DNA je pouze začátkem pro pochopení lidského genomu

Studijní text Animace Galerie Video BIO Úkol Odkazy a literatura

Ačkoliv DNA přenáší genetickou informaci v čase, má v podstatě pasivní roli. Bezpočet buněčných reakcí, které představují „život“, ve skutečnosti provádí proteiny, které jsou v DNA kódovány. Nyní, když nám Projekt lidského genomu poskytl katalog desítek tisíc genů, zůstala nám otázka: „Co těmito geny vytvořené proteiny vlastně dělají?“

Vědci vždy sledovali mutantní organismy, které poskytují vodítko ke zjištění funkce proteinu. Dnes mohou být vytvořeni speciální mutanti vložením změněné nebo nefunkční kopie genu zpět do živého organismu, kde pak hledáme změny v chování nebo vývoji. Zvířecím modelem pro velké funkční studie se staly myši, protože se snadno kříží, rychle se množí a s lidmi sdílí asi 99 % genů. Nicméně provést jediný transgenní experiment je o několik řádů obtížnější než sekvenování samotného genu. Skutečná práce pro pochopení lidského genomu stále leží před námi.

Věděli jste, že?

Když Mario Capecchi své představy o zacílení genů poprvé předložil NIH, aby získal na výzkum peníze, byl odmítnut. O čtyři roky a několik úspěšných experimentů později, NIH jeho projekt začala financovat a omluvila se mu.

Hmmm…

Rekombinační systém Cre/lox byl poprvé nalezen u fágů. Proč se takový systém vyvinul?

Galerie

Věděli jste, že?

Systém Cre/lox je pod patentovou ochranou. Když Brian Sauer v Dupontu systém vyvinul, nechal si jej Dupont patentovat a pro využití této technologie uděluje licence.

Hmm…

Jak může být zacílení genů využito pro genové terapie?

Video

Videa v této kapitole jsou v původním anglickém znění.

Brian Sauer Než se Brian Sauer začal zabývat poradenstvím v oblasti genetického inženýrství, dělal ředitele transgenních technologií na ústavu Stowers.

Mario Capecchi vyvinul u myší techniku cíleného mutování genů pomocí homologní rekombinace. Brian Sauer upravil fágový rekombinační systém cre/lox pro vyřazení (knock out) savčích genů.

Mario Renato Capecchi (1937-)

V roce 1980 čelil Mario Capecchi nejisté budoucnosti. Hodnotitelé považovali jeho výzkumný projekt, který poslal na NIH, za „nevhodný výkonu“, takže Capecchi zariskoval a využil peníze z jiných projektů, aby mohl financovat tento svůj nový výzkum. Pokud by to však nevyšlo, pak riskoval ztrátu financování všech svých výzkumů, což je pro výzkumné pracovníky na dnešních univerzitách jako rozsudek smrti. Ale člověku, který strávil pět let jako sirotek bez domova v ulicích válkou zničené Itálie, se riziko zřejmě zdálo malé.

První čtyři roky svého života prožil Capecchi se svojí matkou, básnířkou Lucy Dodd-Rambergovou. Lucy se připojila ke skupině umělců bojujících v severní Itálii proti fašismu. Tady se setkala s Mariovým otcem, důstojníkem italského letectva. Capecchi říká, že měli vášnivý románek, ale Lucy si ho moudře odmítla vzít.

Když začala druhá světová válka, byla Mariova matka spolu s dalšími umělci zatčena gestapem a poslána do Dachau. Lucy zatčení očekávala a zařídila, aby Mario žil s přáteli z peněz, které získala z prodeje veškerého majetku. Po roce však peníze došly (nebo byly ukradeny Mariovým otcem) a pětiletý Mario byl ponechán, aby se o sebe staral sám.

Zamířil na jih a vstoupil do gangu dalších sirotků bez domova, kradl jídlo na otevřených tržištích a spal ve vybombardovaných budovách. Policie ho znovu a znovu chytala a posílala po dětských domovech a nemocnicích, ale život v nich byl ještě horší. V nemocnici jeho podvýživu léčili jednou denně šálkem kávy a kusem chleba, Mario trávil dny nahý na posteli v horečnatém deliriu.

Po válce byla Capecchiho matka z vězení propuštěna a rok prohledávala Itálii, než Maria našla v nemocnici Reggio Emelia, města blízko Boloni. Žena nevypadala vůbec jako matka, kterou si pamatoval, ale slíbila mu, že ho z nemocnice odveze, a tak s ní odcestoval ke Quakerské komunitě jeho strýce nedaleko Philadelphie do Spojených států. Když začalo být jasné, že Lucy je příliš psychicky poznamenaná válkou, než aby o něj pečovala, snažili se ho v jeho devíti letech vychovávat Edward Ramberg a jeho žena Sarah.

