2008
Development of electrophoretically mediated microanalysis method for the kinetics study of flavin-containing monooxygenase in a partially filled capillary
HAI, Xin; Jiří KONEČNÝ; Marta ZEISBERGEROVÁ; Erwin ADAMS; Jos HOOGMARTENS et al.Základní údaje
Originální název
Development of electrophoretically mediated microanalysis method for the kinetics study of flavin-containing monooxygenase in a partially filled capillary
Název česky
Vývoj elektrokineticky zprostředkované mikroanalytické metody pro kinetickou studii flavin obsahující monooxygenasy v částečně plněné kapiláře
Autoři
HAI, Xin; Jiří KONEČNÝ; Marta ZEISBERGEROVÁ; Erwin ADAMS; Jos HOOGMARTENS a Ann VAN SCHEPDAEL
Vydání
Electrophoresis, Germany, WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, 2008, 0173-0835
Další údaje
Jazyk
angličtina
Typ výsledku
Článek v odborném periodiku
Obor
10600 1.6 Biological sciences
Stát vydavatele
Belgie
Utajení
není předmětem státního či obchodního tajemství
Impakt faktor
Impact factor: 3.509
Označené pro přenos do RIV
Ano
Kód RIV
RIV/00216224:14310/08:00034008
Organizační jednotka
Přírodovědecká fakulta
UT WoS
Klíčová slova anglicky
Clozapine EMMA flavin containing monooxygenase kinetics
Příznaky
Mezinárodní význam, Recenzováno
Změněno: 9. 4. 2010 10:04, Mgr. Marta Pelcová, Ph.D.
V originále
An electrophoretically mediated microanalysis method with a partial filling technique was developed for flavin-containing monooxygenase, form 3 (FMO3). The in-line enzymatic reaction was performed in 100 mM phosphate reaction buffer (pH 7.4) whereas 150 mM phosphate buffer (pH 3.3) was used as a background electrolyte. A long plug of cofactor NADPH dissolved in reaction buffer was hydrodynamically injected into a fused-silica capillary, followed by enzyme and substrate solution. The reaction was initiated at 37C in the thermostated part of the cartridge by the application of 9 kV for 0.9 min. The voltage was turned off to increase the product amount (zero-potential amplification) and again turned on at a constant voltage of 10 kV to elute all the components. Direct detection was performed at 191 nm. The developed electrophoretically mediated microanalysis method was applied for the kinetics study of FMO3 using clozapine as a substrate probe. A Michaelis-Menten constant (Km) of 410.3 uM was estimated from the corrected peak area of the product, clozapine N-oxide. The calculated value of the maximum reaction velocity (Vmax) was found to be 1.86 nmol/nmol enzyme/min. The acquired FMO3 kinetic parameters are in accordance with the published literature data.
Česky
byla vyvinuta metoda elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy s využitím částečného plnění kapiláry pro flavin obsahující monooxygenasu, forma 3 (FMO3). In-line enzymatická reakce byla provedena ve 100 mM fosfátovém pufru (pH 7,4) zatímco 150 mM fosfátový pufr (pH 3,3) byl použit jako základní elektrolyt. Dlouhá zóna kofaktoru NADPH rozpuštěného v rekčním pufru, byla nadávkována hydrodynamicky do křemenné kapiláry a následována zónou enzymu a substrátu. Reakce byla iniciována v teplotně kontrolované částikapiláry při 37C aplikací napětí 9kV po 0,9 min. Napětí bylo vypnuto, aby vzrostlo množství produktu (tzv. zero potential amplification) a následně opět zapnuto konstatní napětí 10 kV pro separaci všech látek, které byly detekovány při vlnové délce 191 nm. Vyvinutá metoda elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy byla aplikována na kinetiskou studii FMO3 s využití clozapinu jako substrátu. Konstanta Michaeli-Mentenové hodnoty 410,3 uM byla vypočtena z korigovaných ploch píku produktu clozapinu N-oxidu. Hodnota maximální rychlosti (Vmax.) byla vypočtena 1,86 nmol/nmol enzymu/min. Kinetické parametry FMO3 jsou ve shodě s publikovanými daty.
Návaznosti
| LC06023, projekt VaV |
| ||
| MSM0021622413, záměr |
|