Další formáty:
BibTeX
LaTeX
RIS
@inproceedings{407309, author = {Kuňák, Michal and Kučera, Igor}, address = {Praha}, keywords = {Pseudoazurin Kinetics Paracoccus enzyme denitrification}, location = {Praha}, publisher = {Ceska spolecnost chemicka}, title = {Využití rekombinantního pseudoazurinu jako donoru elektronů nitritreduktasy s následným měřením dvouenzymové kinetiky}, year = {2002} }
TY - JOUR ID - 407309 AU - Kuňák, Michal - Kučera, Igor PY - 2002 TI - Využití rekombinantního pseudoazurinu jako donoru elektronů nitritreduktasy s následným měřením dvouenzymové kinetiky PB - Ceska spolecnost chemicka CY - Praha KW - Pseudoazurin Kinetics Paracoccus enzyme denitrification N2 - Klíčovým krokem denitrifikace je konverze iontového dusitanu na plynný oxid dusnatý. U bakterie Paracoccus denitrificans ji katalyzuje enzym nitritreduktasa, typu cytochromu cd1. Nitritreduktasa však neinteraguje s membránovými komponentami přímo, ale vyžaduje přítomnost proteinového mediátoru, cytochromu c550, nebo pseudoazurinu (1). Vzhledem k vysoké koncentraci nitritreduktasy byl tento protein izolován z přirozeného zdroje Paracoccus denitroficans. Naproti tomu pseudoazurin se jak u mutantního kmene deficientního v cytochromu c550, tak i u divokého kmene vyskytuje ve velmi nízké koncentraci. Proto byla v případě tohoto proteinu využita rekombinantní technologie. Na základě známé sekvence pseudoazurinu byly vytvořeny primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR), které obsahují rozpoznávací místa pro vhodné restrikční endonukleasy Bam H1 a EcoR1. S pomocí těchto primerů, a s použitím chromozomální DNA bakterie Paracoccus denitrificans jako templátu byla v PCR, optimalizované pro syntézu dlouhých řetězců, amplifikována cDNA genu kódujícího pseudoazurin. Takto připravená DNA byla spojena s oligohistidinovou doménou a klonována do bakteriálního expresního systému. Bakteriální expresí byl vytvořen rekombinantní pseudoazurin, který byl následně purifikován s použitím chromatografie na matrici s vázanými ionty kovů. Schopnost transportu elektronů rekombinantně připraveného proteinu byla nejprve porovnána s aktivitou odpovídajícího proteinu vyizolovaného z divokého kmene Paracoccus denitrificans. Systém přenosu elektronů mezi dvěma typy respiračního řetězce byl charakterizován experimentálně na základě navrženého kinetického modelu. Nitritreduktasa byla vyizolována z divokého kmene Paracoccus denitrificans. ER -
KUŇÁK, Michal a Igor KUČERA. \textit{Využití rekombinantního pseudoazurinu jako donoru elektronů nitritreduktasy s následným měřením dvouenzymové kinetiky}. Praha: Ceska spolecnost chemicka, 2002.
|