++ ISP8 (47+) + - ++ - ++ ++ ++ PS47 + m ++ m ++ ++ ++ PS83A + - ++ - ++ ++ ++ EP5 + - ++ - ++ ++ ++ E19 + - ++ m ++ ++ ++ E48 + - ++ - ++ ++ ++ CCM 5757 + - ++ - ++ ++ ++ FN32 + - ++ - ++ ++ ++ 1039 (42E+) + - ++ - ++ ++ ++ 65 5.1. DISKUZE Cílem této diplomové práce bylo zjistit a popsat vliv přítomnosti profágů na citlivost kmenů S. aureus k polyvalentním fágům a dále charakterizovat tyto profágy z hlediska jejich struktury a vlastností. K experimentu byly vybrány uměle lyzogenizované kmeny, připravené v laboratoři L M D M , kmeny mezinárodní řady a kmeny izolované z českých nemocnic. S. aureus je významným patogenem a původcem řady onemocnění (např. syndrom toxického šoku, závažné epidermolýzy či pneumonie). Díky stoupajícímu výskytu kmenů s rezistencí k antibiotikům (MRSA a VRSA kmeny) se dostává do popředí fágová terapie, jako alternativní léčba k antibiotikům. V současné době se fágové terapii věnuje řada studií. Část z nich pojednává o problematice rezistence vůči užívaným polyvalentním fágům. Bylo prozkoumáno mnoho mechanismů rezistence vůči fágům, pouze málo studií se však věnuje vlivu profágů na rezistenci, a u druhu S. aureus prozatím není znám mechanismus, který je za tuto profágem vyvolanou rezistenci zodpovědný. V této práci je popsáno několik fágů, u nichž se přímo prokázalo, že zprostředkovávají rezistenci svého hostitele. Dále byl nalezen protein, který se vyskytuje u některých z těchto fágů a který může mít přímý vliv na citlivost. Pro gen kódující tento protein byla navržena PCR a byl detekován u dalších kmenů se shodným profilem rezistence, který navozují fágy, u nichž byl tento gen identifikován. 5.1. Citlivost vybraných kmenů S. aureus k polyvalentním fágům Na základě výsledků citlivosti uměle lyogenizovaných kmenů lze konstatovat, že lyzogenie hraje značnou roli v rezistenci bakterií vůči polyvalentním fágům. Fágy 53 a 47 vyvolávají u svých hostitelů rezistenci vůči polyvalentnímu fágu 812 a jeho mutantě 812b. Tato lyzogenní konverze byla zaznamenána u všech lyzogenizovaných kmenů (ISP8, 8511, PS6 a PS54). U kmenů PS83A a PS47 je tento fenotyp shodný s fenotypem nelyzogenizovaných kmenů a tak nemohla být konverze zaznamenána. Ostatní mutanty, odvozené od fága 812, jsou schopny tyto kmeny infikovat. Tato rezistence tak bude patrně vyvolána stejným mechanismem, neseným v genomu těchto fágů. Stejný profil citlivosti se vykytuje i u kmene PS47, PS83A a dále u kmenů EP5 a E48. Následnou typizací profágového profilu těchto kmenů bylo zjištěno, že neobsahují shodné fágové moduly jako fágy 53 a 47 a patrně se tak jedná o odlišného profága se stejným mechanismem navození rezistence. 66 Mutanta 812a byla získána na kmeni S26, který je zároveň hostitelským kmenem fága 53, a z této mutanty byly dále odvozeny zbývající mutanty, jež jsou na tyto kmeny účinné (Rosypal a kol, 1986). Oproti tomu mutanta 812b byla získána inkubací na kmeni SA 66, který fága 53 ani 47 neobsahuje. U dalších testovaných fágů nebyla změna citlivosti hostitele zaznamenána. Většina PS kmenů byla vůči testovaným polyvalentním fágům citlivá, přesto se však vyskytlo několik více či méně rezistentních kmenů. Na základě citlivosti vůči fágům pak byly vybrány vhodné kmeny a následně podrobeny čtyřem PCR na fágové moduly. 