14-3-3 proteiny náleží do skupiny regulačních proteinů exprimovaných v eukaryotických buňkách. U člověka se nachází sedm izoforem, které mohou vytvářet homo-, nebo hetero-dimery. Takto vytvořené dimerní struktury umožňují vazbu proteinových partnerů a následnou regulaci jejich aktivity. Cílem této diplomové práce bude určit disociační rovnovážnou konstantu homo- a hetero-dimerizace mezi vybranými izoformami 14-3-3 proteinů. To bude zahrnovat purifikaci tří 14-3-3 izoforem, jejich úpravu pro fluorescenční měření a následné FRET fluorescenční měření. Bude rovněž zkoumán vliv externích fyzikálně-chemických faktorů na disociační konstanty. Diplomová práce může být vypracována v českém, slovenském nebo anglickém jazyce. Cíle práce: - Purifikace tří 14-3-3 izoforem, ověření jejich čistoty (SDS-PAGE), struktury (CD) a velikosti (DLS), jejich úprava pro fluorescenční měření a následné fluorescenční měření. - Určení disociační rovnovážné konstanty homo- a hetero-dimerizace mezi vybranými izoformami 14 3 3 proteinů. - Určení vlivu teploty, koncentrace soli a pH na měřené disociační konstanty. Literatura: 1. Yang X.; Lee W. H.; Sobott F.; Papagrigoriou E.; Robinson C. V.; Grossmann J. G.; Sundstrom M.; Doyle D. A.; Elkins J. M. (2006). Structural basis for protein-protein interactions in the 14-3-3 protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 17237–17242 2. Jandova Z.; Trosanova Z.; Weisova V.; Oostenbrink C., Hritz J.(2018) Free energy calculations on the stability of the 14-3-3 protein. BBA - Proteins and Proteomics 1866, 442-450. 3. Sluchanko NN, Uversky VN (2015) Hidden disorder propensity of the N-terminal segment of universal adapter protein 14-3-3 is manifested in its monomeric form: Novel insights into protein dimerization and multifunctionality. Biochim Biophys Acta 1854:492–504 4. Nagy G.; Oostenbrink C.; Hritz, J. (2017) Exploring the Binding Pathways of the 14-3-3 Protein: Structural and Free-Energy Profiles Revealed by Hamiltonian Replica Exchange Molecular Dynamics with Distance Field Distance Restraints. PLoS ONE 12(7), e0180633 5. Hritz J.; Byeon I-J.; Krzysiak T.; Martinez A.; Sklenář V.; Gronenborn A.M. (2014) Dissection of binding between a phosphorylated tyrosine hydroxylase peptide and 14-3-3: a complex story elucidated by NMR. Biophys. J. 107, 2185-2194 6. Wilker EW, Grant RA, Artim SC, Yaffe MB: A Structural Basis for 14-3-3sigma Functional Specificity. J Biol Chem 2005, 280:18891–18898. 7. Chaudhri M, Scarabel M, Aitken A: Mammalian and yeast 14-3-3 isoforms form distinct patterns of dimers in vivo. Biochem Biophys Res Commun 2003, 300:679–685.