Výzkum cytokininového hormonálního systému je klíčový pro pochopení základních procesů řízení růstu a vývoje rostlin s nedozírnými možnostmi využití výsledků v biotechnologiích a zemědělství. Proteinové inženýrství umožňuje studovat jednotlivé funkční proteiny zapojené do metabolismu a signalizace cytokininů a na molekulární úrovni rozplétat složitou síť interakcí, která je zodpovědná za komplexní řízení fyziologie rostliny. Pro výzkum a vývoj proteinů jsou klíčové analytické metody umožňující jejich kvalitativní a kvantitativní stanovení v komplexních biologických vzorcích. Neméně důležité jsou postupy zajišťující produkci a purifikaci vysoce čistých proteinů pro analýzy. Dále metody pro charakterizaci funkce proteinů, jejich chemických vlastností, identifikace ligandů, substrátů a jiných nízkomolekulárních interakčních partnerů. V rámci disertační práce bude využita metoda pro fluorimetrické stanovení produktů enzymových reakcí b-glukosidas, kterou student úspěšně vyvinul v rámci diplomové práce (patentová přihláška PV2013-246). Metoda bude dále optimalizována včetně automatizace a miniaturizace pro skríning funkčních glukosidas a jejich substrátovou charakterizaci. Podle výsledků testů budou nejlepší klony exprimovány v heterologním expresním systému a proteiny budou purifikovány pomocí chromatografických metod. Dále budou proteiny charakterizovány pomocí elektroforetických metod. Pro identifikaci a kvantifikaci vybraných proteinů bude zavedena metoda hmotnostní spektrometrie s využitím nové instrumentace na pracovišti CEITEC-MENDELU. Pro detailní fluorimetrickou analýzu oligomerizace b-glukosidas budou konstruovány fůzní proteiny s eGFP a jinými deriváty GFP. Budou stanoveny kinetické parametry nových b-glukosidas a diskutovány v kontextu publikovaných dat u rostlinných b-glukosidas. Získané poznatky přispějí k zavedení nových postupů v skríningu a charakterizaci proteinů využitelných k modulaci specificity a oligomerizace b-glukosidas a tím ovlivnění procesu reverzibilní konjugace v regulaci aktivních cytokininů. Literatura: Brzobohatý B, Moore I, Kristoffersen P, Bako L, Campos N, Schell J, Palme K. (1993) Release of active cytokinin by a b-glucosidase localized to the maize root meristem. Science 262, 1052-1054. Kristoffersen P, Brzobohatý B, Höhfeld I, Bako L, Melkonian M, Palme K. (2000) Developmental regulation of the maize Zm-p60.1 gene encoding a b-glucosidase localized to plastids. Planta 210: 407-415. Mazura P, Fohlerová R, Brzobohatý B, Kiran NS, Janda L. A new, sensitive method for enzyme kinetic studies of scarce glucosides. J Biochem BiophysMethods. 2006 Jul 31;68(1):55-63. Epub 2006 May 2. PubMed PMID: 16730803. Sakakibara H. (2006) Cytokinins: activity, biosynthesis, and translocation. Annual Reviews in Plant Biology. 57: 431–449. Kiran, N.S., Polanská, L., Fohlerová, R., Mazura, P., Válková, M., Šmeral, M., Zouhar, J., Malbeck, J., Dobrev, P., Macháčková, I., and Brzobohatý, B. (2006) Ectopic over-expression of the maize b-glucosidase Zm-p60.1 perturbs cytokinin homeostasis in transgenic tobacco. Journal of Experimental Botany 57: 985-996. Dopitová R, Mazura P, Janda L, Chaloupková R, Jerábek P, Damborský J, Filipi T, Kiran NS, Brzobohatý B. Functional analysis of the aglycone-binding site of the maize beta-glucosidase Zm-p60.1FEBS J. 2008 Dec;275(24):6123-35. Filipi T, Mazura P, Janda L, Kiran NS, Brzobohatý B. Engineering thecytokinin-glucoside specificity of the maize b-D-glucosidase Zm-p60.1 using site-directed random mutagenesis. Phytochemistry. 2012 Feb;74:40-8. doi: 10.1016/j.phytochem.2011.10.008. Epub 2011 Nov 11. PubMed PMID: 22079107.