5.2. Schopnost adsorpce polyvalentních fágů na buňky S. aureus Fág 812 a jeho mutanta 812a byly vybrány k testování schopnosti adsorpce na hostitelskou buňku. Zatímco wildtype 812 vykazuje poměrně nízké spektrum hostitelů, jeho mutanta 812a je schopna infikovat většinu testovaných kmenů. Z grafů 1 - 5 je patrné, že není rozdíl mezi adsorpcí obou fágů na stejném kmeni. Liší se pouze adsorpce mezi jednotlivými kmeny, nikoliv však mezi fágy, ačkoliv kmeny ISP8 (53+) a ISP8 (47+) je schopen infikovat pouze fág 812a. Pravděpodobně tak adsorpce fágů probíhá bez ohledu na citlivost kmene vůči fágu a mechanismus rezistence bude v jiném kroku lytického cyklu. Toto tvrzení však nelze považovat za obecně platné. U studie účinnosti polyvalentního fága K a jeho mutant vykazovaly některé kmeny rezistenci právě v důsledku znemožnění adsorpce fága (Kelly a kol, 2012). Tuto schopnost vykazovaly pouze 3 kmeny z testovaných 43 a pravděpodobně se tedy jedná o méně častý typ rezistence u druhu S. aureus. Mnou testované lyzogenní kmeny vykazují rezistenci díky svým profágům, mechanismus rezistence vyvolaný lyzogenií tak zřejmě nesouvisí se zabráněním adsorpce fágů. 5.3. Profágový profil u vybraných kmenů PCR na detekci profágů 4 různých serologických skupin (A, B, Fa, Fb) mělo dvojí účel. Jednak blíže specifikovat neznámé profágy v některých kmenech (a ověřit serologické skupiny u uměle lyzogenizovaných kmenů), jednak ověřit předpoklad souvislosti rezistence s profágy serologické skupiny B. Celkově byly testovány lyzogeny, PS kmeny a soubor nemocničních kmenů. 67 Lyzogenní kmeny obsahovaly serologické skupiny profágů, jimiž byly lyzogenizovány. U kmenů mezinárodní řady i nemocničních kmenů byly detekovány 1-4 profágy, což je v souladu s dřívějšími studiemi, podle kterých jsou bezprofágové kmeny u S. aureus vzácné (Goerke a kol, 2009; Pantůček a kol, 2004). Zastoupení profágů jednotlivých serologických skupin bylo značně rozmanité. Kmeny s profágy ze stejných serologických skupin mohou mít naprosto odlišnou citlivost, jako například kmeny PS54 a 09/2650. Oba kmeny mají profágy serologických skupin A, Fa a B, jeden je citlivý a druhý rezistentní ke všem mutantám kromě 812/F1. U většiny kmenů se nacházejí současně nejméně 2 profágy a nelze tedy jasně určit souvislost mezi citlivostí a serologickými skupinami profágů. Profágy všech serologických skupin včetně skupiny B byly nalezeny u řady citlivých kmenů. Necitlivé kmeny obsahovaly většinou několik fágů současně. Některé rezistentní kmeny však obsahovaly jednoho profága, a to skupiny Fa (např. kmen E14), B (kmen S26) a A (ISP8 47+). Později byl podrobněji charakterizován rezistentní kmen 06/622, který obsahuje jediného profága skupiny Fb. Na základě těchto výsledků nebyl předpoklad souvislosti serologické skupiny B s rezistencí hostitele potvrzen. U profágů skupiny A (•47) i B (*53) byla schopnost navodit rezistenci přímo prokázána lyzogenizací. Později byla tato schopnost prokázána i u fága skupiny Fa. Rezistenci svého hostitele tedy může navodit fág ze serologické skupiny A, Fa i B. Tato schopnost nebyla prozatím prokázána u fága skupiny Fb, byl však nalezen rezistentní kmen 06/622, který tohoto fága obsahuje. PCR na detekci genu pro profágové amidázy a dUTPázy potvrdila předchozí závěry o rozmanitosti profágů u druhu S. aureus. Začaly se ukazovat shodné profágové profily s citlivostí vůči polyvalentním fágům. Po doplnění výsledků PCR na gen pro fágové antirepresory se souvislost ještě