Co je oxidační stres

Oxidační stres je mechanismus poškození organismu, který se spoluúčastní v patogenezi řady onemocnění a jejich komplikací, např. aterosklerózy, diabetu mellitu, onemocnění ledvin, ischemicko-reperfúzního poškození, neurodegenerativních onemocnění , karcinogenezi či zánětlivých onemocnění.

Oxidační stres je definován jako nerovnováha mezi zvýšenou tvorbou oxidantů a nedostatečnými ochrannými antioxidačními mechanismy, vedoucí ke tkáňovému poškození.

 

Oxidanty – volné radikály a reaktivní formy kyslíku a dusíku

Oxidanty jsou volné radikály a další reaktivní formy kyslíku a dusíku, které s radikálovými reakcemi úzce souvisejí. Volné radikály jsou atomy, molekuly nebo ionty, které obsahují ve valenční sféře jeden nebo více nepárových elektronů. Jsou nestabilní, vysoce reaktivní a mají tendenci k řetězovým reakcím. Významnými oxidanty jsou např. hydroxylový radikál OH·, superoxid O₂·^-, singletový kyslík 1O₂, peroxid vodíku H₂O₂, oxid dusnatý NO·, kyselina chlorná HClO, peroxylové a alkoxylové radikály ROO· a RO· atd.  Reakce vedoucí ke vzniku oxidantů jsou ukázány na obr.1.

 

Obrázek 1. Vznik oxidantů je jejich vzájemné reakce.

 

Nejvýznamnějším zdrojem volných radikálů v organismu je mitochondriální respirační řetězec. Kyslík běžně akceptuje 4 elektrony a je přeměněn na vodu. Tato reakce ovšem probíhá postupně: kyslík → superoxid → peroxid vodíku → hydroxylový radikál → voda. Dalším významným producentem oxidantů jsou fagocyty (neutrofily a monocyty-makrofágy), a to jejich NADPH-oxidáza a myeloperoxidáza. Při respiračním vzplanutí (obr. 2), po aktivaci zánětlivými stimuly, NADPH-oxidáza redukuje molekulární kyslík na superoxid a ten je následně konvertován na peroxid vodíku. Tyto látky pak mohou být dalším zdrojem oxidantů – oxidu dusnatého, peroxynitritu a hydroxylového radikálu. V přítomnosti chloridových iontů je navíc peroxid vodíku myeloperoxidázou metabolizován na kyselinu chlornou, která může následně reagovat s endogenními aminy za vzniku chloraminů. Volné radikály vznikají také při detoxifikaci xenobiotik a v řadě dalších chemických reakcí – reakce katalyzované cytochromem P450, xantinoxidázou, lipoperoxidázou či cyklooxygenázou. Jejich vznik je urychlován přechodnými kovy (železo, měď – Fentonova reakce: H₂O₂ + Fe²⁺ → HO^∙ + OH^- + Fe³⁺). Oxid dusnatý (NO·) vzniká z L-argininu vlivem NO syntázy. Konstitutivní NOS se nachází zejména v endotelu a neuronech, inducibilní NOS zejména v makrofázích.

Obrázek 2. Respirační vzplanutí neutrofiů.

 

Antioxidanty – látky působící proti oxidantům

Antioxidanty jsou látky, které působí proti vzniku a efektu volných radikálů – jako scavangery (lapače) volných radikálů, jako inhibitory vzniku volných radikálů, např. vazbou přechodných kovů, nebo odstraňují hydroperoxidy a reparují poškození. Antioxidanty v lidském organismu je možno rozdělit do dvou skupin:

●     enzymy a jejich kofaktory = stopové prvky (superoxiddismutáza - měď, zinek, mangan; glutathionperoxidáza - selen; kataláza - železo; cytochrom P450, laktoperoxidáza

●     substráty – lipofilní (tokoferoly a karotenoidy) a hydrofilní (kyselina askorbová, glutathion, thioly, ceruloplasmin, transferin, ferritin, albumin, bilirubin, kyselina močová a další).

Antioxidační vlastnosti má i řada syntetických látek, např. cheláty železa a mědi – deferoxamin a penicilamin, inhibitory xantinoxidázy – allopurinol a oxypurinol, probukol, lazaroidy, inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu a statiny.

