3-dimenzionální (3D) buněčné kultury lépe napodobují přirozené buněčné interakce a mikroprostředí ve tkáních nežli tradiční in vitro modely adherentních buněk rostoucích v jednoduché vrstvě. 3D modely tak umožňují spolehlivěji modelovat a predikovat působení chemických látek a farmak na procesy vedoucí k poškození tkání a vzniku chronických onemocnění. Diplomová práce se zaměří primárně na 3D kultivaci lidských jaterních buněk ve formě hepatosferoidů, jednak s využitím systémů statické kultivace, a dále dynamické kultivace v bioreaktorech na principu simulované mikrogravitace.

Cílem práce bude charakterizace vlastností staticky a dynamicky kultivovaných hepatosféroidů pomocí vybraných metod biochemie a molekulární biologie (např. ELISA, Western blotting, (q)RT-PCR, imunobarvení) a optimalizace podmínek kultivace pro plánované využití bioreaktorových kultur hepatosféroidů v toxikologickém výzkumu ke studiu škodlivých účinků vybraných chemických látek.



1) Metody přípravy buněčných sféroidů in vitro – samostatná práce s in vitro kultivací jaterních buněčných linií (např. buňky lidského hepatocelulárního karcinomu HepG2) – rutinní pasážování buněk, jejich 2D kultivace, kryogenní uchování



2) Postup přípravy statických kultur buněčných sféroidů (např. metoda 3D Petri Dish), včetně postupů mikroskopické dokumentace vytvořených sféroidů (automatická akvizice a analýza obrazu), hodnocení velikosti a viability



3) Metody charakterizace vlastností sféroidů – hodnocení vybraných markerů hepatocytární diferenciace pomocí biochemických metod (enzymatické aktivity, produkce albuminu) nebo molekulárně biologických metod, jako (q)RT-PCR, imunobarvení



4) Dynamická kultivace hepatosféroidů v prostředí simulované mikrogravitace

- seznámení se s principem a obsluhou bioreaktorů a postupy dlouhodobé 3D kultivace buněk (založení kultury, výměny a odběry média, odběry vzorků sféroidů)

- charakterizace vlastností dynamicky kultivovaných hepatosféroidů (v závislosti na kultivačních podmínkách, čase, případně po experimentálním zásahu – expozice modelovou chemickou látkou), jejich srovnání se statickými kulturami



5) Souhrn a zhodnocení výsledků, jejich diskuze s aktuální literaturou, zpracování do textu diplomové práce:

- Teoretický úvod práce se zaměřením na charakteristické vlastnosti jaterní tkáně, klíčové procesy pro jaterní toxicitu a chronická neinfekční jaterní onemocnění

- Metody 3D kultivace, s důrazem na dynamické kultivační metody a bioreaktory - Popis použitých metod, získaných výsledků, jejich interpretace a diskuze s aktuální literaturou



Termíny:

Příprava teoretické části průběžně, první verze teoretické části nejpozději říjen 2021, materiál & metody – první verze do konce roku 2021, experimentální činnost, vyhodnocení a interpretace výsledků a jejich zapracování do experimentální části práce nejpozději do poloviny dubna 2022.