SVOBODA, Marek, Jitka PACHOLÍKOVÁ, Pavel FABIAN a Dana DVOŘÁKOVÁ. Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích. In Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004. 1. vyd. Brno: Masarykův onkologický ústav v Brně, 2004. s. 55. ISBN 80-86793-01-X.
Další formáty:   BibTeX LaTeX RIS
Základní údaje
Originální název Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích
Název česky Izolace RNA pro účely RT-PCR, Real-Time PCR a DNA čipů z tkání fixovaných ve formalínu a archivovaných v parafinových bločcích
Název anglicky --
Autoři SVOBODA, Marek (203 Česká republika, garant), Jitka PACHOLÍKOVÁ (203 Česká republika), Pavel FABIAN (203 Česká republika) a Dana DVOŘÁKOVÁ (203 Česká republika).
Vydání 1. vyd. Brno, Edukační sborník - XXVIII. Brněnských onkologických dnů a XVIII. Konference pro sestry a laboranty. 26.-28. května 2004, s. 55-55, 2004.
Nakladatel Masarykův onkologický ústav v Brně
Další údaje
Originální jazyk čeština
Typ výsledku Stať ve sborníku
Obor 30200 3.2 Clinical medicine
Stát vydavatele Česká republika
Utajení není předmětem státního či obchodního tajemství
Organizační jednotka Lékařská fakulta
ISBN 80-86793-01-X
Klíčová slova anglicky Izolace RNA; Real-Time PCR; formalin fixed tissue; lymphoma
Štítky formalin fixed tissue, Izolace RNA, Lymphoma, real-time PCR
Příznaky Recenzováno
Změnil Změnil: prof. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., učo 19402. Změněno: 14. 10. 2007 01:03.
Anotace
Úvod Tkáně fixované ve formalínu a archivované v parafinových bločcích, jsou nejdostupnějším materiálem pro retrospektivní klinické studie. Význam tohoto zdroje narůstá v souvislosti s potřebou validace nově determinovaných diagnostických a prognostických markerů, jejichž výpovědní hodnotou je míra genové exprese. Kvantitativní analýza genové exprese je v současnosti nejčastěji prováděna pomocí Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) a DNA čipů. Tyto metody vyžadují dostatečné množství kvalitní RNA, což v případě jednoho DNA čipu znamená 10-50 ěg celkové RNA. Problém izolace RNA z tkání archivovaných v parafinu spočívá zejména v její nepoužitelnosti pro vysoký stupeň degradace. K ní dochází především v mezidobí od získání tkáně do završení její fixace. Pro tento účel nevhodná formalínová fixace způsobuje navíc tvorbu tzv. "cross-linking" vazeb mezi nukleovými kyselinami a proteiny a kovalentně modifikuje RNA. Náročnost izolace kvalitní RNA z parafinových bločků za účelem kvantitativního hodnocení genové exprese dokresluje i to, že dosud byla ve světové literatuře publikována pouze jediná práce popisující takový postup. Výsledky V naší práci prezentujeme vlastní způsob izolace RNA, který jsme úspěšně vyzkoušeli u 40 vzorků tkání fixovaných ve formalinu a archivovaných v parafinových bločcích. Stáří bločků se pohybovalo v rozmezí 1 až 29 let, RNA získaná z cca 8 řezů o šířce 8 ěm dosahovala po nezbytném ošetření DNasou I průměrné koncentrace 330 ng/ěl a indexu absorbance A260/280 1,68+/-0,16. Elektroforéza prokázala ve všech případech určitý stupeň degradace RNA, nicméně byla vždy zachována zřetelná detekce 28S i 18S rRNA. Vyizolovaná RNA byla velmi úspěšně použita k RT-PCR a QRT-PCR. Výsledky QRT-PCR kvantifikující expresi sledovaného genu byly ve shodě s výsledky semikvantitativního imunohistochemického hodnocení korespondujícího proteinu (t-test: p = 0,003). Před izolací RNA jsme ustoupili od deparafinizace, která neovlivnila výtěžnost, nicméně snižovala kvalitu RNA. Lyzační roztok byl založen na Proteinase K, obsahoval inhibitory RNAsy a doba lyzace činila 12 hodin při teplotě 60C. K samotné izolaci jsme použili v modifikovaném postupu Trizol. Závěr Vlastním protokolem jsme provedli úspěšnou izolaci RNA z tkání fixovaných formalínem a archivovaných v parafinových bločcích. RNA dosahovala dostatečného množství a kvality k použití pro RT-PCR a QRT-PCR. Zda ji bude možné využít i pro DNA čipy testujeme v současnosti.
Anotace anglicky
This abstract exists only in Czech language.
VytisknoutZobrazeno: 24. 11. 2020 16:17