 

Látky vzniklé vlivem oxidačního stresu – produkty radikálových reakcí a jejich význam při tkáňovém poškození

Vlivem oxidačního stresu dochází k modifikaci biologicky významných látek – změně struktury – fragmentaci, agregaci, zesítění, změně vlastností - hydrofobicity, náchylnosti k proteolýze, funkci a změně imunologických vlastností. Změny závisejí na chemické podstatě působící látky a na intenzitě ataky. Poškození se týká lipidů, proteinů, sacharidů i nukleových kyselin. V lipidech jsou k radikálovým reakcím nejvíce náchylné mastné kyseliny s více dvojnými vazbami – polynenasycené mastné kyseliny a děj se nazývá lipoperoxidace. Postupně dochází k přeuspořádání jejich struktury, vznikají konjugované dieny, peroxylové a alkoxylové radikály a hydroperoxidy a může také dojít ke štěpení modifikované molekuly na kratší produkty a vzniku malondialdehydu či 4-hydroxynonenalu. Poškození se může týkat jak membránových lipidů, tak lipoproteinů. V proteinech jsou poškozovány především aminokyseliny tyrosin, methionin, cystein a tryptofan, může dojít k jejich oxidaci, nitraci, chloraci a vzniku dimerů. Proteiny pak mohou agregovat a síťovat, vznikají tzn. produkty pokročilé oxidace proteinů (AOPP, advanced oxidation protein products). Za přispění sacharidů a též vlivem karbonylového stresu vznikají konečné produkty pokročilé glykace (AGEs, advanced glycation end products). Proteiny mohou být také modifikovány prostřednictvím produktů lipoperoxidace (malondialdehydlyzin, hydroxynonenal a akrolein addukt proteinu) a vznikají tzv. konečné produkty pokročilé lipoperoxidace (ALEs, advanced lipoperoxidation products). Poškození DNA se týká deoxyribózy i bází, jejich následkem jsou zlomy řetězce DNA a křížové vazby řetězců. Poškození biologických struktur a jeho následky je znázorněno na obr. 3.

Obrázek 3. Následky oxidačního stresu.

 

 

Oxidační stres úzce souvisí s karbonylovým stresem, který je charakterizován jako zvýšení reaktivních karbonylových sloučenin způsobené jejich sníženou tvorbou a/nebo jejich sníženým odbouráváním a vylučováním. Jde o látky obsahující karbonylovou skupinu, např. glyoxal, methylglyoxal, či produkty lipoperoxidace malondialdehyd a 4-hydroxynonenal. Reaktivní karbonylové sloučeniny mohou vznikat ze sacharidů, lipidů i aminokyselin oxidační i neoxidační cestou a mohou dát vznik ALEs a AGEs. Nejlépe charakterizovány jsou AGEs, heterogenní skupina látek, mezi než patří např. karboxymethyllyzin, pentosidin, glyoxal-lyzindimer či methylglyoxal-lyzindimer, vznikající spontánně neenzymatickou glykací, ale též vlivem oxidačního a karbonylového stresu. Konečné produkty pokročilého poškození oxidačním a karbonylovým stresem (AGEs, ALEs, AOPP) mají kromě poškození struktury a změny biologických vlastností důležitých látek řadu dalších účinků zprostředkovaných přes specifické receptory, z nichž jako první byl popsán RAGE (receptor pro AGEs, podstatné jsou ale zřejmě AGE-R1, R2 a R3).

RAGE je receptor multiligandový, AGEs byly popsány jako 1. ligandy. Na RAGE se váže např. β-amyloid, S100-proteiny/kalgranuliny nebo HMGB1 (high mobility box group protein 1). Interakce ligand s receptorem RAGE spustí signální kaskádu, zahrnující p21ras, MAP-kinázu, ERK-kinázy a JNK-kinázy, a dochází k aktivaci nukleárního faktoru κB, což je také spojeno s oxidačním stresem. Následuje stimulace transkripce genů pro cytokiny a růstové faktory (TNF, IL-1, PDGF, IGF-1, interferon γ), adhezní molekuly (ICAM-1, VCAM-1), stimulace buněčné proliferace, zvýšení vaskulární permeability, indukce migrace makrofágů atd. Interakce AGE-RAGE a následný oxidační stres a také AGEs přímo působí také poškození DNA. Navíc aktivací RAGE dochází k ovlivnění exprese a aktivy glyoxalázy I, což je enzym detoxifikující prekurzory AGEs methylglyoxal a glyoxal. RAGE hraje roli v patogenezi řady onemocnění a jejich komplikací, jako je diabetes mellitus, ateroskleróza, Alzheimerova choroba, revmatoidní artritida, zánětlivá onemocnění či metastazování nádorů.

 

Fyziologická a patologická role reaktivních forem kyslíku a dusíku, význam v patogenezi onemocnění

Hovoříme-li o oxidačním stresu, je v jeho definici kromě nerovnováhy mezi oxidanty a antioxidanty ve prospěch oxidantů třeba zdůraznit následné poškození organismu, protože oxidanty, tj. volné radikály a další reaktivní formy kyslíku a dusíku, mají řadu významných biologických funkcí v zánětlivé odpovědi, v metabolismu xenobiotik, v regulaci cévního tonu nebo druzí posli v signální transdukci (Tab. 1).

