2021
In vivo fluorescent tracking system of coupled transcription-translation
VESELÁ, Ludmila; Hassan ZAFAR; Sylva BRABENCOVÁ; Lucie SLÁMOVÁ; Gabriel DEMO et al.Základní údaje
Originální název
In vivo fluorescent tracking system of coupled transcription-translation
Název česky
In vivo fluorescenční sledovací systém sprazene transkripce-translace
Autoři
Vydání
XXVI. Annual Congress of Czech and Slovak Societies for Biochemistry and Molecular Biology, 2021
Další údaje
Jazyk
angličtina
Typ výsledku
Konferenční abstrakt
Obor
10608 Biochemistry and molecular biology
Stát vydavatele
Česká republika
Utajení
není předmětem státního či obchodního tajemství
Odkazy
Označené pro přenos do RIV
Ano
Kód RIV
RIV/00216224:14740/21:00122988
Organizační jednotka
Středoevropský technologický institut
ISBN
978-80-907779-1-0
Klíčová slova česky
transkripce translace fluorescence mikroskopie
Klíčová slova anglicky
transcription translation fluorescence microscopy
Štítky
Změněno: 26. 11. 2021 09:52, Mgr. Pavla Foltynová, Ph.D.
V originále
The bacterial cellular space is not divided into sections by a membrane thus the ribosomes could initiate translation on nascent mRNA which is still transcribed by RNA polymerase (RNAP). The occurrence of coupled transcription-translation (CTT) in bacteria is broadly accepted due to in vitro structures describing CTT complexes. However, any in vivo evidence of CTTs in bacterial cells using live-cell imaging approaches is missing. Recent in vivo single-particle fluorescent studies focused on spatial organization of nucleoid in E. coli do investigate the localization of RNAP and ribosomes separately in a cell. Moreover, almost all fluorescently labelled ribosomal proteins in these studies, play a critical role in CTT (according to in vitro structures), making it impossible to track fully assembled CTTs. Here, we present a design of in vivo fluorescent system to monitor CTT in E. coli. For labelling, beta prime protein from RNAP, ribosomal proteins S20 and S16 from 30S small ribosomal subunit, and L9 and L17 from 50S large ribosomal subunit were selected as they do not interfere with CTT. Several sets of bacterial strains have been prepared with fused target proteins and fluorescent proteins (mCerulean, mVenus, mRFP1) by lamba-Red recombination in their endogenous loci. Confocal microscopy in combination with high-resolution fluorescence microscopy is used to look at the dynamics of this complex system in single cell. Due to CTT involvement in stress response, migration of ribosomal subunits and RNAP together with CTT occurrence is monitored in different stress conditions (heat- or cold-shock, oxidative stress, etc.)
Česky
Bakteriální buněčný prostor není rozdělen na sekce membránou, takže ribozomy mohou iniciovat translaci na nascentní mRNA, která je stále transkribována RNA polymerázou (RNAP). Výskyt sdružené transkripce-translace (CTT) u bakterií je široce přijímán díky in vitro strukturám popisujícím CTT komplexy. Chybí však jakýkoli in vivo důkaz CTT v bakteriálních buňkách využívajících přístupy zobrazování živých buněk. Nedávné in vivo jednočásticové fluorescenční studie zaměřené na prostorovou organizaci nukleoidů v E. coli zkoumají lokalizaci RNAP a ribozomů odděleně v buňce. Navíc téměř všechny fluorescenčně značené ribozomální proteiny v těchto studiích hrají kritickou roli v CTT (podle struktur in vitro), což znemožňuje sledovat plně sestavené CTT. Zde představujeme návrh in vivo fluorescenčního systému pro monitorování CTT v E. coli. Pro značení byly vybrány beta prime protein z RNAP, ribozomální proteiny S20 a S16 z malé ribozomální podjednotky 30S a L9 a L17 z velké ribozomální podjednotky 50S, protože neinterferují s CTT. Několik sad bakteriálních kmenů bylo připraveno s fúzovanými cílovými proteiny a fluorescenčními proteiny (mCerulean, mVenus, mRFP1) rekombinací lamba-Red v jejich endogenních lokusech. Konfokální mikroskopie v kombinaci s fluorescenční mikroskopií s vysokým rozlišením se bude používat k pozorování dynamiky tohoto komplexního systému v jedné buňce. Díky zapojení CTT do stresové reakce bude sledována migrace ribozomálních podjednotek a RNAP spolu s výskytem CTT v různých stresových podmínkách (tepelný nebo studený šok, oxidační stres atd.)
Návaznosti
| LL2008, projekt VaV |
|