Cytochrome P450 2C9 based microreactor combined with capillary electrophoresis for on-line kinetic and inhibition studies

SCHEJBAL, Jan, Roman ŘEMÍNEK, Lukáš ZEMAN, Aleš MÁDR a Zdeněk GLATZ. Cytochrome P450 2C9 based microreactor combined with capillary electrophoresis for on-line kinetic and inhibition studies. In the 22nd International Symposium on Electro- and Liquid Phase-Separation Techniques (ITP2015). 2015.

Základní údaje

• Originální název: Cytochrome P450 2C9 based microreactor combined with capillary electrophoresis for on-line kinetic and inhibition studies
• Název česky: Mikroreaktor založený na cytochromu P450 2C9 kombinovaný s kapilární elektroforézou pro on-line kinetické a inhibiční studie
• Autoři: SCHEJBAL, Jan, Roman ŘEMÍNEK, Lukáš ZEMAN, Aleš MÁDR a Zdeněk GLATZ.
• Vydání: the 22nd International Symposium on Electro- and Liquid Phase-Separation Techniques (ITP2015), 2015.

Další údaje

• Typ výsledku: Konferenční abstrakt
• Utajení: není předmětem státního či obchodního tajemství
• Příznaky: Mezinárodní význam

Anotace

In pre-clinical stage of new drug development pharmacokinetic and pharmacodynamic studies play a crucial role. Essential part of these studies is determination of kinetic parameters and inhibition potential of the drug candidate towards cytochromes P450 (CYP), as these liver enzymes are responsible for majority of biotransformation processes leading to deactivation and excretion almost all of xenobiotics, including drugs. For those studies high throughput and cost-effectiveness are the ultimate objectives driving the search for novel methods and techniques. In this work we present immobilized enzymatic microreactor (IMER) coupled with capillary electrophoresis (CE) in on-line configuration, which enables rapid analysis with miniscule sample consumption and reuse of targeted enzyme. In our study the CYP 2C9 isoform was immobilized on magnetic microparticles coated with carboxyl groups using standard coupling agents 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide and N-hydroxysulfosuccinimide and introduced into capillary, where the particles formed an IMER in magnetic field created by two Nd magnets. The capillary thus served both as the reaction chamber and separation medium resulting in short incubation and analysis time about 20 minutes in total, while consuming only tens of nl of sample and repeated use of enzyme for 6 effective measurements. For the kinetic and inhibition study the Food and Drug Administration recommended substrate diclofenac and inhibitor sulfaphenazole were used, the biotransformation product 4’-hydroxydiclofenac was quantified using UV-VIS detection. The optimized CE system provided sufficient sensitivity and repeatability to obtain kinetic and inhibition parameters which were in good correlation to literature. Unfortunately being this a novel approach many hurdles were encountered: i) first the enzyme deactivation was observed and characterised leading to employment of reference measurement to ensure repeatability and ii) second the determination of effective concentration of reactants inside the reactor proved exacting, therefore an adjusted model based on Hagen-Poiseuille law was proposed.

Anotace česky

V preklinické fázi vývoje léčiv hrají farmakokinetické a farmakodynamické studie klíčovou roli. Nedílnou součástí těchto studií je určení kinetických parametrů a inhibičního potenciálu kandidátního léčiva vzhledem k cytochromům P450 (CYP), jelikož tyto jaterní enzymy jsou zodpovědné za většinu biotransformačních procesů vedoucích k deaktivace a vyloučení všech xenobiotik, včetně léčiv. Pro tyto studie jsou zásadními parametry vzorkovací kapacita a hospodárnost, které následně pohání výzkum v oblasti nových metod a technik. V této práci představujeme mikroreaktor s imobilizovaným enzymem (IMER) spojený s kapilární elektroforézou (CE) v on-line konfiguraci, která umožňuje rychlou analýzu s minimální spotřebou vzorku a opakované využití enzymu. V naší studii byl CYP 2C9 imobilizován na magnetické mikročástice nesoucí karboxylové skupiny pomocí standardních vazných činidel 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidu a N-hydroxysulfosuccinimidu. Částice s imobilizovaným enzymem byly nadávkovány do kapiláry, kde vytvořili IMER v magnetickém poli vytvořeném dvěma neodymovými magnety. Kapilára tak sloužila jako reakční prostor a současně jako separační matrice, což umožnilo provést inkubaci a analýzu v rámci 20 minut, snížení spotřeby vzorku na desítky nanolitrů a šestinásobné efektivní použití enzymu. Pro kinetickou a inhibiční studii byl použit diklofenac jako substrát a sulfafenazol jako inhibitor, oba patři mezi látky doporučené pro tyto účely americkým úřadem pro kontrolu léčiv a potravin (FDA). Biotransformační produkt 4'-hydroxydiklofenak byl kvantifikován pomocí UV-Vis detekce. Optimalizovaný CE system poskytoval dostatečnou senzitivitu a opakovatelnost pro získání kinetických a inhibičních parametrů, které byly ve shodě s publikovanými daty. Bohužel se tato zcela nová metoda potýká s řadou problémů: i) za prvé byla pozorována deaktivace enzymu která byla charakterizována a kompenzována referenčními analýzami a ii) za druhé určení efektivních koncentrací reaktantů v IMERu se ukázalo problematické s využitím klasického modelu založeném na Hagen-Poisseuilleově zákoně a proto byl navržen upravený model.