Naopak patologické působení radikálů a produktů radikálových reakcí zahrnuje komplexní poškození biologických struktur, signalizace poškození přes receptory s následným spuštěním řady kaskádovitých reakcí dle buněčného typu - prozánětlivé odpovědi, buněčné proliferace či apoptózy a ovlivnění dalších struktur vzniklými chemickými látkami. Oxidační stres tak hraje roli a spolupůsobí v patogenezi řady onemocnění a jejich komplikací, od onemocnění zánětlivých (sepse, chronická zánětlivá onemocnění), přes onemocnění kardiovaskulární (hypertenze, ateroskleróza, ichemie-reperfuze), přes diabetes mellitus a jeho komplikace, poškození ledvin a jeho následky, onemocnění neurodegenerativní (Alzheimerova choroba, roztroušená skleróza), nádorová onemocnění a jejich léčba či těhotenství a především patologické stavy v těhotenství (preeklampsie) (Tab. 1).

 

Tabulka 1. Význam reaktivních forem kyslíku a dusíku

Fyziologická role	Patologická role při oxidačním stresu
Zánětlivá reakce    Respirační vzplanutí fagocytů	Poškození biologických struktur     lipoperoxidace    glykoxidace    modifikace proteinů    modifikace DNA
Signální transdukce  Intracelulární signalizace - úloha druhého   posla
Monooxygenázové reakce    hydroxylace streoidů,    metabolismus xenobiotik	Význam v patogenezi řady onemocnění a jejich komplikací    Ateroskleróza    diabetes mellitus         nemoci ledvin     nádorová onemocnění    zánětlivá onemocnění    neurodegenerativní onemocnění    a další
Regulace cévního tonu    NO – relaxace, superoxid - konstrikce
Mediátory    NO - neuromodulátor v CNS

 

 

Laboratorní diagnostika

Stanovení volných radikálů v tělních tekutinách je vzhledem k jejich krátkému biologickému poločasu problematické. Vhodnější je proto měření koncentrace látek vzniklých vlivem oxidačního stresu nebo antioxidační ochrany. Stanovení je možné provádět v různém biologickém materiálu - séru, plazmě, moči, plné krvi, krevních elementech či vydechovaném vzduchu. Laboratorní diagnostika musí být vždy komplexní a často již výsledky běžných vyšetření mohou ukazovat na pravděpodobnou přítomnost oxidačního stresu. Laboratorní výsledky je nutno hodnotit individuálně v souvislosti s klinickým stavem nemocného. Laboratorní vyšetřování parametrů oxidačního stresu a antioxidantů se využívá zejména v rámci výzkumu příčiny a průběhu onemocnění, nikoli v běžné klinické praxi.

Přímá měření zahrnují stanovení vznikajících radikálů a reaktivních forem kyslíku a dusíku. Patří mezi ně především pulzní radiolýza, elektronová spinová rezonance a chemiluminiscence. Tyto metody se využívají zejména v základním výzkumu a nejsou běžně dostupné.                        

Nepřímá měření stanovují látky vznikající při radikálových reakcích, antioxidanty a autoprotilátky. Je také možné stanovit degradační produkty vznikajícího NO (nitrity, nitráty) či imunochemické stanovení (ELISA) enzymů generujících radikály – myeloperoxidázy či xanthinoxidázy.

Z hlediska látek vznikajících při radikálových reakcích (klasické markery oxidačního stresu) je možno jich stanovit celou řadu. Lipoperoxidaci charakterizuje např. malondialdehyd, oxidované LDL, nebo 8-isoprostan jako metabolit kyseliny arachidonové. Poškození proteinů můžeme ozřejmit měřením modifikovaných aminokyselin či jako AOPP, pro přispění sacharidů jsou pak typické AGEs nebo sRAGE (solubilní receptor pro AGEs). 8-hydroxy 2´deoxyguanosin je markerem poškození DNA. Metodicky se nejvíce uplatňuje ELISA, vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) a plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (GC/MS).

Dostupnější je stanovení vybraných antioxidantů - vitamin A a E (HPLC), stopové prvky, především zinek a selen (atomová absorpční spektrometrie), ale je možné stanovit také aktivitu antioxidačních enzymů či celkovou antioxidační kapacitu spektrofotometricky.

Další možností, rovněž spíše výzkumnou, je stanovení autoprotilátek, jejichž tvorba reaguje na modifikaci biologických struktur. V průběhu oxidačního stresu vznikají látky, které jsou imunogenní a organismus proti nim vytváří protilátky. Uplatňuje se tak další systém (imunitní systém), který může být vlivem oxidačního stresu narušen. Příkladem jsou protilátky proti oxidovanému LDL stanovované metodou ELISA.

Molekulárně biologické metody mohou určit genetickou predispozici ke tkáňovému poškození (např. polymorfismu genů pro antioxidační enzymy či enzymy degradující reaktivní karbonylové sloučeniny nebo genů pro receptory zprostředkující tkáňové poškození, např. RAGE – receptor pro AGEs).