zvýšila. Dále byla provedena PCR na fágové amidázy a antirepresory u některých kmenů, které byly převzaty z práce Markéty Strehové. Nemocniční kmeny 08/3556 a E14 obsahují na základě profágových profilů shodné nebo téměř shodné profágy serologické skupiny Fa, s amidázou 3, dUTPázou 4 a antirepresorem 4b. Oba tyto kmeny jsou zcela rezistentní vůči všem testovaným polyvalentním fágům, tak jako některé další kmeny a to HDE288, 06/1298, PS85 a PS95 , u kterých se tento profágový profil objevbuje v kombinaci s dalšími moduly a nelze u nich s jistotou říct, zda se jedná o totožného fága. Při srovnání s již charakterizovanými fágy čeledi Sipohoviridae nebyl nalezen shodný fágový profil (Kahánková a kol, 2010). Patrně se tedy jedná o nového fága. Později byla provedena indukce tohoto fága z kmene E14 a 08/3556. 68 Další shodný profil byl nalezen u nemocničních kmenů 420 a 09/2650. Oba jsou citlivé pouze k mutantě F l . Ta byla připravena na kmeni FN4, který má stejný profágový profil kromě dUTPázy. Je pravděpodobné, že se jedná o stejný mechanismus rezistence, který může být vyvolán fágem. Jelikož však jde o nemocniční kmeny, může jít o vzájemnou příbuznost, nikoliv o vliv profága. Předpoklad, že tento fág ovlivňuje citlivost svých hostitelů, by bylo potřeba potvrdit jeho indukcí a lyzogenizací bezprofágového kmene. Při srovnání s charakterizovanými fágy nebyla opět nalezena shoda. Čeleď Siphoviridae je tedy velmi rozsáhlá a zřejmě zahrnuje mnoho fágů, které si jsou blízce příbuzné a liší se pouze v několika genech. Dále bych zmínila kmen PS29 a nemocniční kmeny E43 a E53. Tyto kmeny jsou necitlivé vůči mutantám 812a, 812b, 812F a 812K a citlivé k 812 a mutantě 812L Tento jev je zajímavý, neboť u většiny kmenů vykazuje nejnižší lytickou účinnost právě 812. Všechny tyto kmeny obsahují profágy shodných serologických skupin (Fa a B) a amidáz (1 a 3). Kmen PS29 pak obsahuje nejméně 2 další profágy. U kmene EP5, PS83A a E19 se na základě jejich profilů předpokládá přítomnost fága 47. Tento fág specificky ovlivňuje citlivost svého hostitele, tak jako fág 53. Kmeny PS84 a nemocniční kmen EP17 jsou necitlivé vůči všem testovaným polyvalentním fágům a shodují se v serologické skupině Fa, amidáze 3 a antirepresoru 4a. Při srovnání s již charakterizovanými fágy jde opět o nový profil. Bylo by tedy potřeba indukcí a lyzogenizací ověřit, zda tento fág doopravdy navozuje takto rozsáhlou rezistenci. Celkově bylo zaznamenáno několik profágových profilů korelujících s profily citlivosti. Profágy tedy hrají významnou roli v navození rezistence u kmenů S. aureus. Ze serologických skupin se nejméně vyskytovala skupina Fb, u amidázy převažoval typ 3, z dUTPáz téměř chyběl typ 4 a u antirepresoru převažoval typ 4b. 5.4. Indukce neznámých profágů a následná lyzogenizace citlivého kmene Na základě dosavadních výsledků byly pro indukci vybrány kmeny E14 a 08/3556. Ty obsahují ve svém genomu pouze jednoho profága, který je zodpovědný za navození rezistence. Tato domněnka byla potvrzena následnou lyzogenizací citlivého kmene. Z obou kmenů byly úspěšně indukovány lyzáty, které byly následně použity k lyzogenizací bezprofágového kmene 1039. Po úspěšné lyzogenizací byla přítomnost fágů potvrzena u obou 69 dvou kmenů pomocí PCR na detekci genu pro amidázu. Pomocí rezistence vůči původnímu fágu byly na analýzu vybrány 3 kolonie s fágem izolovaným z kmene E14 a 3 kolonie s fágem izolovaným z kmene 08/3556. U všech těchto kolonií byla provedena PCR a testy citlivosti k polyvalentním fágům (812, 812a, 812b, 812i, 812/K1 a 812/F1). Všechny lyzogeny obsahovaly gen pro amidázu 3 a byly rezistentní ke všem testovaným fágům. Byla tedy prokázána lyzogenní konverze a schopnost indukovaných profágů vyvolat kompletní rezistenci svého hostitele. 