2021
Designované a syntetizované geny kódující nově zkonstruované proteinové katalyzátory (luciferázy) s ověřenými vlastnostmi
MAREK, Martin, Jiří DAMBORSKÝ, David BEDNÁŘ, Daniel PLUSKAL, Marika MAJEROVÁ et. al.Základní údaje
Originální název
Designované a syntetizované geny kódující nově zkonstruované proteinové katalyzátory (luciferázy) s ověřenými vlastnostmi
Název anglicky
Designed and synthesized genes coding for new luciferase enzymes with confirmed properties
Autoři
MAREK, Martin (203 Česká republika, garant, domácí), Jiří DAMBORSKÝ (203 Česká republika, domácí), David BEDNÁŘ (203 Česká republika, domácí), Daniel PLUSKAL (203 Česká republika, domácí), Marika MAJEROVÁ (703 Slovensko, domácí) a Joan PLANAS IGLESIAS (724 Španělsko, domácí)
Vydání
2021
Další údaje
Jazyk
čeština
Typ výsledku
Technicky realizované výsledky (prototyp, funkční vzorek)
Obor
10608 Biochemistry and molecular biology
Stát vydavatele
Česká republika
Utajení
není předmětem státního či obchodního tajemství
Kód RIV
RIV/00216224:14310/21:00120030
Organizační jednotka
Přírodovědecká fakulta
Klíčová slova anglicky
Bioluminescence; luciferase; optical assay; enzyme; catalysis
Technické parametry
vylepšené proteiny
Změněno: 7. 4. 2022 10:44, Ing. RNDr. Martin Marek, Ph.D., MBA
V originále
V rámci dosavadního průběhu projektu se podařilo výpočetně navrhnout novou sadu syntetických koelenterazin-závislých luciferáz, označených jako AncFT9 až AncFT16. Za tímto účelem byl použit nově vytvořený algoritmus, který je postupně implementován do nového softwarového nástroje LoopGrafter, a který je momentálně vyvíjen a testován v Loschmidtových laboratořích. Výpočetní návrh byl proveden na proteinovém templátu termostabilního domnělého předka luciferázy RLuc z Renily fialové (Renilla reniformis). Tento domnělý předek byl navržen v naší laboratoři (Chaloupkova et al., 2019). Výpočetním algoritmem implementovaným v programu LoopGrafter jsme nyní do tohoto předka transplantovali různé kombinace proteinových smyček lemujících aktivní místo enzymu, které jsme v našich předešlých experimentech objevili jako klíčové pro zesílení luciferázové funkce v tomto proteinovém foldu (Schenkmayerova et al., 2021). Tímto postupem vznikla nová sada syntetických luciferáz (AncFT9 až AncFT16). Geny kódující navržené luciferázy byly výpočetně optimalizovány pro rekombinantní produkci v Escherichia coli, a následně byla provedena jejich syntéza a klonování do expresního plasmidu pET21b. Na 3´-konec genů byla vložena sekvence kódující hexahistidinovou kotvu pro usnadnění afinitní purifikace rekombinantních enzymů. Geny byly vloženy pod kontrolu indukovatelného promotoru T7. Expresní testy v malém měřítku ukázaly, že všechny nově zkonstruované syntetické luciferázy se produkují jako solubilní proteiny v E. coli. Z expresních testů je evidentní (Obrázek 1), že rozpustnost nově designovaných luciferáz je výrazně vyšší než rozpustnost stabilizované luciferázy z Renily fialové (RLuc8). Vysoká expresibilita a rozpustnost rekombinantních luciferáz jsou klíčové parametry pro jejich aplikační využití jako reportérové bioluminiscenční enzymy. Tři nově zkonstruované luciferázy (AncFT9, AncFT15 a AncFT16) byly vybrány pro detailní biochemickou charakterizaci. Rekombinantní produkce těchto luciferáz ve velkém měřítku ukázala, že je možné získat až desítky miligramů těchto luciferáz z 1 L buněčné kultury E. coli (Obrázek 2). Teplotní stability produkovaných luciferáz byly měřeny pomocí diferenciální skenovací fluorimetrie a jsou uvedeny v grafické příloze (Obrázek 3). Měření koelenterazin-závislé luciferázové aktivity prokázala, že nově zkonstruované luciferázy jsou plně funkční, generují modré světlo, a jejich enzymatická aktivita je prokazatelně vyšší než aktivita předešle zkonstruovaného prototypu AncFT (Tabulka 1).
Anglicky
Three new coelenterazine-powered luciferase variants were computationally designed. The corresponding genes were synthesized and recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. The proteins were purified to high homogeneity. All newly designed proteins showed high expressibility and solubility. Luciferase activities were then determined, revealing that the new enzymes are better in catalysis and light emission than those previously published.
Návaznosti
| TP01010039, projekt VaV |
|