 

Základní laboratorní vyšetření mohou ukázat různé patologie a signalizovat tak pravděpodobnou přítomnost oxidačního stresu. Rutinně je vyšetřována funkce ledvin a je známo, že oxidační stres je přítomen u pacientů se sníženou funkcí ledvin. Oxidační stres také významně souvisí se zánětlivou reakcí (ukazatelé např. C-reaktivní protein, orosomukoid) a procesem aterogeneze (modifikované LDL částice, myeloperoxidáza). Vyšší glykémie či hladina lipidů znamenají více substrátů pro tvorbu reaktivních karbonylových sloučenin. Na druhou stranu albumin a bilirubin (vyšší hodnoty bez postižení jater, např. Gilbertův syndrom), ale i glukóza působí antioxidačně. V erytrocytech je obsažen další významný antioxidant, glutathion, a při anémii tedy předpokládáme jeho celkové snížení.

Vybraná vyšetření pro ozřejmení oxidačního stresu jsou shrnuta v Tab. 3. Uvedené metody popisují jednotlivé reakce či procesy které v lidském organismu probíhají při oxidačním stresu. Jednotlivé analyty je třeba dávat do vzájemných vztahů a následně vyhodnocovat stupeň poškození organismu oxidačním stresem..

 

Tabulka 3. Vybraná vyšetření pro ozřejmení oxidačního stresu

Skupina vyšetření	Parametry
Přímá měření – stanovení vznikajících radikálů	Pulzní radiolýza, elektronová spinová rezonance, chemiluminiscence
Markery poškození oxidačním stresem	Lipoperoxidace – malondialdehyd, konjugované dieny, oxLDL, ALEs, 8-izoprostan Oxidace aminokyselin a proteinů – modifikované aminokyseliny (3-chlorotyrosin, 3-nitrotyrosin, dichlorotyrosin), AOPP Glykoxidace – AGEs, sRAGE Oxidační poškození DNA - 8-hydroxy 2´deoxyguanosin Degradační produkty vznikajícího NO (nitrity, nitráty) Enzymy generující radikály – xanthinoxidáza, myeloperoxidáza
Antioxidanty	Vitaminy A a E stopové prvky – Se, Zn albumin, bilirubin glukóza, kyselina močová antioxidační enzymy – superoxiddismutáza, glutathionperoxidáza, kataláza celková antioxidační kapacita
Autoprotilátky	Protilátky proti oxidovanému LDL
Molekulárně biologické metody	polymorfismus genů pro antioxidační enzymy a enzymy degradující reaktivní karbonylové sloučeniny nebo genů pro receptory zprostředkující tkáňové poškození, např. RAGE – receptor pro AGEs
Základní laboratorní vyšetření	Funkce ledvin –odhad glomerulární filtrace, sérový kreatinin C-reaktivní protein, albumin, glykémie, HbA1c, mikroalbuminurie, lipidy, bilirubin, krevní obraz

 

 

Terapeutické možnosti ovlivnění

            V současné době neexistují jednotná doporučení pro terapii oxidačního stresu. V řadě studiích byl ovšem ukázán pozitivní efekt podávání některých antioxidantů a také je známo, že některé léky, které jsou často podávány v jiné indikaci, mají antioxidační vlastnosti (inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu, blokátory AT₁ receptoru pro angiotenzin II či statiny). Při terapii musíme vždy myslet na fyziologickou rovnováhu mezi oxidanty antioxidanty a možné nežádoucí účinky, např. že některé antixodanty mohou mít také prooxidační účinky. Podávání antioxidantů není v současné době součástí doporučení k léčbě či prevenci onemocnění vyjma několika vzácných onemocnění. Nevhodné podávání antioxidantů (např. beta-karoten u kuřáků) může naopak vést i k poškození organismu. Antioxidanty se podávají jako podpůrná či doplňková terapie nikoliv kauzální léčba.

 

Literatura

Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Methods Enzymol 1990, 186, 1-85.

Himmelfarb J., Stenvinkel P., Ikizler T.A., Hakim R.M. The elephant in uremia: Oxidative stress as a unifying concept of cardiovascular disease in uremia. Kidney Int 2002, 62, 1524-1538.

Kalousová M., Zima T. Nové biomarkery v nefrologii. In: Pokroky v oboru nefrologie. 2008, 2, 2, 42-53.

Sies H. Oxidants and antioxidants. Exp Physiol 1997, 82, 291-295.

Štípek S. Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Grada Publishing Praha 2000. 314 s.

Zima T., Kalousová M. Reaktivní formy kyslíku a dusíku a antioxidační systémy. In: Zima T. Laboratorní diagnostika. 2.doplněné a přepracované vydání. Galén Karolinum Praha 2007, 906 s., s. 339-347.