Využití rekombinantního pseudoazurinu jako donoru elektronů nitritreduktasy s následným měřením dvouenzymové kinetiky

KUŇÁK, Michal and Igor KUČERA. Využití rekombinantního pseudoazurinu jako donoru elektronů nitritreduktasy s následným měřením dvouenzymové kinetiky (Utilization of recombinant pseudoazurin as an electron donor of nitrite reductase and follow-up measuring of dual enzymatic konetics.). Praha: Ceska spolecnost chemicka, 2002.

Basic information

• Original name: Využití rekombinantního pseudoazurinu jako donoru elektronů nitritreduktasy s následným měřením dvouenzymové kinetiky
• Name (in English): Utilization of recombinant pseudoazurin as an electron donor of nitrite reductase and follow-up measuring of dual enzymatic konetics.
• Authors: KUŇÁK, Michal and Igor KUČERA.
• Edition: Praha, 2002.
• Publisher: Ceska spolecnost chemicka

Other information

• Type of outcome: Proceedings paper
• Confidentiality degree: is not subject to a state or trade secret
• Organization unit: Faculty of Science
• Keywords in English: Pseudoazurin Kinetics Paracoccus enzyme denitrification

Abstract

Klíčovým krokem denitrifikace je konverze iontového dusitanu na plynný oxid dusnatý. U bakterie Paracoccus denitrificans ji katalyzuje enzym nitritreduktasa, typu cytochromu cd1. Nitritreduktasa však neinteraguje s membránovými komponentami přímo, ale vyžaduje přítomnost proteinového mediátoru, cytochromu c550, nebo pseudoazurinu (1). Vzhledem k vysoké koncentraci nitritreduktasy byl tento protein izolován z přirozeného zdroje Paracoccus denitroficans. Naproti tomu pseudoazurin se jak u mutantního kmene deficientního v cytochromu c550, tak i u divokého kmene vyskytuje ve velmi nízké koncentraci. Proto byla v případě tohoto proteinu využita rekombinantní technologie. Na základě známé sekvence pseudoazurinu byly vytvořeny primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR), které obsahují rozpoznávací místa pro vhodné restrikční endonukleasy Bam H1 a EcoR1. S pomocí těchto primerů, a s použitím chromozomální DNA bakterie Paracoccus denitrificans jako templátu byla v PCR, optimalizované pro syntézu dlouhých řetězců, amplifikována cDNA genu kódujícího pseudoazurin. Takto připravená DNA byla spojena s oligohistidinovou doménou a klonována do bakteriálního expresního systému. Bakteriální expresí byl vytvořen rekombinantní pseudoazurin, který byl následně purifikován s použitím chromatografie na matrici s vázanými ionty kovů. Schopnost transportu elektronů rekombinantně připraveného proteinu byla nejprve porovnána s aktivitou odpovídajícího proteinu vyizolovaného z divokého kmene Paracoccus denitrificans. Systém přenosu elektronů mezi dvěma typy respiračního řetězce byl charakterizován experimentálně na základě navrženého kinetického modelu. Nitritreduktasa byla vyizolována z divokého kmene Paracoccus denitrificans.

Abstract (in English)

Denitrification is an anaerobic respiratory process in which a nitrogen oxycompound serves as the electron acceptor. The key step of the whole denitrification pathway is the transformation of nitrite ion to gaseous nitric oxide. In the bacterium Paracoccus denitrificans this reaction is catalysed by nitrite reductase of the cytochrome cd1 type. The enzyme does not interact directly with membrane components but takes electrons from soluble periplasmic electron mediators (cytochrome c550 or pseudoazurin). Pseudoazurin in amount needed for konetics studies was obtained by procedure consisting of a PCR amplification of the pas gene, cloning in pRSET plasmid, overepression in E.coli DH5(and subsequent affinity chromatography (Ni-NTA Sepharose, fast flow, Qiagen)). Since P.denitrificans contains high concentration of nitrite reductase the enzyme could be isolated from wild strain of P.denitrificans. Activities of three different mediator proteins (horse cytochrome c, P. denitrificans cytochrome c550 and pseudoazurin) were compared by measuring the initial velocity of nitrite consumption in reconstituted systems containig membrane vesicles and nitrite reductase.