Reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species, ROS) zahrnují skupinu volných radikálů (např. superoxidový, hydroxidový, peroxidový), které hrají klíčovou roli ve funkci živých systémů1. ROS figurují přirozeně jako signální a regulační molekuly v mnoha buněčných procesech, ale mohou také vznikat jako vedlejší produkt energetického metabolismu buněk, či důsledkem působení externích vlivů (např. infekce, nemoc, stárnutí, apod.)2. Volné radikály, které uniknou obranným mechanizmům buňky pak mohou poškozovat jiné důležité molekuly, jako DNA, proteiny či lipidy. Tyto veskrze oxidační procesy jsou pak souhrnně označovány jako tzv. oxidativní stres. Jeho projevy jsou systematické snižování správné funkce buněk, stárnutí, a popřípadě jejich odumření. Jednou z nejčastěji používaných metodou pro analýzu ROS je jejich reakce se specifickými fluorescenčními próbami (např. dichlorofluorescin diacetát – DCFDA, nebo dihydroethidium – DHE)3. Tyto próby v základním stavu vykazují pouze slabou fluorescenci, avšak po oxidaci příslušným radikálem uvnitř buňky produkují výraznou fluorescenci, kterou je možné detekovat fluorimetricky nebo přímo lokalizovat uvnitř buněk pomocí fluorescenční mikroskopie či průtokové cytometrie. Důležitým nedostatkem těchto metod je ovšem nemožnost odlišit fluorescenci slabě fluoreskující nezreagované próby od reakčního produktu a případných dalších nečistot, což v důsledku komplikuje kvantifikaci výsledných produktů. Jednou z možností jak tento problém řešit, je využít separační metody, které jsou schopné na základě odlišných vlastností próby a produktu tyto dvě komponenty rozlišit. Kapilární elektroforéza (CE) ve spojení s velmi citlivou laserem indukovanou fluorescenční detekcí (CE-LIF) využívá k separaci odlišný náboj a velikost obou produktů. Klíčovými výhodami CE jsou dále malá spotřeba vzorků (v řádech nanolitrů) a reakčních činidel, vysoká separační účinnost, krátká doba analýzy a extrémně nízké limity detekce4. Cílem této práce bude vyvinout metody na bázi kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescenční detekcí pro stanovení volných radikálů v rostlinných tkáních. V prvním případě bude použit DCFDA pro celkovou charakterizaci oxidativního stresu, protože DCFDA je oxidován širokou skupinou volných radikálů, zejména pak hydroxyl, peroxyl a alkoxyl radikály. Následně bude použit DHE pro selektivní detekci superoxidového radikálu. Vyvinuté metody budou následně využity k charakterizaci subcelulárních distribucí ROS v rostlinných tkáních, zejména v mitochondriích a chloroplastech a jejich změn v závislosti na externím stresu. Student se v rámci projektu naučí celou řadu moderních analytických metod jakými jsou mikroskopické metody, isolace a separace organel z rostlinných tkání, kapilární elektroforéza, laserem indukovaná fluorescence a použití fluorescenčních prób.