5.5. Analýza genu pro neznámý protein Kmeny, které obsahovaly fágy 53 a 47 a dále kmeny PS47, PS83A ,E19 , EP5 a E48 vykazovaly shodnou rezistenci vůči fágu 812 a jeho mutantě 812b a citlivost vůči ostatním fágům. Na základě srovnání genomů fágů 47,53,85,77 a 11, jejichž celogenomová sekvence je přístupná na NCBI, byl vytipován gen pro protein neznámé funkce. Tento gen byl nalezen v genomech fágů 53, 47 a 80a, dále v kmeni PS47 a u několika dalších kmenů. Část sekvence byla nalezena u fága 12, který byl izolován z kmene PS47. Dodatečně se ukázalo, že tento fág obsahuje celou sekvenci tohoto genu, šlo pouze o chybné uložení sekvence v NCBI. Pomocí programu Oligosearch 6.44 byly navrženy vhodné primery, poté byla optimalizována PCR s pomocí pozitivních kontrol PS47, (ISP8 53+) a fága 53. Následně byl otestován široký soubor kmenů s různou citlivostí vůči polyvalentním fágům. Gen pro tento protein byl detekován pouze v kmenech, které vykazovaly stejnou citlivost jako kmeny s fágy 47 a 53. V ostatních kmenech nebyl tento gen zachycen. Bioinformatickou analýzou byla v tomto proteinu identifikována transmembránová doména (S.W.O.T Analysis). Díky testování schopnosti adsorpce polyvalentních fágů na kmeni ISP8 (53+) lze předpokládat, že TP neovlivňuje adsorpci fágů. Patrně se tedy TP nachází v membránovém prostoru a zabraňuje vstupu DNA do buňky. Tím zapříčiňuje rezistenci vůči infekci fágem. Pro ověření těchto tvrzení by bylo vhodné provést řadu dalších experimentů a to například nakloňování genu pro TP do vhodného vektoru, transformace citlivých buněk a sledování případných změn citlivosti. 70 6. ZÁVĚR V současné době roste počet kmenů S. aureus, jež jsou rezistentní k antibiotikům a léčba stafylokokových infekcí se tak stává velkým problémem v nemocnicích po celém světě. Jako alternativní léčba se dostala do popředí fágová terapie. I ta se však potýká s několika problémy a jedním z nich je i rezistence kmenů k užívaným polyvalentním fágům. V této diplomové práci byla provedena rozsáhlá analýza lyzogenních kmenů a popsán vliv lyzogenie na citlivost vůči polyvalentním fágům. Na základě testů citlivosti lyzogenních kmenů byl ověřen vliv některých profágů na rezistenci hostitele vůči polyvalentním fágům. Dále byly analyzovány profágy pomocí charakterizace jednotlivých fágových modulů a to morfogenetického modulu, lytického modulu, modulu regulace transkripce a oblasti kontroly lyzogenního stavu. Byla nalezena shoda mezi profágovými profily testovaných kmenů a citlivostí těchto kmenů k fágu 812 a jeho mutantám 812a, 812b, 812i, 812/K1 a 812/F1. Byla provedena indukce profágů u rezistentních kmenů k polyvalentním fágům a následná lyzogenizace citlivého bezprofágového kmene SA1039. Na základě ověření lyzogenní konverze byla potvrzena schopnost těchto fágů vyvolávat rezistenci k polyvalentním fágům u svého hostitele. Pomocí bioinformatické analýzy byl identifikován protein, který se vyskytuje u některých fágů, jež způsobují rezistenci