2011
Random mutagenesis of lectins and high-throughput screening of mutant libraries
MRÁZKOVÁ, Jana; Martina POKORNÁ a Michaela WIMMEROVÁZákladní údaje
Originální název
Random mutagenesis of lectins and high-throughput screening of mutant libraries
Název česky
Náhodná mutageneze lektinů a high-throughput screening knihoven mutantů
Autoři
MRÁZKOVÁ, Jana; Martina POKORNÁ a Michaela WIMMEROVÁ
Vydání
36th FEBS Congress, 2011
Další údaje
Jazyk
angličtina
Typ výsledku
Konferenční abstrakt
Obor
10600 1.6 Biological sciences
Stát vydavatele
Itálie
Utajení
není předmětem státního či obchodního tajemství
Impakt faktor
Impact factor: 3.790
Označené pro přenos do RIV
Ano
Kód RIV
RIV/00216224:14740/11:00049899
Organizační jednotka
Středoevropský technologický institut
ISSN
UT WoS
Klíčová slova česky
lektin; PA-IIL; náhodná mutageneze; high-throughput screening, cíleně-náhodná mutageneze
Klíčová slova anglicky
lectin; PA-IIL; random mutagenesis; high-throughput screening; targeted-random mutagenesis
Štítky
Změněno: 4. 4. 2012 10:39, Mgr. Nikola Kostlánová, Ph.D.
V originále
Random mutagenesis is often used in protein engineering for producing proteins with altered or improved properties. Random mutagenesis includes a lot of methods used to create diverse mutant libraries and to screen these libraries. In our work two methodical directions are being applied. Error-prone PCR is based on error-prone DNA polymerase which introduces nucleotide changes during extension of amplified DNA. Mutational reaction conditions can support even higher number of random substitutions. Targeted-random mutagenesis is being performed by mixture of special oligonucleotide primers carried random base substitutions on selected site(s). An effective high-throughput screening must be employed while large mutant libraries are produced by random mutagenesis techniques. Currently, methods of high-throughput screening have been optimized to maximize of automation of this process. Several approaches simplifying the protein mixture for binding studies were applied. A signal sequence for expression to periplasm was added to gene of our interest and cultivation of cell culture in the presence of glycine for protein leaking out has been performed. An oligohistidine anchor was added to N terminus of proteins of our interest and chelating chromatography in mini spin columns has been tested. Due to good thermostability of target proteins, temperature clean-up of cell lysate has been optimized. LecB, the gene coding PA-IIL lectin from bacterium P. aeruginosa, was chosen as a primary target gene to be modified via random mutagenesis. This soluble protein is well-characterized and it shows very high affinity for L-fucose but it can bind several monosaccharides with similar stereochemistry [1]. The aim of this work is to produce mutants with interestedly modified specificity and/or affinity for monosaccharides. The mutated lectins with improved properties could be further used in biotechnology and for bioanalytical purposes.
Česky
Náhodná mutageneze je často využívána v proteinovém inženýrství k produkci proteinů s pozměněnými nebo vylepšenými vlastnostmi. Náhodná mutageneze zahrnuje mnoho metod, které jsou používány k produkci rozmanitých knihoven mutantů a ke screeningu těchtno knihoven. V této práci jsou aplikovány dva metodické směry. Error-prone PCR je založena na DNA polymerase náchylné k chybám, která zavádí nukleotidové změny během prodlužování amplifikované DNA. Mutační reakční podmínky mohou napomáhat vyššímu počtu náhodných substitucí. Cíleně-náhodná mutageneze je prováděna pomocí směsi speciálních oligonukleotidových primerů. které nesou náhodné substituce bazí na vybraném místě. Efektivní high-throughput screening je nezbytný, protože technikami náhodné mutageneze jsou produkovány rozsáhlé knihovny mutantů. V současné době jsou optimalizovány metody high-throughput screeningu, aby byla maximalizována automatizace tohoto procesu. Bylo aplikováno několik postupů ke zjednodušení směsi proteinů pro vazebné studie. Ke genu zájmu byla přidána signální sekvence pro expresi do periplasmy a byla provedena kultivace buněčné kultury v přítomnosti glycinu pro sekreci do media. Na N-konec proteinů byla přidána oligohistidinová kotva a byla testována chelatační chromatografie v minicentrifugačních kolonkách. Díky dobré termostabilitě cílových proteinů bylo možno zoptimalizovat teplotní přečištění hrubých buněčných lyzátů. LecB, gen kódující PA-IIL lektin z bakterie P. aeruginosa byl vybrán jako primární cílový gen pro modifikaci pomocí náhodné mutageneze. Tento rozpustný protein je velmi dobře charakterizovaný a vykazuje vysokou afinitu pro L-fukosu, ale dokáže také vázat několik monosacharidů s podobnou stereochemií. Cílem této práce je připravit mutanty se zajímavě pozměněnou specifitou a/nebo afinitou pro monosacharidy. Mutované lektiny s vylepšenými vlastnostmi mohou být později využity v biotechnologii a pro bioanalytické účely.
Návaznosti
| GA303/09/1168, projekt VaV |
| ||
| GD301/09/H004, projekt VaV |
| ||
| LC06030, projekt VaV |
| ||
| MSM0021622413, záměr |
|