Random mutagenesis as a tool for improving properties of PA-IIL lectin from Pseudomonas aeruginosa

MRÁZKOVÁ, Jana, Martina POKORNÁ a Michaela WIMMEROVÁ. Random mutagenesis as a tool for improving properties of PA-IIL lectin from Pseudomonas aeruginosa. In Struktura a interakce biomolekul. 2010.

Základní údaje

• Originální název: Random mutagenesis as a tool for improving properties of PA-IIL lectin from Pseudomonas aeruginosa
• Název česky: Náhodná mutageneze jako nástroj pro vylepšení vlastností lektinu PA-IIL z Pseudomonas aeruginosa
• Autoři: MRÁZKOVÁ, Jana (203 Česká republika, domácí), Martina POKORNÁ (203 Česká republika, domácí) a Michaela WIMMEROVÁ (203 Česká republika, garant, domácí).
• Vydání: Struktura a interakce biomolekul, 2010.

Další údaje

• Originální jazyk: angličtina
• Typ výsledku: Konferenční abstrakt
• Obor: 10600 1.6 Biological sciences
• Stát vydavatele: Česká republika
• Utajení: není předmětem státního či obchodního tajemství
• Kód RIV: RIV/00216224:14310/10:00057485
• Organizační jednotka: Přírodovědecká fakulta
• Klíčová slova česky: náhodná mutageneze; lektiny; PA-IIL; Pseudomonas aeruginosa
• Klíčová slova anglicky: random mutagenesis; lectins; PA-IIL; Pseudomonas aeruginosa

Anotace

Random mutagenesis is the most useful approach in directed evolution, widely used in protein engineering for producing proteins with altered or improved properties. Random mutagenesis includes a lot of methods used to create diverse mutant libraries. One of these methods is error-prone PCR. This technique introduces nucleotide changes during PCR due to the use of error-prone DNA polymerase and mutational reaction conditions. LecB is the target gene we have modified via random mutagenesis. This gene codes PA-IIL lectin from Pseudomonas aeruginosa. This lectin is well-characterized and it is indisputable that it displays an unusually high affinity for monosaccharides widely occurring as terminal residues in cell surface glycoconjugates highly present in cystic fibrosis mucins. The random mutagenesis could help us to create a protein with interestingly modified properties towards monospecificity. After several trials with commercial screens that haven’t brought expected percentage of mutated amino acids, we have optimized error-prone reaction conditions to give sufficient results. Finally, we obtained an efficient method which introduces non-silent random mutations into the gene of our interest in sufficient rate. Currently, methods for high throughput screening of mutant libraries have been optimised to find mutants with modified affinity and specificity. The mutated lectins with improved properties could be further used in biotechnology and for bioanalytical purposes.

Anotace česky

Náhodná mutageneze je nejužitečnější přístup v rámci řízené evoluce a je široce využívána v proteinovém inženýrství k produkci proteinů s pozměněnými anebo vylepšenými vlastnostmi. Náhodná mutageneze zahrnuje mnoho metod, které jsou používány pro přípravu rozsáhlých knihoven mutantů. Jednou z těchto metod je i error-prone PCR. Tato technika zavádí nukleotidové změny během PCR díky použití DNA polymerasy náchylné k chybám a mutačním reakčním podmínkám. LecB je cílový gen vybraný pro modifikaci pomocí náhodné mutageneze. Tento gen kóduje lektin PA-IIL z bakterie Pseudomonas aeruginosa. Tento lektin je velmi dobře charakterizovaný a je nesporné, že vykazuje neobvykle vysokou afinitu k monosacharidům široce se vyskytujícím jako terminální residua glykokonjugátů buněčného povrchu, které sou přítomné v mucinech pacientů s cystickou fibrosou. Náhodná mutageneze by mohla pomoci s vytvořením proteinu se zajímavě pozměněnými vlastnostmi vůči specifitě. Po několika pokusech s komerčními kity, které neposkytovaly očekávané procento mutovaných aminokyselin jsme zoptimalizovali reakční podmínky error-prone PCR abychom dostali vyhovující výsledky. Nakonec jsme získali účinnou metodu, která zavádí náhodné mutace do cílového genu v dostatečné míře. V současné době jsou optimalizovány metody pro high-throughput screening knihoven mutantů, aby byly nalezeni mutant se změněnou afinitou anebo specifitou. Mutované lektiny s vylepšenými vlastnostmi mohou být dale využity v biotechnologii a pro bioanalytické účely.

Návaznosti

• GD301/09/H004, projekt VaV: Název: Molekulární a strukturní biologie vybraných cytostatik. Od mechanistických studií k chemoterapii rakoviny

Investor: Grantová agentura ČR, Molekulární a strukturní biologie vybraných cytostatik. Od mechanických studií k chemoterapii rakoviny

• MSM0021622413, záměr: Název: Proteiny v metabolismu a při interakci organismů s prostředím

Investor: Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, Proteiny v metabolismu a při interakci organismů s prostředím