svých hostitelů vůči některým polyvalentním fágům. Byla navržena PCR na detekci genu, který kóduje tento protein a následně byl tento gen detekován u několika dalších kmenů se shodnou citlivostí. Na základě těchto výsledků je možné, že právě tento protein zodpovídá za navození rezistence u těchto kmenů. Tento předpoklad je však potřeba ověřit dalšími analýzami. Celkově byl ověřen a prokázán vliv lyzogenie na citlivost kmenů S. aureus k polyvalentním fágům. Výsledky této práce jasně ukazují, že tento vliv může být daleko rozsáhlejší, než se doposud myslelo. 71 7. SEZNAM LITERATURY Ackermann H.W. (2003). Bacteriophage observations and evolution. Res. Microbiol. 154: 245-251. Bair CL, Rifat D, Black LW. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI*. J Mol Biol. 2007;366:779- 789. Barondess, J.J., Beckwith, J., 1995. bor gene of phage lambda, involved in serum resistance, encodes a widely conserved outer membrane lipoprotein. J. Bacteriol. 177, 1247-1253. Capparelli R, Nocerino N, Lanzetta R, Silipo A, Amoresano A, Giangrande C, Becker K, Blaiotta G, Evidente A, Cimmino A, Iannaccone M, Parlato M, Medaglia C, Roperto S, Roperto F, Ramunno L, Iannelli D. Bacteriophage-resistant Staphylococcus aureus mutant confers broad immunity against staphylococcal infection in mice. PLoS One. 2010 Jul 22;5(7):ell720. DeLeo FR, Chambers HF. Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era. Nat Rev Microbiol. 2009;7:629-641. Enright MC, Robinson DA, Rändle G, Feil EJ, Grundmann H & Spratt B G (2002) The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sei USA 99: 7687-7692. Feng, Y., Chen, C.-J., Su, L.-H., Hu, S., Yu, J. and Chiu, C.-H. (2008), Evolution and pathogenesis of Staphylococcus aureus: lessons learned from genotyping and comparative genomics. FEMS Microbiology Reviews, 32: 23-37. Goerke C, Pantucek R, Holtfreter S, Schulte B, Zink M, Grumann D, Broker BM, Doskar J, Wolz C. 2009. Diversity of Prophages in Dominant Staphylococcus aureus Clonal Lineages. J Bacteriol 191: 3462-3468. 72 Hiramatsu K, Cui L, Kuroda M & Ito T (2001) The emergence and evolution of methicillinresistant Staphylococcus aureus. Trends Microbiol 9: 486-493. Holden M.T.G., Lindsay J. A. (2008) Whole Genomes: Sequence, Microarray and Systems Biology. In: Lindsay J. A. (ed.), Staphylococcus Molecular Genetics, 1-28, Caister Academic Press, Norfolk, UK. Holden MT, Feil EJ, Lindsay JA, Peacock SJ, Day NP, Enright MC, Foster TJ, Moore CE, Hurst L, Atkin R, et al:. Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance. Proc Natl Acad Sei USA 2004, 101:9786-9791. Hu DL, Omoe H, Sasaki S, Sashinami H, Sakuraba H, et al. Vaccination with non-toxic mutant toxic shock syndrome toxin I protects against Staphylococcus aureus infection. J Infect Dis. 2003;188:743-752. Chang S, Sievert DM, Hageman JC et al. (2003) Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene. N Engl J Med 348: 1342-1347. Chen J.,Novick R. Phage-mediated intergeneric transfer of toxin genes. Science, 323 (2009), pp. 139-141. Christie G.E., A.M. Matthews, D.G. King, K D . Lane, N.P. Olivarez, S.M. Tallent, S.R. Gill, R.P. Novick. The complete genomes of Staphylococcus aureus bacteriophages 80 and 80aimplications for the specificity of SaPI mobilization. Virology. 