Využití elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy v proteomice pro on-line tryptické štěpení proteinů

ZEISBERGEROVÁ, Marta, Andrea KLIMÍČKOVÁ a Zdeněk GLATZ. Využití elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy v proteomice pro on-line tryptické štěpení proteinů. In XXI. biochemický sjezd ČSBMB a SSBMB. Praha: Česká společnost pro biochemii a molekulární biologii, 2008, s. 223. ISBN 80-86313-21-2.

Základní údaje

• Originální název: Využití elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy v proteomice pro on-line tryptické štěpení proteinů
• Název česky: Využití elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy v proteomice pro on-line tryptické štěpení proteinů
• Název anglicky: Electrophoretically mediated microanalysis as a tool in proteomic research
• Autoři: ZEISBERGEROVÁ, Marta, Andrea KLIMÍČKOVÁ a Zdeněk GLATZ.
• Vydání: Praha, XXI. biochemický sjezd ČSBMB a SSBMB, s. 223-223, 2008.
• Nakladatel: Česká společnost pro biochemii a molekulární biologii

Další údaje

• Originální jazyk: čeština
• Typ výsledku: Stať ve sborníku
• Obor: 10600 1.6 Biological sciences
• Stát vydavatele: Česká republika
• Utajení: není předmětem státního či obchodního tajemství
• Organizační jednotka: Přírodovědecká fakulta
• ISBN: 80-86313-21-2
• Klíčová slova anglicky: kapilární elektroforéza; EMMA; proteomika
• Štítky: EMMA, kapilární elektroforéza, Proteomika
• Příznaky: Mezinárodní význam, Recenzováno

Anotace

Proteomika je rychle se rozvíjející oblast biochemického výzkumu, jejíž hlavní náplní je charakterizace komplexních směsi proteinů extrahovaných z buněk či tkání. Dominantní metodou je zde dvojrozměrná elektroforéza 2D-PAGE. Přestože je schopna rozseparovat tisíce proteinů během jediné analýzy, má vážná omezení, jde o metodu pracnou a časově náročnou, nelze opomenout i limitovanou citlivost a dynamický rozsah. Proto jsou hledány jiné metody vyznačující se vysokou separační účinnosti, a především možností přímé kombinace s tryptickým štěpením a detekcí pomocí MS. Jako jedna z variant se také nabízí kapilární elektroforéza (CE), především pak její modifikace elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza (EMMA). Ta se vyznačuje plnou automatizací kombinovanou s velmi malou spotřebou vzorku, což je dáno tím, že EMMA využívá kapiláru nejenom jako separační medium, ale také jako reakční prostor. Cílem této práce bylo využít metodu EMMA pro on-line tryptické štěpení proteinů pro proteomický výzkum s předpokládaným spojením s detekcí pomocí MS. Vzhledem ke skutečnosti že pH optimum trypsinové reakce se liší od optimálního pH používaného v CE pro separaci peptidů, byla zde použita kombinace metody EMMA s technikou částečného plnění kapiláry. V tomto uspořádání je ta část kapiláry kde probíhá tryptické štěpení naplněna pufrem optimálním pro tuto reakci (Tris-HCl pufr pH 8.5), kdežto zbytek kapiláry základním elektrolytem optimálním pro separaci peptidů (0.1 M fosfátový pufr pH 2.5). Jelikož se proteiny liší svými pI a tím i efektivní mobilitou, bylo použito sendvičové dávkování, při kterém je vzorek proteinu nadávkován mezi dvě zóny trypsinu, což zaručuje jejich promíchání a tím i digesci. Analýza jednoho proteinu včetně digesce a separace vzniklých peptidů tak trvá jednu hodinu, což je značné zkrácení oproti klasické digesci v roztoku.

Anotace anglicky

Proteomics is a rapidly developing field of biochemical research which aims to characterize complex mixtures of proteins extracted from cells, tissues or organisms. The predominant method of proteom analysis involves the proteins separation by two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE) following by protein spots visualization and proteolytical digestion. However 2D-PAGE has serious limitations. Although it is able to resolve thousands of proteins in a single run, 2D-PAGE is also relatively labour-intensive, time-consuming and has both sensitivity and dynamic range limits. In this consequence new high efficient separation methods are looked for especially their direct combinations with MS or even MS/MS. Capillary electrophoresis (CE) could be the other method of the choice for this purpose since the CE analyses are rapid, can be automated, and require only small amounts of samples. Moreover CE based systems using the multi-capillaries formats or the microfabricated multiple-channel chips have a great potential for high-throughput analyses. The electrophoretically mediated microanalysis (EMMA) methodology is probably the best candidate for this purpose because its main feature is full automatization combined with very low sample consumption. The reason is that this CE modification introduced by Bao and Regnier in 1992 uses the capillary not only as a separation medium but also as a reaction chamber for the enzymatic and even non-enzymatic reactions. This work aims to apply the EMMA methodology for on-capillary protein digestion in proteomic research with planned possibility of MS connection. The combination of the EMMA methodology with a partial filling technique was used in this study since the pH optimum of trypsin reaction strongly differs from the pH best for the CE separation of peptides. In this set-up the part of the capillary is filled with the buffer best for the tryptic digestion (Tris-HCl buffer pH 8.5) whereas the rest of the capillary with the background electrolyte optimal for peptides separation and certain detection system (phosphate or formate buffer pH 2.5). As the proteins differ in pI the sandwich type of injection was used. The analysed protein is thus injected between two trypsin zones that should ensure their mixing and digestion. The analysis of one protein comprising both the digestion and the peptides separation is thus finished in 1 hour. Compared to in-solution tryptic digestion or trypsin reactors commonly used for this purpose, the EMMA digestion is rapid, can be automated and relatively easily connected with MS detection, and requires only small amount of protein sample.

Návaznosti

• GA203/06/0047, projekt VaV: Název: Využití kapilární elektroforézy pro studium metabolismu léčiv

Investor: Grantová agentura ČR, Využití kapilární elektroforézy pro studium metabolismu léčiv

• GA525/08/0697, projekt VaV: Název: Aktivita acidofilních bakterií oxidujících síru za aerobních a anaerobních podmínek

Investor: Grantová agentura ČR, Aktivita acidofilních bakterií oxidujících síru za aerobních a anaerobních podmínek

• LC06023, projekt VaV: Název: Integrované bioanalytické technologie pro mikroanalýzy a diagnostiku s využitím LIF a hmotnostní spektrometrie

Investor: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, Integrované bioanalytické technologie pro mikroanalýzy a diagnostiku s využitím LIF a hmotnostní spektrometrie

• MSM0021622413, záměr: Název: Proteiny v metabolismu a při interakci organismů s prostředím

Investor: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, Proteiny v metabolismu a při interakci organismů s prostředím