Development of Fluorescent Assay for Monitoring of Dehalogenase
Activity

J 2019

Development of Fluorescent Assay for Monitoring of Dehalogenase Activity

NEVOLOVÁ, Šárka, Elisabet MAŇÁSKOVÁ, Stanislav MAZURENKO, Jiří DAMBORSKÝ, Zbyněk PROKOP et. al.

Základní údaje

Originální název

Development of Fluorescent Assay for Monitoring of Dehalogenase Activity

Autoři

NEVOLOVÁ, Šárka (203 Česká republika, domácí), Elisabet MAŇÁSKOVÁ (203 Česká republika, domácí), Stanislav MAZURENKO (643 Rusko, domácí), Jiří DAMBORSKÝ (203 Česká republika, garant, domácí) a Zbyněk PROKOP (203 Česká republika, domácí)

Vydání

Biotechnology Journal, WEINHEIM, WILEY-V C H VERLAG GMBH, 2019, 1860-6768

Další údaje

Jazyk

angličtina

Typ výsledku

Článek v odborném periodiku

Obor

10608 Biochemistry and molecular biology

Stát vydavatele

Německo

Utajení

není předmětem státního či obchodního tajemství

Odkazy

URL

Impakt faktor

Impact factor: 3.912

Kód RIV

RIV/00216224:14310/19:00108192

Organizační jednotka

Přírodovědecká fakulta

DOI

http://dx.doi.org/10.1002/biot.201800144

UT WoS

000460177400009

Klíčová slova anglicky

activity screening; enzyme assay; fluorescence; haloalkane dehalogenase; sulfur mustard

Štítky

rivok

Příznaky

Mezinárodní význam, Recenzováno

Změněno: 15. 2. 2023 22:46, Mgr. Michaela Hylsová, Ph.D.

Anotace

V originále

The rapid accumulation of sequence data and powerful protein engineering techniques providing large mutant libraries have greatly heightened interest in efficient methods for biochemical characterization of proteins. Herein is reported a continuous assay for screening of enzymatic activity. The assay is developed and tested with the model enzymes haloalkane dehalogenases and relies upon a fluorescent change of a derivative of 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid due to the pH drop associated with the dehalogenation reactions. The assay is performed in a microplate format using a purified enzyme, cell-free extract or intact cells, making the analysis quick and simple. The method exhibits high sensitivity with a limit of detection of 0.06 mM. The assay is successfully validated with gas chromatography and then applied for screening of 12 haloalkane dehalogenases with the environmental pollutant bis(2-chloroethyl) ether and chemical warfare agent sulfur mustard. Six enzymes exhibited detectable activity with both substrates. The within-day variability of the assay for five replicates (n = 5) was 21%.

Návaznosti

GA16-07965S, projekt VaV

Název: Řízená evoluce dynamických elementů v enzymech s využitím mikrofluidních čipů

Investor: Grantová agentura ČR, Řízená evoluce dynamických elementů v enzymech s využitím mikrofluidních čipů

LM2015051, projekt VaV

Název: Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí (Akronym: RECETOX RI)

Investor: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, Výzkumná infrastruktura RECETOX

LM2015055, projekt VaV

Název: Centrum pro systémovou biologii (Akronym: C4SYS)

Investor: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, The national infrastructure C4SYS - Centre for Systems Biology

LO1214, projekt VaV

Název: Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí (Akronym: RECETOX)

Investor: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí

Citovat

NEVOLOVÁ, Šárka, Elisabet MAŇÁSKOVÁ, Stanislav MAZURENKO, Jiří DAMBORSKÝ a Zbyněk PROKOP. Development of Fluorescent Assay for Monitoring of Dehalogenase Activity. Biotechnology Journal. WEINHEIM: WILEY-V C H VERLAG GMBH, 2019, roč. 14, č. 3, s. 1-6. ISSN 1860-6768. Dostupné z: https://dx.doi.org/10.1002/biot.201800144.

@article{1638600,
   author = {Nevolová, Šárka and Maňásková, Elisabet and Mazurenko, Stanislav and Damborský, Jiří and Prokop, Zbyněk},
   article_location = {WEINHEIM},
   article_number = {3},
   doi = {http://dx.doi.org/10.1002/biot.201800144},
   keywords = {activity screening; enzyme assay; fluorescence; haloalkane dehalogenase; sulfur mustard},
   language = {eng},
   issn = {1860-6768},
   journal = {Biotechnology Journal},
   title = {Development of Fluorescent Assay for Monitoring of Dehalogenase Activity},
   url = {https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/biot.201800144},
   volume = {14},
   year = {2019}
}

TY  - JOUR
ID  - 1638600
AU  - Nevolová, Šárka - Maňásková, Elisabet - Mazurenko, Stanislav - Damborský, Jiří - Prokop, Zbyněk
PY  - 2019
TI  - Development of Fluorescent Assay for Monitoring of Dehalogenase Activity
JF  - Biotechnology Journal
VL  - 14
IS  - 3
SP  - 1-6
EP  - 1-6
PB  - WILEY-V C H VERLAG GMBH
SN  - 18606768
KW  - activity screening
KW  - enzyme assay
KW  - fluorescence
KW  - haloalkane dehalogenase
KW  - sulfur mustard
UR  - https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/biot.201800144
L2  - https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/biot.201800144
N2  - The rapid accumulation of sequence data and powerful protein engineering techniques providing large mutant libraries have greatly heightened interest in efficient methods for biochemical characterization of proteins. Herein is reported a continuous assay for screening of enzymatic activity. The assay is developed and tested with the model enzymes haloalkane dehalogenases and relies upon a fluorescent change of a derivative of 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid due to the pH drop associated with the dehalogenation reactions. The assay is performed in a microplate format using a purified enzyme, cell-free extract or intact cells, making the analysis quick and simple. The method exhibits high sensitivity with a limit of detection of 0.06 mM. The assay is successfully validated with gas chromatography and then applied for screening of 12 haloalkane dehalogenases with the environmental pollutant bis(2-chloroethyl) ether and chemical warfare agent sulfur mustard. Six enzymes exhibited detectable activity with both substrates. The within-day variability of the assay for five replicates (n = 5) was 21%.
ER  -

NEVOLOVÁ, Šárka, Elisabet MAŇÁSKOVÁ, Stanislav MAZURENKO, Jiří DAMBORSKÝ a Zbyněk PROKOP. Development of Fluorescent Assay for Monitoring of Dehalogenase Activity. \textit{Biotechnology Journal}. WEINHEIM: WILEY-V C H VERLAG GMBH, 2019, roč.~14, č.~3, s.~1-6. ISSN~1860-6768. Dostupné z: https://dx.doi.org/10.1002/biot.201800144.

Podrobný výpis o publikaci