2010; 407(2): 381-390. Iandolo JJ, Worrell V, Groicher KH, Qian Y, Tian R, Kenton S, Dorman A, Ji H, Lin S, Loh P, Qi S, Zhu H, Roe BA. Comparative analysis of the genomes of the temperate bacteriophages phi 11, phi 12 and phi 13 of Staphylococcus aureus 8325. Gene. 2002 May 1;289(1-2):109-18. Iyer L M , Koonin EV, Aravind L. Extensive domain shuffling in transcription regulators of DNA viruses and implications for the origin of fungal APSES transcription factors. Genome Biol. 2002;3(3): RESEARCH0012. 73 Kahankova J, Pantucek R, Goerke C, Ruzickova V, Holochova P, Doskar J. 2010. Multilocus PCR typing strategy for differentiation of Staphylococcus aureus siphoviruses reflecting their modular genome structure. Environ Microbiol 12: 2527-2538. Kedzierska, S., Wawrzynow, A., Taylor, A., 1996. The Rzl gene product of bacteriophage lambda is a lipoprotein localized in the outer membrane of Escherichia coli. Gene 168, 1-8. Kelly D, McAuliffe O, Ross RP, Coffey A. Prevention of Staphylococcus aureus biofilm formation and reduction in established biofilm density using a combination of phage K and modified derivatives. Lett Appl Microbiol. 2012 Apr;54(4):286-91. Kriiger DH, Barcak GJ, Smith HO. Abolition of DNA recognition site resistence to the restriction endonuclease EcoRII. Biomed Biochim Acta. 1988;47(l):Kl-5. Kwan T, Liu J, DuBow M, Gros P, Pelletier J. The complete genomes and proteomes of 27 Staphylococcus aureus bacteriophages. Proc Natl Acad Sci U S A . 2005 Apr 5; 102(14): 5174- 9. Kwiatek M, Parasion S, Mizak L, Gryko R, Bartoszcze M, Kocik J. Characterization of a bacteriophage, isolated from a cow with mastitis, that is lytic against Staphylococcus aureus strains. Arch Virol. 2012 Feb;157(2):225-34. Lindsay J. A., Ruzin A., Ross H.F., Kurepina N., Novick R.P. The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol, 29 (1998), pp. 527-543. Lindsay JA, Ruzin A, Ross FLF, Kurepina N & Novick RP (1998) The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 29: 527-543. Mahony J, McGrath S, Fitzgerald GF, van Sinderen D. Identification and characterization of lactococcal-prophage-carried superinfection exclusion genes. Appl Environ Microbiol. 2008 Oct;74(20):6206-15. 74 Maiques E., Ubeda C , Tormo M. A., Ferrer M.D., Lasa L, Novick R.P. et al. Role of staphylococcal phage and SaPI integrase in intra- and interspecies SaPI transfer. J. Bacteriol, 189 (2007), pp. 5608-5616. Mark R Tock, David TF Dryden, The biology of restriction and anti-restriction, Current Opinion in Microbiology, Volume 8, Issue 4, August 2005, Pages 466-472. Markéta Střehová, Vliv restrikčně-modifikačních systémů na rezistenci kmenů Staphylococcus aureus k polyvalentním bakteriofágům. 2013. McGrath, S., G. F. Fitzgerald, and D. van Sinderen. 2002. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. Mol. Microbiol.43:509- 520. Mehndiratta P L, Gur Renu, Saini Sanjeev, Bhalla P; Staphylococcus aureus phage types and their correlation to antibiotic resistance 2010 Volume: 53 Issue Number:4 Page: 738-741. Middelboc M, Hamstrong A, Blackburn N, Sinn R, Fischer U, et al. Effect of bacteriophage on the population dynamics of four strains of pelagic marine bacteria. Microb Ecol. 2001;42:395-406. Neve, H., Zenz, K.I., Desiere, F., Koch, A., Heller, K.J., Brüssow, H., 1998. Comparison of the lysogeny modules from the temperate Streptococcus thermophilus bacteriophages TP-J34 and Sfi21: implication for the modularntheory of phage evolution. Virology 241, 61-72. Nilsson IM, Patti JM, Bremeil T, Hook TM, Tarkowski A. Vaccination with a recombinant fragment of collagen adhesion provides protection against Staphylococcus awrews-mediated septic death. J Clin Invest. 