2007
Two-dimensional molecular profiling of multiple myeloma
ZELENÁ, Jana, Hana KONEČNÁ, Zbyněk ZDRÁHAL, Ondrej ŠEDO, Jana MORAVCOVÁ et. al.Základní údaje
Originální název
Two-dimensional molecular profiling of multiple myeloma
Název česky
Dvourozměrná molekulová analýza u mnohočetného myelomu
Autoři
ZELENÁ, Jana, Hana KONEČNÁ, Zbyněk ZDRÁHAL, Ondrej ŠEDO, Jana MORAVCOVÁ, Marcela RYCOVÁ, Drahomíra KYJOVSKÁ, Božena HANÁKOVÁ a Roman HÁJEK
Vydání
2007
Další údaje
Jazyk
angličtina
Typ výsledku
Prezentace na konferencích
Obor
30200 3.2 Clinical medicine
Stát vydavatele
Bulharsko
Utajení
není předmětem státního či obchodního tajemství
Organizační jednotka
Lékařská fakulta
Klíčová slova anglicky
2-DE; multiple myeloma; protein solubilization; proteomics
Štítky
Příznaky
Mezinárodní význam
Změněno: 21. 5. 2008 11:47, Mgr. Jana Čumová, Ph.D.
V originále
Multiple myeloma (MM) is a B-cell malignancy characterized by proliferation and accumulation of B lymphocytes and plasma cells, secreting monoclonal immunoglobulins, in the bone marrow and, less frequently, at extramedullary sites. Proteome analysis of clinical samples aims at characterizing disease-specific changes in the protein expression profile of an affected cell. Such changes could serve as potential diagnostic markers. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-DE) is widely used in comparative studies of protein expression levels. The potential of this method is strongly dependent on good sample preparation, in order to obtain proteomic maps with good reproducibility and resolution. Aims. The aim of this study was to optimize two-dimensional electrophoresis (2-DE) conditions for separation of human myeloma proteins. Methods. We have compared two different solubilization buffers, we also evaluated protein precipitation with ethanol (EtOH) and optimized 2-DE conditions for human myeloma proteins. Myeloma cell line ARH-77 was used to in the pilot study. Proteins from myeloma cell line ARH-77 were separated by 2-DE using a 17 cm pH 3-10 nonlinear immobilized pH gradient strips in the first dimension. Separation in the second-dimension was carried out on the Protean II Cell (Bio-Rad) using a 12% SDS-polyacrylamide gel. Separated proteins were stained with ProteoSilver Plus (Sigma). Spot detection, quantification, and alignment were performed with the PDQuest software (version 7.3.0., Bio-Rad). Results. Two concentrations of the detergent CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) in the solubilization buffer were tested, 2% and 4%. Higher concentration of CHAPS showed a greater ability to solubilize proteins. The most efficient solubilization was obtained with lysis buffer containing 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 60 mM DTT (dithiothreitol), 0.8% carrier ampholytes and 0.003% BPB (bromphenol blue). About 1448 spots were visualized in the gel using this lysis buffer. Many proteins (206 spots) were lost after the EtOH precipitation, though. Conclusions. Initial extraction and solubilization are key factors of proteomic analysis. The successful solubilization and 2-DE separation of proteins will be valuable tool for further study of the mechanisms of therapy resistance in purified plasma cells of patients with MM and further study of the biomarkers for prediction of progression of MGUS to overt myeloma.
Česky
Mnohočetný myelom je B- lymfoproliferativní onemocnění charakterizované proliferací a akumulací maligních B-lymfocytů plazmocytů a produkcí monoklonálních imunoglobulinů v kostní dřeni. Cílem proteomické analýzy klinických vzorků je charakterizace a stanovení specifických proteinových změn v zasažené nádorové buňce. Tyto specifické proteinové změny by mohly být potencionálními dignostickými markery pro zasaženou buňku. Dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu je nejvíce používanou metodou při srovnávacích studií měření proteinových změn. Potenciál této metody je závislý na dobré přípravě vzorku a pracovním postupu pro získání proteinových map s dobrou reprodukovatelností a rozlišením. Cílem této studie bylo optimalizovat podmínky dvourozměrné gelové analýzy pro separaci myelomových buněk. V této jsme srovnali lyzi buněk ve dvou různých lyzačních pufrech a také zhodnotili precipitaci proteinů v EtOH a dále optimalizovali 2-DE podmínky pro separaci proteinů získaných z myelomových buněk. V této pilotní studii byla použita myelomová buněčná linie ARH-77. Proteiny získané z této linie byly separovány v prvním rozměru 2-DE na 17 cm stripu v nelineárním pH rozmezí 3-10. Separace v druhém rozměru byla provedena na systému Protein II od firmy Bio-Rad ve 12% SDS-polyakrylamidovém gelu. Separované proteiny byly barveny ve stříbře (ProteoSilver Plus, Sigma). Detekce, kvantifikace obarvených spotů byla provedena v PDQuest software (verze 7.3.0., Bio-Rad). Pro zvýšení lyzace buněk byly testovány v lyzačních pufrech 2 koncentrace detergentu CHAPS: 2% a 4%. Vyšší koncetrace detergentu CHAPS umožnila lepší solubilizaci proteinů a jako optimalní lyzační pufr byl zvolen pufr obsahující 7 M močovinu, 2 M thiomočovinu, 4% CHAPS, 60 mM DTT, 0.8% amfolyty and 0.003% bromfenolovou modř. Pomocí tohoto pufru jsme rozdělili 1448 proteinových spotů z lyzovaného vzorku.myelomových buněk. 206 proteinových spotů se ztrácí po ethanolové precipitaci, proto tento postup již neprovádíme.
Návaznosti
| LC06027, projekt VaV |
| ||
| LC06034, projekt VaV |
| ||
| MSM0021622415, záměr |
| ||
| MSM0021622434, záměr |
|