Mario přišel do třetí třídy místní veřejné školy, aniž by uměl anglicky a většinu času trávil bitím svých spolužáků. Na střední škole se socializoval, částečně díky svému zapojení ve sportu. Capecchi si myslí, že hraní za školní týmy ve fotbalu, baseballu, amerického fotbalu a wrestlingu ho naučilo lidské psychologii, kterou nakonec převedl i do dalších vztahů.

Na vysoké škole v Antiochii začal studovat politické vědy, aby zkombinoval svou úctu k vědě se svým smyslem pro společenskou odpovědnost. Avšak v politice našel vědy málo a opustil ji kvůli fyzice a chemii. Než v roce 1961 absolvoval, tak už věděl, že v postgraduálním studiu se zaměří na molekulární biologii. Tento obor byl tak nový, že v něm vše bylo možné a mohli jste se ptát na cokoliv.

Capecchiho poradce na Harvardu James Watson, směroval Maria pryč od nedůležitých otázek, které by pravděpodobně poskytly jen nedůležité odpovědi. V roce 1967 získal doktorát a v roce 1969 vstoupil na biochemickou fakultu na Harvard Medical School.

I když v oblasti Bostonu byly tisíce výzkumných pracovníků a potenciálních spolupracovníků, Capecchi cítil, že potřebuje větší izolaci, aby mohl přemýšlet nad velkými otázkami, které měl ve své hlavě. V roce 1973 přešel na University of Utah v Salt Lake City, kde měl na oddělení, které pokrývalo vše od evoluce až k molekulární biologii, jen 20 kolegů.

Profesní riziko, které v roce 1980 podstoupil s financováním svého výzkumu, se nakonec vyplatilo, a Capechi byl na cestě k systému pro přesné mutování jakéhokoli genu u savčích buněk. Nejenže tato technika pomáhá vědcům vytvářet myši s lidskými nemocemi pro jejich studium, ale v budoucnu může být využita i v genové terapii pro opravu genů způsobujících nemoci. Když v roce 1984 znovu psal na NIH, hodnotitelé přiznali svoji chybu: „Jsme rádi, že jste se neřídil naší radou.“ V roce 2007 získali Capecchi, Evans a Smithies za svou práci Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu.

Mario Capecchi je v současnosti profesorem lidské genetiky na University of Utah a žije se svou manželkou a dcerou na samotě v horách nedaleko Salt Lake City. V roce 1996 obdržel cenu Kyoto za celoživotní přínos.

Brian Sauer (1949-)

Brian Sauer je možná jedním z mála vědců, kteří byli kvůli zájmu o vědu málem zatknuti. Sauer (vyslovováno „sour“) si postavil svůj dalekohled na tmavé místo nedaleko téměř opuštěného sídliště, aby pozoroval Halleyovu kometu. Těch pár domů roztroušených kolem vypadalo opuštěně, ale jedna stará paní ho zahlédla a zavolala na něj státní policii. Noci ve vězení se vyhnul jen proto, že jednomu z důstojníků nabídl možnost podívat se zblízka na kometu.

Když vyrůstal na rodinné mléčné farmě v Madisonu ve státě Wisconsin, byla jeho prvním vědeckým zájmem astronomie. První dalekohled postavil z lepenkové tuby a vybavil ji čtyřmi čočkami. „Vyrůstal jsem na venkově a obloha byla stále tmavá. Ve škole jsem lidem říkal, že chci být astrofyzikem.“

Prvních pět let školní docházky navštěvoval jednotřídku s dětmi od prvního do osmého stupně. Vzpomíná, že někdy kolem prosince „vždy bylo školní představení a nebyly žádné hodiny, protože učitel byl příliš zaneprázdněn přípravou každého žáka na jeho roli.“ Aby zabil čas mezi zkouškami své role, hrál se staršími studenty poker.

Kromě dalekohledu postavil také krátkovlnné rádio a poslouchal kanadské stanice. „Ale když žiješ ve Wisconsinu, není to velká výzva,“ přiznává. Zvětšováním rozsahu se mu podařilo naladit také evropské stanice a poslouchal pořady v angličtině přenášené do USA. Tato zkušenost ho vedla k napsání školní eseje o nacistické propagandě proti spojeneckým vojskům během druhé světové války.