1998;101:2640-2649. Novick R. Properties of a cryptic high-frequency transducing phage in Staphylococcus aureus. Virology, 33 (1967), pp. 155-166. 75 O'Flaherty S, Coffey A, Edwards R, Meaney W, Fitzgerald GF, Ross RP. Genome of staphylococcal phage K: a new lineage of Myoviridae infecting gram-positive bacteria with a low G+C content. J Bacteriol. 2004 May;186(9):2862-71. Pantucek R, Doskar J, Růžičkova V, Kašpárek P, Oráčova E, Kvardova V, Rosypal S. 2004. Identification of bacteriophage types and their carriage in Staphylococcus aureus. Archives of Virology 149: 1689-1703. Pantůček Roman, Alena Rosypalová, Jiří Doškář, Jana Kailerová, Vladislava Růžičková, Pavla Borecká, Šárka Snopková, Radek Horváth, Friedrich Götz, Stanislav Rosypal, The Polyvalent Staphylococcal Phage cp812:Its Host-Range Mutants and Related Phages, Virology, Volume 246, Issue 2, 5 July 1998, Pages 241-252. Rosypal, S., and Horáková, D. 1968. The loss of sensitivity of Staphylococcus aureus NCTC 8511 to the polyvalent and virulent phage 812 following lysogenization with the phage 53. Publ. Fac. Sei. Univ. J. E. Purkyně 496: 313-326. Rosypal S., Rosypalová A., Doškář J., Pakrová E., Genovová, S. (1986). The use of the polyvalent phage 812 and its hostrange mutants to the differentiation of Staphylococcus aureus from other staphylococci. Scripta Fac. Sei. Natl. Univ. Purk. Brun. 16: 317-336. Rountree P. M. (1949) The serological differentiation of staphylococcal bacteriophages. J. Gen. Microbiol. 3: 164-173. Ruzin A, Lindsay J & Novick RP (2001) Molecular genetics of SaPIl - a mobile pathogenicity island in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 41: 365-377. Scott AE, Timms AR, Connerton PL, Carrillo CL, Radzum KA, et al. Genome dynamics of Campylobacterjejuni in response to bacteriophage predation. PLOS Pathogens. 2007;3:1142- 1151. Tallent S.M., Langston T.B., Moran R.G., Christie G.E. Transducing particles of Staphylococcus aureus pathogenicity island SaPIl are comprised of helper phage-encoded proteins. J. Bacteriol, 189 (2007), pp. 7520-7524. 76 Tormo M.Á., Ferrer M.D., Maiques E., Ubeda C , Selva L., Lasa Í. et al. Staphylococcus aureus pathogenicity island DNA is packaged in particles composed of phage proteins. J. Bacteriol, 190 (2008), pp. 2434-2440. Ubeda C , Maiques E., Barry P., Matthews A., Tormo M. A., Lasa I. et al. SaPI mutations affecting replication and transfer and enabling autonomous replication in the absence of helper phage Mol. Microbiol, 67 (2008), pp. 493-503. von Heijne, G., 1989. The structure of signal peptides from bacterial lipoproteins. Protein Eng. 2, 531-534. Yamaguchi, T., Hayashi, T., Takami, H., Nakasone, K., Ohnishi, M., Nakayama, K., Yamada, S., Komatsuzawa, H. and Sugai, M . 2000. Phage conversion of exfoliative toxin A production in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 38: 694-705. Young R. 1992. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation. Microbiol Rev 56: 430-481. Internetové zdroje vvww.ncbi.nlm.nih.gov/ - NCBI - National Center for Biotechnology Information http://rebase.neb.com - REBASE - The Restriction Enzyme Database 77