Další formáty:
BibTeX
LaTeX
RIS
@techreport{1845522,
author = {Marek, Martin and Damborský, Jiří and Bednář, David and Pluskal, Daniel and Majerová, Marika and Planas Iglesias, Joan},
keywords = {Bioluminescence; luciferase; optical assay; enzyme; catalysis},
language = {cze},
institution = {Masarykova univerzita},
organization = {Masarykova univerzita},
title = {Designované a syntetizované geny kódující nově zkonstruované proteinové katalyzátory (luciferázy) s ověřenými vlastnostmi},
year = {2021}
}
TY -
ID - 1845522
AU - Marek, Martin - Damborský, Jiří - Bednář, David - Pluskal, Daniel - Majerová, Marika - Planas Iglesias, Joan
PY - 2021
TI - Designované a syntetizované geny kódující nově zkonstruované proteinové katalyzátory (luciferázy) s ověřenými vlastnostmi
KW - Bioluminescence
KW - luciferase
KW - optical assay
KW - enzyme
KW - catalysis
N2 - V rámci dosavadního průběhu projektu se podařilo výpočetně navrhnout novou sadu syntetických koelenterazin-závislých luciferáz, označených jako AncFT9 až AncFT16. Za tímto účelem byl použit nově vytvořený algoritmus, který je postupně implementován do nového softwarového nástroje LoopGrafter, a který je momentálně vyvíjen a testován v Loschmidtových laboratořích. Výpočetní návrh byl proveden na proteinovém templátu termostabilního domnělého předka luciferázy RLuc z Renily fialové (Renilla reniformis). Tento domnělý předek byl navržen v naší laboratoři (Chaloupkova et al., 2019). Výpočetním algoritmem implementovaným v programu LoopGrafter jsme nyní do tohoto předka transplantovali různé kombinace proteinových smyček lemujících aktivní místo enzymu, které jsme v našich předešlých experimentech objevili jako klíčové pro zesílení luciferázové funkce v tomto proteinovém foldu (Schenkmayerova et al., 2021). Tímto postupem vznikla nová sada syntetických luciferáz (AncFT9 až AncFT16). Geny kódující navržené luciferázy byly výpočetně optimalizovány pro rekombinantní produkci v Escherichia coli, a následně byla provedena jejich syntéza a klonování do expresního plasmidu pET21b. Na 3´-konec genů byla vložena sekvence kódující hexahistidinovou kotvu pro usnadnění afinitní purifikace rekombinantních enzymů. Geny byly vloženy pod kontrolu indukovatelného promotoru T7. Expresní testy v malém měřítku ukázaly, že všechny nově zkonstruované syntetické luciferázy se produkují jako solubilní proteiny v E. coli. Z expresních testů je evidentní (Obrázek 1), že rozpustnost nově designovaných luciferáz je výrazně vyšší než rozpustnost stabilizované luciferázy z Renily fialové (RLuc8). Vysoká expresibilita a rozpustnost rekombinantních luciferáz jsou klíčové parametry pro jejich aplikační využití jako reportérové bioluminiscenční enzymy. Tři nově zkonstruované luciferázy (AncFT9, AncFT15 a AncFT16) byly vybrány pro detailní biochemickou charakterizaci. Rekombinantní produkce těchto luciferáz ve velkém měřítku ukázala, že je možné získat až desítky miligramů těchto luciferáz z 1 L buněčné kultury E. coli (Obrázek 2). Teplotní stability produkovaných luciferáz byly měřeny pomocí diferenciální skenovací fluorimetrie a jsou uvedeny v grafické příloze (Obrázek 3). Měření koelenterazin-závislé luciferázové aktivity prokázala, že nově zkonstruované luciferázy jsou plně funkční, generují modré světlo, a jejich enzymatická aktivita je prokazatelně vyšší než aktivita předešle zkonstruovaného prototypu AncFT (Tabulka 1).
ER -
MAREK, Martin, Jiří DAMBORSKÝ, David BEDNÁŘ, Daniel PLUSKAL, Marika MAJEROVÁ a Joan PLANAS IGLESIAS. \textit{Designované a syntetizované geny kódující nově zkonstruované proteinové katalyzátory (luciferázy) s ověřenými vlastnostmi}. 2021.
|
