Kometová analýza jako nástroj pro stanovení integrity DNA spermií. Porovnání různých protokolů.

MATEJOVIČOVÁ, Milena; Michaela KRÁLÍKOVÁ; Jitka MELOUNOVÁ; Jana ŽÁKOVÁ a Igor CRHA. Kometová analýza jako nástroj pro stanovení integrity DNA spermií. Porovnání různých protokolů. 2009.

Základní údaje

Originální název

Kometová analýza jako nástroj pro stanovení integrity DNA spermií. Porovnání různých protokolů.

Název česky

Kometová analýza jako nástroj pro stanovení integrity DNA spermií. Porovnání různých protokolů.

Název anglicky

Comet assay as a tool for assesment sperm DNA integrity. Comparison of different protocols.

Autoři

MATEJOVIČOVÁ, Milena; Michaela KRÁLÍKOVÁ ORCID; Jitka MELOUNOVÁ; Jana ŽÁKOVÁ a Igor CRHA

Vydání

2009

---

Další údaje

Typ výsledku

Konferenční abstrakt

Utajení

není předmětem státního či obchodního tajemství

Odkazy

URL

Označené pro přenos do RIV

Ne

Organizační jednotka

Lékařská fakulta

Klíčová slova česky

kometová, analýza, spermie, chromatin, DNA

Klíčová slova anglicky

comet, analysis, sperm, spermatozoa, chromatin, DNA

---

Anotace

V originále

Kometová analýza je metoda, jejíž pomocí lze stanovit fragmentaci DNA v jednotlivých buňkách. Buňky s poškozenou DNA mají po elektroforéze tvar komety: kruhovitou „hlavu“ reprezentující nepoškozenou DNA a protáhlý „ohon“, jehož délka a intenzita závisí na míře poškození DNA a velikosti fragmentů. Specifika aplikace kometové analýzy na spermie spočívají v odlišné organizaci chromatinu spermií. Ten je, na rozdíl od somatických buněk, asi šeskrát kompaktnější a obsahuje díky protaminům velké množství disulfidových vazeb. Proto je při sledování poškození DNA spermií rozhodujícím krokem efektivní lýza buněčných struktur a denaturace DNA bez zvyšování míry fragmentace. V této práci jsme sledovali kometovou analýzou bazální poškození DNA ve spermiích mužů,podstupujících vyšetření ejakulátu v Centru asistované reprodukce FN Brno. V několika experimetech bylo základní poškození DNA zmrazených vzorků porovnáno s poškozením DNA v čerstvě odebraných vzorcích spermatu, které byly analyzovány v den odběru. Nepozorovali jsme rozdíly v poškození DNA. Dále jsme porovnávali 2 různé metody buněčné lýzy. Protokol A zahrnoval proteolýzu pomocí proteinázy K v průběhu lýzy a protokol B využíval k destrukci membrán a chromatinových struktur jako hlavní detergent dijodosalicylát lithný. V obou protokolech byl navíc použit dithiothreitol, sloužící k redukci disulfidových vazeb. Jeho užití zároveň s proteinázou K v protokolu A však zvyšovalo míru poškození DNA spermií. Nejméně poškozená DNA byla pozorována při vyšetřeních, při kterých byl aplikován protokol B.

Česky

Kometová analýza je metoda, jejíž pomocí lze stanovit fragmentaci DNA v jednotlivých buňkách. Buňky s poškozenou DNA mají po elektroforéze tvar komety: kruhovitou „hlavu“ reprezentující nepoškozenou DNA a protáhlý „ohon“, jehož délka a intenzita závisí na míře poškození DNA a velikosti fragmentů. Specifika aplikace kometové analýzy na spermie spočívají v odlišné organizaci chromatinu spermií. Ten je, na rozdíl od somatických buněk, asi šeskrát kompaktnější a obsahuje díky protaminům velké množství disulfidových vazeb. Proto je při sledování poškození DNA spermií rozhodujícím krokem efektivní lýza buněčných struktur a denaturace DNA bez zvyšování míry fragmentace. V této práci jsme sledovali kometovou analýzou bazální poškození DNA ve spermiích mužů,podstupujících vyšetření ejakulátu v Centru asistované reprodukce FN Brno. V několika experimetech bylo základní poškození DNA zmrazených vzorků porovnáno s poškozením DNA v čerstvě odebraných vzorcích spermatu, které byly analyzovány v den odběru. Nepozorovali jsme rozdíly v poškození DNA. Dále jsme porovnávali 2 různé metody buněčné lýzy. Protokol A zahrnoval proteolýzu pomocí proteinázy K v průběhu lýzy a protokol B využíval k destrukci membrán a chromatinových struktur jako hlavní detergent dijodosalicylát lithný. V obou protokolech byl navíc použit dithiothreitol, sloužící k redukci disulfidových vazeb. Jeho užití zároveň s proteinázou K v protokolu A však zvyšovalo míru poškození DNA spermií. Nejméně poškozená DNA byla pozorována při vyšetřeních, při kterých byl aplikován protokol B.

Anglicky

Comet assay is a method for measuring the amount of DNA fragmentation in the individual cells. Cells containing damaged DNA have appearance of a comet: round „head“ representing unfragmented DNA and elongated „tail“, intensity and lenght of which depends on both, the extent of DNA fragmentation and fragment size. Specificity of the comet assay application on sperm consists in particullar organization of sperm chromatine, which is 6 fold more compact than in somatic cells and it contains a lot of disulfide bonds in protamines. In the present work, we studied basal DNA damage in sperms collected from subjects undergoing semen analysis in the Assisted Reproduction Center. DNA damage of frozen sperm samples was compared with level of DNA damage in fresh samples analyzed during a day of collection. We have not found a differences in DNA damage between fresh and frozen material. Further, we have compared 2 different methods of cell lysis. Protocol A included proteinase K digestion during lysis and protocol B used lithium diodosalicylate as a main detergent for cell membrane and chromatine protein core destruction. In both protocols, dithiothreitol (DTT) was used for disulfide bonds reduction. However, in the protocol A with proteinase K, we have found higher level of DNA damage when using DTT than without this agent. The least damaged DNA was observed in assays when using the protocol B.