Během školních přestávek se přidával k ostatním chlapcům při hře baseballu. (Před tím než chtěl být astrofyzikem, toužil stát se nadhazovačem Major League a stále si myslí, že Brave Warren Spahn z Milwaukee byl jedním z nejlepších nadhazovačů). Jejich baseballové hřiště bylo ohraničeno svižně tekoucím potokem, takže faulové hody mimo hřiště končily ve vodě. Vzhledem k tomu, že na hraní měli pouze jeden míč, všichni zakřičeli „Míč v zátoce!“ a běželi do potoka ho vylovit. „Museli jsme ho chytit dříve, než doplaval ke splavu, protože jinak by byl navždy pryč.“

Po střední škole začal v roce 1967 studovat fyziku na Wisconsinské univerzitě, ale zjistil, že ta ho nudí a přešel na matematiku. Jednoho dne během posledního ročníku, zatímco pracoval na matematickém problému na velké tabuli ve svém obývacím pokoji, přišel jeho spolubydlící a začal kreslit strukturu DNA. Molekula ho zaujala, proto šel Sauer po zisku matematického titulu pracovat do laboratoře v Madisonu.

„Byl jsem matematik, který měl zájem dělat něco v biologii, a tím nejzajímavějším byla podle mého názoru genetika,“ vzpomíná. S touto myšlenkou začal v roce 1973 postgraduální studium na Kalifornské univerzitě v Berkeley. Pracoval s P2 fágem, kterého nazýval „ten další“ fág, protože většina virologů v té době pracovala s fágem lambda. Když cestoval na konference, poslouchalo jeho prezentaci jen asi 10 vědců s kocovinou, protože přednášky o „tom dalším“ fágu byly vždy naplánovány na nedělní ráno.

V roce 1984 jako postdoktorand na Stanfordu a na pozici v National Cancer Institute následoval svého šéfa z NCI do DuPontu. Jeho kolegové vypracovali biochemii rekombinačního systému Cre/lox u P1 fága, a protože byla jednoduchá, pomyslel si, že by to mohlo fungovat také v eukaryotických buňkách. Pozval odborníky na kvasinky a systém vložil do houby s očekáváním spíše málo efektivní rekombinace. Namísto toho „se ukázalo, že Cre pracuje velmi efektivně.“ Poté, co systém fungoval také u myších buněk, uvědomil si, že „teď můžeme v savčích buňkách provádět věci, které byly před 50 lety prováděny na octomilce.“

V roce 1998 Sauer přesídlil na Oklahoma Medical Research Foundation, kde řídil výzkumný program vývojové biologie a centrum knock-outu u myší. Než přešel k poradenství v oblasti genetického inženýrství, byl ředitelem transgenních technologií na Stowers Institute. Jeho výzkum se snaží rozšifrovat mechanizmus rekombinace DNA tak, aby bylo možné mnohem přesněji upravit myší genom.

Věděli jste, že?

O Mariu Capecchim se říká, že je „zažraný“ do práce. Na pěstování a injikování embryí často pracuje bez přestávky celý den.

Hmmm…

Když jsou transformované ES buňky injikovány do blastocysty, jsou začleněny do vyvíjejícího se embrya. Jak to?

Odkazy a literatura

Obrázky embrya
Na této stránce najdete fotografie vývoje savčích embryí, zejména myších, ze skenovacího elektronového mikroskopu. Prohlížet můžete i fotografie lidského embrya. Normální a abnormální vývoj jsou popsány v tutoriálech podle části těla. O myších a lidech
Článek z lékařského ústavu Howarda Hughese o tom, jak u myší funguje zacílení genu. Hollidayova struktura
Stručný popis s animací o tom, jak funguje výměna řetězců mezi dvěma kusy DNA.

• Capecchi, M.R., 1997, Hox Genes and Mammalian Development, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 62: 273-281.
• Capecchi, M.R., 1989, Altering the Genome by Homologous Recombination, Science, 244: 1288-1292.
• Capecchi, M.R., 1994, Targeted Gene Replacement, Scientific American, March, 52-59.
• Davis, A.P., Witte, D.P., Hsieh-Li, H.M., Potter, S.S., and Capecchi, M.R., 1995, Absence of radius and ulna in mice lacking hoxa-11 and hoxd-11, Nature, 375: 791-795.
• Fukushige, S., Sauer, B., 1992, Genomic targeting with a positive-selection lox integration vector allows highly reproducible gene expression in mammalian cells, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 7905-7909.
• Mansour, S.L., Thomas, K.R., Capecchi, M.R., 1988, Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes, Nature, 336: 348-352.
• Sauer, B., Henderson, N., 1988, Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5166-5170.

RNDr. Pavel Lízal, Ph.D., Mgr. Zuzana Hanzelková a kolektiv |
ÚEB, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita |
Mendelovo muzeum, Masarykova univerzita |
Návrat na úvodní stránku webu, přístupnost |

| Technická spolupráce:
| Servisní středisko pro e-learning na MU
| Fakulta informatiky Masarykovy univerzity, 2013

Centrum interaktivních a multimediálních studijních opor pro inovaci výuky a efektivní učení | CZ.1.07/2.2.00/28.0041

Nahoru